專利名稱：新的成體祖細(xì)胞的制作方法
新的成體袓細(xì)胞本發(fā)明涉及新的祖細(xì)胞(PC)及其后代，包括源自該祖細(xì)胞的分化的細(xì)胞；獲得所 述PC及其后代，包括所述分化的細(xì)胞，尤其是肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元 細(xì)胞或雪旺細(xì)胞的方法，所述方法通過將所述組細(xì)胞分化成分化的細(xì)胞；并且涉及通過培 養(yǎng)所述分化的細(xì)胞獲得的重建的組織。此外，本發(fā)明涉及所述PC及其后代，包括所述分化 的細(xì)胞在生產(chǎn)用于遭受諸如面部燒傷或損傷的個(gè)體的替代組織中的應(yīng)用；并且涉及提供具 有用于神經(jīng)元再生潛力的神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述PC和得到的后代用于治療免疫 相關(guān)的障礙的應(yīng)用，所述免疫相關(guān)的障礙包括但不限于移植物抗宿主病(GVHD)和如糖尿 病的慢性病癥。引言由于圍繞多能胚胎干細(xì)胞(ESCs)的應(yīng)用的倫理和道德問題，用于組織工程應(yīng)用 的成體干細(xì)胞(ASCs)的分離和應(yīng)用已獲得極大的關(guān)注。已從體內(nèi)的多個(gè)位置，諸如皮膚、 骨膜、牙髓、臍帶、腱和牙周膜分離到ASC。然而，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)是描述最多的。發(fā) 現(xiàn)ASC來源替代骨髓來源的探索是持久性的，因?yàn)锽MSC的數(shù)量隨著年齡減少，并且它們的 增殖和分化能力明顯損失(1)。ASC為自我更新的和多能的，使之適合于治療應(yīng)用。它們的 體外壽命有限降低了它們潛在的致瘤性，這也作為相對于ESC的優(yōu)點(diǎn)。分離這些細(xì)胞的組 織決定了它們潛在的治療應(yīng)用，一些ASC來源能夠唯一地分化為它們來源的組織，例如分 離的皮層祖細(xì)胞O)。因此，在尋找用于組織工程目的的理想活組織檢查位置中，考慮誘導(dǎo)時(shí)ASC可以 產(chǎn)生的細(xì)胞系范圍以及它們的增殖能力很重要。實(shí)際上，分離足量的來自成體組織的干細(xì) 胞可能極其受限。一些ASC已被表征為沒有/具有較少的活性端粒酶，使得它們在體外擴(kuò) 增困難和受限制0，3)。此外，ASC的分離通常為創(chuàng)傷性的，例如BMSC的分離需要骨髓穿刺，或者皮膚來源 的前體的分離需要皮膚活組織檢查；后者導(dǎo)致疤痕形成。口腔粘膜內(nèi)的創(chuàng)傷愈合的特征在于炎癥減少、上皮再次快速形成和不同的成纖維 細(xì)胞響應(yīng)，使得形成的疤痕最??；與在皮膚中觀察到的相比，一般被認(rèn)為是更加“胎兒樣”的 過程G-8)。已報(bào)道口腔粘膜上皮的基底層中存在祖細(xì)胞(PCs) (9-11)，但是到目前為止，未見 有關(guān)存在口腔粘膜固有層(OMLP)中固有的祖細(xì)胞或干細(xì)胞群的報(bào)道。最近的綜述通過參 照皮膚真皮中的PC群，強(qiáng)調(diào)了 OMLP中存在祖細(xì)胞或干細(xì)胞群的可能性(12)。傳統(tǒng)地，PC被 描述為單能或多能細(xì)胞。從這個(gè)角度來看，它們可以相當(dāng)于成體干細(xì)胞。但是祖細(xì)胞被認(rèn)為 處在細(xì)胞分化的更遠(yuǎn)階段。它們?yōu)椤霸谥虚g”的干細(xì)胞，并且為完全分化的細(xì)胞。它們具有 的潛能類型取決于它們的“親代”干細(xì)胞的類型，還取決于它們的生態(tài)位(niche)。與大部 分與干細(xì)胞類似，它們形成于集落中，在適當(dāng)?shù)臈l件下它們生長并分化為它們的目標(biāo)組織。 祖細(xì)胞和成體干細(xì)胞具有許多共同的特件，然而,兩類細(xì)胞都不同于胚胎干細(xì)胞(ESCs),胚 胎干細(xì)胞(ESCs)為真正的干細(xì)胞，因?yàn)镋SC為多能的，并且顯示出無限的自我更新能力。相 反地，許多被稱為^iMM的細(xì)胞可以被定義為祖細(xì)胞更好，因?yàn)樗鼈儫o限的自我更新能力和可塑性并未被全面證實(shí)。祖細(xì)胞被用作身體的修復(fù)系統(tǒng)。它們補(bǔ)充特化細(xì)胞，而且 還維持血液、皮膚和腸道組織。我們先前已報(bào)道，不考慮創(chuàng)傷環(huán)境，配對的患者口腔粘膜和皮膚成纖維細(xì)胞具有 明顯的顯型和基因型區(qū)別，導(dǎo)致在口腔粘膜中觀察到優(yōu)先愈合響應(yīng)(6-8) (Enoch等人， 2009，出版中)。這些發(fā)現(xiàn)支持了 OMLP中可能特異性固有PC群，并且正是這種細(xì)胞群可以 促成在這種組織創(chuàng)傷上觀察到的優(yōu)先愈合響應(yīng)的觀點(diǎn)。