專利名稱：：新型阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用鏈霉菌，尤其是鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)制備新型阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備人用抗真菌藥物和農(nóng)藥殺蟲劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：阿扎霉素F(AzalomycinF)類化合物屬于大環(huán)內(nèi)酯化合物，具有抗G+和廣譜抗真菌活性，同時(shí)還對多種農(nóng)業(yè)病蟲害有抑制或殺滅作用。該類化合物的結(jié)構(gòu)有以下共同特點(diǎn)①具有一個(gè)36元不飽和內(nèi)酯環(huán)；②內(nèi)酯環(huán)中含有2個(gè)共軛二烯，其中一個(gè)共軛二烯與內(nèi)酯羰基共軛；③環(huán)中23-位或25-位有丙二酸單?；〈虎艹森h(huán)酯鍵的羥基碳上連有一環(huán)外側(cè)鏈，側(cè)鏈末端含有1個(gè)取代或未取代胍基。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的該類化合物約有7個(gè)，包括AzalomycinsF3a、F4a、F5a(ChandraA.，NairA..AzalomycinFcomplexfromStr印tomyceshygroscopicus，MSU/MN-4-75B[J].J.Antibiotics.1995,48(8):896-898.);2-位去甲基的RS-22A、B、C(UbukataM.，MoritaT.I.，0sadaH.RS-22A，BandC:newmacrolideantibioticsfromStr印tomycesviolaceusnigerII.Physico—chemicalpropertiesandstructureelucidation[J].J.Antibiotics.1995，48(4):293-299.)，2-DemethylazalomycinsF4a、F5a(MukhopadhyayT.，VijayakumarE.K.S.，etal..2_DemethylazalomycinsF4aandF5a，twonewantifungalmetabolitesfromActinomycetesp.HILY-9120362[J]J.Antibiotics.1995,48(11):1350-1352.)，事實(shí)上2-DemethylazalomycinsF4a、F5a與RS_22B、C分別為同一化合物；2-位去甲基、28-位甲基取代的ShurimycinsA、B(KumazawaS.，AsamiY.，Awanek.，etal..Structurestudiesofnewmacrolideantibiotics,ShurimycinsAandB[J].J.Antibiotics.1994,47(6):688-696.)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)發(fā)酵液有很強(qiáng)的抗真菌活性，遂對其活性成分進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了多個(gè)新的阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物，均具有式I或式II的結(jié)構(gòu)骨架，經(jīng)測試表明這些化合物均具有抗酵母真菌活性、抗香蕉枯萎病和抗根結(jié)線蟲活性；目前尚未見對這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、抗酵母真菌、抗香蕉枯萎病菌和抗根結(jié)線蟲的活性報(bào)道，因此市場上也尚未見有與此有關(guān)的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的具有廣譜抗酵母類真菌、抗香蕉枯萎病和抗根結(jié)線蟲活性的新化合物。本發(fā)明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備人用抗真菌藥物和農(nóng)藥中的應(yīng)用。本發(fā)明首次從鏈霉菌，尤其是鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物，如式1、式II所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式I<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式II其結(jié)構(gòu)特征是式I中&是烷?；蛲檠貂Ｒ阴；琑2為氫或甲基，R3為氫或甲基；式II中&是烷?；蛲檠貂Ｒ阴；琑2為氫或甲基，R3為氫或甲基。本發(fā)明的式1、式II化合物中，優(yōu)選以下四種化合物化合物1是式I中&為6_甲基庚酰基，R2和R3均為氫；化合物2是式II中&為6-甲基庚?；琑2為氫，R3為甲基；化合物3是式II中&為6-甲基庚酰基，R2、R3均為甲基；化合物4是式II中&為9-甲基癸?；?2為氫，13為甲基。所述的式I或式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物的制備方法，其特征在于將鏈霉菌的液體發(fā)酵物離心得上清液和菌絲體，上清液經(jīng)大孔樹脂DIOI柱層析，分別用水、30%甲醇和90%甲醇洗脫，90%甲醇洗脫液，與菌絲體的90%甲醇提取液合并，濃縮凍干后，經(jīng)硅膠柱層析以氯仿_甲醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫物經(jīng)反相柱層析，用甲醇-水(eo:4080:20)(v/v)梯度洗脫進(jìn)行各化合物的初步分離后，再用制備HPix純化，最后分別過S印hadexLH-20柱層析，用甲醇洗脫得式I和式II骨架結(jié)構(gòu)的新型阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物。制備方法中所述的鏈霉菌，優(yōu)選是鏈霉菌Str印tomycessp.211726，其菌株的保存編號(hào)為CCTCCM209153，其16SrRNA基因的Genbank號(hào)為GU130101。本發(fā)明采用微量肉湯稀釋法測試了式I或式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物的抗酵母類真菌活性，采用平板擴(kuò)擴(kuò)散法測試了該化合物的抗枯萎病活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該化合物對試驗(yàn)菌株均有很強(qiáng)的殺滅作用，因此本發(fā)明的式I或式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物可用作制備抗真菌藥物或農(nóng)藥的原料，與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，制成抗真菌藥物或農(nóng)藥，用于真菌感染和農(nóng)業(yè)病害的防治；該化合物也可與已知的藥物配伍組成復(fù)方制劑用于真菌感染和農(nóng)業(yè)病害的防治。本發(fā)明的式1、式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物可通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵物中分離純化而得到；也可由上述優(yōu)選化合物經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)修飾方法合成獲得。需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式1、式II化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)該類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可作為生產(chǎn)菌用于制備式I、式II化合物。本發(fā)明的式I、式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物的發(fā)現(xiàn)，不僅有望獲得新的人用抗真菌藥物，而且有望解決香蕉枯萎病防治困難的這一世界性難題。具體實(shí)施例方式本發(fā)明在實(shí)施例中列舉了利用鏈霉菌211726株(Str印tomycessp.211726)制備本發(fā)明式1、式II的優(yōu)選化合物的實(shí)例，但本發(fā)明制備的新化合物不只局限于本實(shí)施例中該化合物的制備方法和應(yīng)用實(shí)例。該放線菌菌株211726是從海南文昌頭苑紅樹林植物銀葉樹(Heritieraglobosa)根系土壤中分離得到，經(jīng)多相分類學(xué)研究鑒定為鏈霉菌屬菌株，定為鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)。該鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)菌株具有如下形態(tài)學(xué)特征在培養(yǎng)基ISP1-ISP7上培養(yǎng)18天，觀察其菌落形態(tài)如下菌落呈圓形，四周呈放射狀，中間微隆，白色孢子布滿整個(gè)菌落。背菌落呈圓形，四周呈放射狀，中間隆起，白色孢子集中于菌落中間。菌落呈圓形，四周呈放射狀，中間微隆，白色孢子集中于菌落中間。菌落呈圓形，四周呈放射狀，扁平，白色孢子布滿整個(gè)菌落。背面呈菌落呈圓形，四周呈放射狀，米黃色菌絲，中間隆起，白色孢子，集中于菌落邊緣。背面呈米黃色。ISP6培養(yǎng)基菌落呈圓形，無放射狀，中間隆起，往上堆積，中間形成小孔。背面呈米黃色。ISP7培養(yǎng)基菌落呈圓形，四周呈放射狀，米黃色菌絲，中間隆起，白色孢子，集中ISP1培養(yǎng)基面呈米黃色。ISP2培養(yǎng)基背面呈米黃色。ISP3培養(yǎng)基背面呈米黃色。ISP4培養(yǎng)基淡黃色，中間微黑。ISP5培養(yǎng)基于菌落邊緣。背面呈米黃色。菌株211726在培養(yǎng)基ISP1-ISP7上培養(yǎng)18天，均無色素產(chǎn)生。其中在ISP2培養(yǎng)基上插片培養(yǎng)IO天后，取插片觀察其顯微形態(tài)表明其基質(zhì)菌絲較直，無橫隔，孢子絲呈螺旋鏈狀。該鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)菌株具有如下化學(xué)分類學(xué)特征細(xì)胞壁的氨基酸構(gòu)成中含有LL-DAP(外消旋二氨基庚二酸)、甘氨酸和少量的meso-DAP(內(nèi)消旋二氨基庚二酸)；細(xì)胞壁的糖構(gòu)成含有木糖，不含鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖。該鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)菌株具有如下分子生物學(xué)特征16SrRNA基因序列信息需要特別說明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式1、式II化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)阿扎霉素F(AzalomycinF)類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可用于生產(chǎn)制備式1、式II化合物。在如下的實(shí)施例中所指的優(yōu)選化合物1、2、3、4的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別是(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯?dāng)?shù)字是化學(xué)結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位)OHR253b式IOHR253b式II式I中化合物1的&為6-甲基庚酰基，R2和R3均為氫。式II中化合物2的&為6-甲基庚?；?，R2為氫，R3為甲基；化合物3的&為6-甲基庚?