重要地是，從OMLP分離PC群為治 療應(yīng)用提供了明顯優(yōu)勢，提供了容易取得并且微創(chuàng)的活組織檢查位置，并且快速愈合，結(jié)果 患者不形成疤痕/形成的疤痕最小。我們在此首次公開了口腔粘膜固有層中固有的新的PC群的存在。這種細(xì)胞群可 以從口腔粘膜活體組織檢測物可靠地分離，并且我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，這種PC群具有極大的用 于治療應(yīng)用的潛力，因?yàn)樗梢苑只癁橐幌盗屑?xì)胞系，而且這種PC群具有有利的增殖能 力，能夠產(chǎn)生用于治療目的的足量細(xì)胞。實(shí)際上，源自單一 OMLP PC的克隆在體外可以快速 擴(kuò)增，這得益于活性端粒酶的驚人表達(dá)。正是這些克隆群為多能的，并且可以分化為間充質(zhì) 和神經(jīng)來源的細(xì)胞系。在此，我們還首次公開了本發(fā)明的新PC群具有免疫調(diào)節(jié)性，更具體地是免疫抑制 潛力的發(fā)現(xiàn)。實(shí)際上，我們發(fā)現(xiàn)將僅僅少數(shù)本發(fā)明的PC與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)就可以抑制免疫 應(yīng)答。這對于用于細(xì)胞或組織的異源轉(zhuǎn)移具有重要意義，因?yàn)楸景l(fā)明的PC的使用/存在將 會防止組織排斥。將此放入文中，先前證明間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)施加免疫調(diào)節(jié) 性作用。最近公開的研究使用人牙周膜干細(xì)胞(也是間充質(zhì)來源的)證明與淋巴細(xì)胞的直 接接觸產(chǎn)生了最有效的免疫抑制作用(13)。在MSC中觀察到抑制程度為劑量依賴性的，免 疫抑制水平隨著存在的MSC數(shù)量的減少而降低。相反地，本發(fā)明的OMLP PC以非接觸依賴 性和非劑量依賴性方式發(fā)揮作用，產(chǎn)生對異源誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抑制。這種抑制作用可能 是本發(fā)明的OMLP PC的極其重要的特征，因?yàn)橛蓢?yán)重的移植物抗宿主病(GVHD)直接導(dǎo)致的 死亡率仍然是異源造血干細(xì)胞(HSC)移植中的主要障礙之一。GVHD的特征在于HSC移植物 中存在的T細(xì)胞直接攻擊“外來抗原性”宿主。已報(bào)道的在GVHD治療中的臨床試驗(yàn)有限。 最近Ringden等人的研究證明，在注入MSC的8位患者中，6位患者消除了所有癥狀，顯示出 完全的響應(yīng)(14)。由此可見，本發(fā)明的祖細(xì)胞或其后代本身可以作為用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的 治療劑，由此治療炎癥障礙，如在異源造血干細(xì)胞(HSC)移植中的GVHD。此外，由此還可見，本發(fā)明的祖細(xì)胞及其后代本身可以作為用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的 治療劑，由此治療免疫障礙，例如但不限于GVHD。因此，我們發(fā)現(xiàn)OMLP通過提供自我更新和多能的PC群，為組織工程應(yīng)用提供了優(yōu) 選的細(xì)胞來源，所述PC群來自最小微創(chuàng)的活組織檢查位置，該位置迅速愈合并且形成的疤 痕最小。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與其他PC或ASC相比時(shí)，這種OMLP PC群具有有利的免疫調(diào) 節(jié)活性。

發(fā)明內(nèi)容
一種分離的人成體祖細(xì)胞(PC)及其后代，其中所述細(xì)胞源自口腔粘膜的固有層， 并且進(jìn)一步地，所述細(xì)胞為多能的、自我更新的和具有免疫調(diào)節(jié)性。
在此提及的多能與分化為在此所述的許多細(xì)胞類型的能力有關(guān)。在此提及的自我更新包括提及的更新但不是無限意義上的。在此提及的免疫調(diào)節(jié)性與本發(fā)明的PC或其后代，包括分化的細(xì)胞，以非接觸依賴 性或非劑量依賴性方式或者不依賴于HLA II細(xì)胞表面表達(dá)誘導(dǎo)來抑制免疫應(yīng)答的能力有關(guān)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PC為三種干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90、⑶105和⑶166陽性。進(jìn)一步理想地，所述PC為細(xì)胞標(biāo)記物⑶34和⑶45陰性。更進(jìn)一步理想地，所述PC為以下四種細(xì)胞標(biāo)記物陽性(與iPS相關(guān)，見下文) Nanog,KLF-4、Sox2 和 0ct4。還進(jìn)一步地，所述PC為任何一種或多種以下細(xì)胞標(biāo)記物陽性⑶90、⑶105、 CD166、STR0-1、CD44、CD146、Nanog、KLF-4、Sox2、0ct4、Notchl/2/ 或 3、Delta 1 或 Jagged 2。在此提及的對特定細(xì)胞標(biāo)記物陽性或陰性的細(xì)胞與所述細(xì)胞表達(dá)所述標(biāo)記物的 能力有關(guān)，其中陽性意味著所述標(biāo)記物表達(dá)，陰性意味著所述標(biāo)記物表達(dá)缺失。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PC經(jīng)過超過45次的群倍增，并且理想 地，在整個(gè)這種倍增時(shí)間或其中的一部分時(shí)間內(nèi)還表達(dá)端粒酶。如上所述，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PC在mRNA水平上為轉(zhuǎn)錄因子Nanog 陽性(但是在蛋白水平并非必需的)，Nanog被認(rèn)為是維持胚胎干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵。此 外，所述PC還為轉(zhuǎn)錄因子0ct4陽性，0ct4涉及未分化的干細(xì)胞的自我更新，它在用膠原酶 消化口腔粘膜固有層之后在新鮮分離的細(xì)胞中表達(dá)(然而，它在傳統(tǒng)的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 基中培養(yǎng)之后消失)。此外，所述PC為Sox2和KLF-4陽性，Sox2是調(diào)節(jié)未分化的胚胎干細(xì) 胞的自我更新和控制0ct4表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，KLF-4是在維持干細(xì)胞中看來很重要的另 一種轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明的PC還為神經(jīng)嵴標(biāo)記物Soxl0(其對神經(jīng)嵴和周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育重 要)；Slug、Snail和Twist陽性，以及為發(fā)育標(biāo)記物Notchl陽性。這些標(biāo)記物的存在暗示所述PC可以分化成的目標(biāo)細(xì)胞類型。實(shí)際上，為了誘導(dǎo)的 多能干細(xì)胞(iPQ技術(shù)今后的發(fā)展和利用，以上胚胎標(biāo)記物在mRNA或蛋白水平上在祖細(xì)胞 中的表達(dá)和未成熟發(fā)育標(biāo)記物在祖細(xì)胞中的表達(dá)表明可能有優(yōu)先的細(xì)胞類型，其比目前使 用的細(xì)胞類型需要的修飾更少。實(shí)際上，在這方面值得注意的是，本發(fā)明的PC表達(dá)主要的 四種細(xì)胞因子(Nanog、KLF-4、Sox2和0ct4)，它們用于iPS中將成纖維細(xì)胞重新編程回復(fù) 為胚胎樣干細(xì)胞。這四種因子在OMLP的PC中是自然表達(dá)的，表明我們擁有可以被分離且 無需iPS重新編程就像胚胎干細(xì)胞一樣起作用的細(xì)胞群。因此我們擁有具有多能性能力的 PC群和/或進(jìn)一步地，我們擁有產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞類型細(xì)胞的PC群，其比其他細(xì)胞類型需要 更少的重新編程。因此，在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了 iPS，其包括表達(dá)以下四種細(xì)胞標(biāo)記物或?yàn)?以下四種細(xì)胞標(biāo)記物陽性的OMLP的PC =Nanog, KLF-4、Sox2和0ct4。此外，在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了用于從口腔粘膜固有層獲得祖細(xì)胞的方法， 所述方法包括以下步驟(a)通過去除細(xì)胞的脂肪組織和上皮層處理來自受試者的口腔粘膜樣品；
(b)去除剩余的固有層細(xì)胞外基質(zhì)以形成細(xì)胞的混合懸浮液；(c)分離潛在的祖細(xì)胞，并且讓它們形成集落；以及(d)利用祖細(xì)胞的特征性標(biāo)記物選擇集落。在步驟(a)中，脂肪組織可以通過任何的簡便方法去除，例如通過解剖活組織檢 查樣品。鏈霉蛋白酶/分散酶是合適用于去除口腔粘膜上皮層的酶。如ang/ml、37°C下過 夜處理將滿足需要，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員在此方面可以進(jìn)行變化。在步驟(b)中，固有層細(xì)胞外基質(zhì)可以通過用膠原酶消化去除。如在lmg/ml梭狀 芽孢桿菌A膠原酶中于37 °C下過夜孵育處理將滿足需要，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員在此方面可 以進(jìn)行變化。