；?，R2、R3均為甲基；化合物4的&為9-甲基癸?；琑2為氫，R3為甲基。實(shí)施例1化合物1、2、3、4的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1、發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)菌株適量，接種到Y(jié)E平板培養(yǎng)基上[培養(yǎng)基組成(g/L):酵母粉4g，麥芽粉10g，葡萄糖4g，瓊脂粉20g，海鹽18g，去離子水1L，pH7.27.4]，2『C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。取平板培養(yǎng)4d的鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)菌株適量，接種到裝有20mLYE培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(g/L):酵母粉4g，麥芽粉10g，葡萄糖4g，氯化鈉18g，去離子水lL，pH7.27.4]的200mL試管中，28。C、190rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)72h，獲得鏈霉菌211726(Str印tomycessp.211726)菌株的種子培養(yǎng)液。將該種子培養(yǎng)液按10%接種量分別接種于裝有200mL生產(chǎn)培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖10g，可溶性淀粉20g，酵母粉5g，干酪素5g，氯化鈉18g，MOPS46g，去離子水1L，pH7.17.3]的lOOOmL三角燒瓶中，828°C、190rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)10d。重復(fù)上述操作至獲得發(fā)酵混合物20L。2、浸膏的獲得用離心方法將菌絲體和發(fā)酵液分離。發(fā)酵液上大孔吸附樹脂D101，依次用水、30X甲醇、90%甲醇洗脫，得90%甲醇洗脫液；菌絲體用甲醇浸提三次，得甲醇提取液，合并甲醇提取液和90%甲醇洗脫液，減壓濃縮至不含甲醇，凍干，得凍干粉末32.5g。3、化合物的分離精制凍干粉末(32.5g)用氯仿-甲醇(2:1)混合溶劑溶解，過濾去不溶解物后，加150g200300目硅膠H(青島海洋化工集團(tuán)公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑研磨均勻后，上硅膠柱層析，用氯仿_甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，其中Fr-4(2.83g，氯仿-甲醇2:1洗脫物)富含式I、式II化合物。將Fr-4上反相柱層析，用甲醇-水(60:40，80:20)梯度洗脫進(jìn)行各化合物的初步分離后，再用制備HPLC純化，最后分別過S印hadexLH-20柱層析，用甲醇洗脫得式I化合物1(31mg)和式II化合物2(15mg)、3(10mg)、4(27mg)?；衔?:白色無定型粉末，[a]D2°+6.8°(c0.1，MeOH)，分子式C^H^NsC^;UVAmaxMe0Hnm:238;IR(umaxKBrcm—":3423、2962、2935、1736、1707、1637、1184、1045、970、721,H及"C-WR數(shù)據(jù)見附表1和附表2?；衔?:白色無定型粉末，[a]D2°+6.4°(c0.1，MeOH)，分子式C^IVNAs;UVAmaxMe0Hnm:238;IR(umaxKBrcm—":3423、2966、2936、1734、1708、1635、1181、1049、972、722"H及13C-隨R數(shù)據(jù)見表1和表2?；衔?:白色無定型粉末，[a]D2°+6.1°(c0.1，MeOH)，分子式C^H^NAs;UVAmaxMe0Hnm:238;IR(umaxKBrcm—":3425、2962、2935、1734、1708、1636、1185、1047、972、721,H及"C-隨R數(shù)據(jù)見表1和表2?；衔?:白色無定型粉末，[a]D2Q+6.0°(c0.1，MeOH)，分子式C64H113N3015;UV入隨Me。Hnm:238;IR(umaxKBrcm—":3425、2968、2936、1736、1707、1636、1185、1047、972、722一H及13C-麵R數(shù)據(jù)見表1和表2。表1化合物14的^-醒R(400MHzinMeOH-d6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表2化合物14的13C_NMR數(shù)據(jù)(100MHzinMeOH_d6)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例2抗酵母真菌的活性測試1、實(shí)驗(yàn)材料及方法化合物14溶液的配制測試樣品為上述實(shí)施例1中分離精制的純品化合物14。準(zhǔn)確稱取適量樣品，少量匿SO溶解(小于5%)，用水按等比稀釋配制成所需濃度的溶液，供活性測試用。試驗(yàn)菌株見表3。YPD培養(yǎng)基葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母粉10g，蒸餾水1000mL，pH7.0?；衔?4的抗真菌活性均參照CLSIM27-A3方案，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行測試即將試驗(yàn)菌懸液(孢子濃度為1.0X107CFU/mL)，經(jīng)對應(yīng)培養(yǎng)基稀釋后，加到滅菌好的96孔聚苯乙烯板中，每孔加100i!L，然后將按倍比稀釋好的不同濃度的化合物14加到孔中，每孔lOOyL，稍振搖混勻，此時(shí)第1孔至第11孔化合物的濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10yg/mL，第12孔為生長對照(不含測試化合物)，密封后置2『C普通空氣孵箱中，孵育20h判斷結(jié)果。當(dāng)生長對照孔內(nèi)真菌明顯生長時(shí)，以小孔內(nèi)完全抑制真菌生長的最低化合物濃度為該化合物對試驗(yàn)菌的MIC。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物14抗真菌活性的測試結(jié)果見表3。表3化合物14的抗真菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3結(jié)論化合物14對上述試驗(yàn)真菌的生長具有顯著的抑制作用。因此，本發(fā)明的式I、式II化合物具有抗真菌的作用，可用于抗真菌藥物的制備和應(yīng)用。實(shí)施例3抗枯萎病活性測試1實(shí)驗(yàn)材料及方法化合物14溶液的配制將化合物14分別溶于二甲基亞砜，濃度為20mg/mL。試驗(yàn)菌株香蕉枯萎病病原真菌(Fusariumoxysporumf.sp.Cubense，尖孢鐮刀菌)。PDA培養(yǎng)基取馬鈴薯200g煮沸30min，4層紗布過濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖20g，瓊脂20g，加水至l，OOOmL。將活化的香蕉枯萎病病原真菌孢子懸液(孢子濃度為1.0X107CFU/mL)100yL加入冷卻至5(TC左右的15mLPDA培養(yǎng)基中輕輕搖動(dòng)，待培養(yǎng)基冷卻后在培養(yǎng)基中央放置一無菌的牛津杯，再將100iiL化合物l溶液注入牛津杯中，以100iiL二甲基亞砜做對照，重復(fù)3次，2『C培養(yǎng)3d觀察并測量化合物的抑菌圈直徑大小。2結(jié)果化合物14的抑制菌圈直徑分別為(2.93±0.04)cm、(2.81±0.04)cm、(3.72±0.06)cm、(3.58±0.04)cm。3結(jié)論化合物14對香蕉枯萎病病原真菌的菌絲生長具有顯著的抑制作用。因此，本發(fā)明的式1、式II化合物可用于抗枯萎病農(nóng)藥的制備和應(yīng)用。權(quán)利要求具有式I或式II骨架結(jié)構(gòu)的新型阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物，其特征是式I式II其中式I或式II中R1為烷?；蛲檠貂Ｒ阴；琑2為氫或甲基，R3為氫或甲基。F2009102538925C00011.tif,F2009102538925C00012.tif2.如權(quán)利要求1所述的式I阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物，其結(jié)構(gòu)特征是為6-甲基庚酰基，R2和R3均為氫。3.如權(quán)利要求l所述的式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物，其結(jié)構(gòu)特征是A為6-甲基庚?；?，R2為氫，R3為甲基。4.如權(quán)利要求l所述的式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物，其結(jié)構(gòu)特征是A為6-甲基庚?；?，R2、R3均為甲基。5.如權(quán)利要求l所述的式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物，其結(jié)構(gòu)特征是A為9-甲基癸?；?，R2為氫，R3為甲基。6.如權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的式I或式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物的制備方法，其特征在于將鏈霉菌的液體發(fā)酵物離心得上清液和菌絲體，上清液經(jīng)大孔樹脂D101柱層析，分別用水、30%甲醇和90%甲醇洗脫，90%甲醇洗脫液，與菌絲體的90%甲醇提取液合并，濃縮凍干后，經(jīng)硅膠柱層析以氯仿-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫物經(jīng)反相柱層析，用甲醇-水(60:4080:20)(v/v)梯度洗脫進(jìn)行各化合物的初步分離后，再用制備HPLC純化，最后分別過S印hadexLH-20柱層析，用甲醇洗脫得式I和式II骨架結(jié)構(gòu)的新型阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯類化合物。7.如權(quán)利要求6所述式I或式II阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物的制備方法，其特征在于所述的鏈霉菌，優(yōu)選是鏈霉菌Str印tomycessp.211726，其菌株的保存編號(hào)為:CCTCCM209153，其16SrRNA基因的Genbank號(hào)為GU130101。8.如權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的具有式I或式II骨架結(jié)構(gòu)的新型阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物在制備人用抗真菌藥物和農(nóng)藥中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種新型阿扎霉素F(AzalomycinF)類大環(huán)內(nèi)酯化合物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的具有廣譜抗酵母類真菌、抗香蕉枯萎病和抗根結(jié)線蟲活性的新化合物。本發(fā)明所提供的化合物其特征是具有式I或式II骨架結(jié)構(gòu)的化合物，其中式I中R1是烷酰基或烷氧酰乙?；琑2是氫或甲基，R3是氫或甲基；式II中R1是烷酰基或烷氧酰乙?；?，R2為氫或甲基，R3為氫或甲基。式I式II文檔編號(hào)C12P19/62GK101792474SQ20091025389公開日2010年8月4日申請日期2009年11月30日優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日發(fā)明者唐依莉,林海鵬,洪葵,王成,袁干軍,謝晴宜,黃小龍申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所