在步驟(c)中，以上潛在的祖細(xì)胞可以利用對細(xì)胞粘合劑的粘附不同來分離，所 述細(xì)胞粘合劑如Dowthwaite等人2004和Jones和Watt，1993，(10，15)報(bào)道的纖維連接 蛋白或包含RGD氨基酸序列的片段。然后可以讓粘附至纖維連接蛋白基質(zhì)的單細(xì)胞培養(yǎng) 12-14天形成集落(>32個(gè)細(xì)胞)，所得到的集落可以在克隆環(huán)(cloning ring)內(nèi)通過胰 蛋白酶消化而分離?？晒┻x擇地，如以上Jones和Watt的文章中所討論的，在步驟(c)中 可以使用其他基質(zhì)如膠原蛋白和層粘連蛋白作為用于區(qū)別粘附的細(xì)胞粘合劑。此外，如果 分離了足量的細(xì)胞，細(xì)胞可以使用流式細(xì)胞儀或磁活化細(xì)胞分類(MACQ選擇來分選。我們已經(jīng)專門使用細(xì)胞的克隆群(而不是來自未分選的整個(gè)組織的異源分離物) 用于本研究，因?yàn)檫@樣能夠精確地限定純的細(xì)胞群。在不太優(yōu)選的研究本發(fā)明的方式中，可 以采用利用常規(guī)技術(shù)對整個(gè)組織的異源分離。這些技術(shù)可以包括，例如利用與細(xì)胞粘合劑 的粘附區(qū)別來分離潛在的祖細(xì)胞，所述細(xì)胞粘合劑如Dowttwaite等人Q004)以及Jones 和Watt (1993) (10，15)報(bào)道的纖維連接蛋白、RGD氨基酸序列、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。在 單層培養(yǎng)中，在被傳代和擴(kuò)增成異源祖細(xì)胞培養(yǎng)物之前，可以讓粘附至例如纖維連接蛋白 基質(zhì)的單細(xì)胞生長至融合。在上述步驟(d)中，祖細(xì)胞的特征性標(biāo)記物包括端粒酶和轉(zhuǎn)錄因子Nanog以及轉(zhuǎn) 錄因子0ct4，端粒酶被認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞中維持自我更新的關(guān)鍵；轉(zhuǎn)錄因子Nanog被認(rèn)為 是保持多能性的關(guān)鍵；轉(zhuǎn)錄因子0ct4涉及未分化的干細(xì)胞的自我更新?？梢詸z測的其他標(biāo) 記物為神經(jīng)嵴標(biāo)記物，例如SoxlO (其對神經(jīng)嵴和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育重要)；Slug、Snail、 Twist和p75。其他有用的標(biāo)記物為發(fā)育標(biāo)記物Notchl。可以檢測的其他標(biāo)記物包括⑶90、 CD105、CD166、STRO-U CD44、CD146、CD34、CD45、Sox2、KLF-4、Notch 2 或 3、Delta 1 和 Jagged。除⑶34和⑶45外，可以尋找對任何一種或多種前述標(biāo)記物為陽性，并且優(yōu)選地， 對一種以上的這樣的標(biāo)記物為陽性，例如按逐漸優(yōu)選的順序，對至少兩種、三種、四種、五種 或六種或更多種這樣的標(biāo)記物為陽性的選定細(xì)胞。為證實(shí)這些祖細(xì)胞并不是造血來源的， 可以尋找對CD34和CD45陰性的選定細(xì)胞。標(biāo)記物的存在或缺失可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法來確定，優(yōu)選免疫細(xì)胞化學(xué)法或熒光激活 細(xì)胞分類(FACS)分析。相應(yīng)地，在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，所述方法在步驟(C)之后并且在實(shí)施步 驟(d)之前，還包括使用常規(guī)方法確定任何一種或多種上述特定標(biāo)記物表達(dá)的步驟，所述 常規(guī)方法例如但不限于，免疫細(xì)胞化學(xué)法或熒光激活細(xì)胞分類(FACQ分析。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，所述方法還包括以下的其它步驟
(e)擴(kuò)增步驟(d)中選擇的集落。通常，這些選擇的集落在單層培養(yǎng)物中擴(kuò)增，并且這可能持續(xù)至衰老。如有經(jīng)驗(yàn)的人員所知道的，通過變化培養(yǎng)條件可以實(shí)現(xiàn)祖細(xì)胞分化為選定的顯 型。例如，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在含10%胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)fegle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng) 的細(xì)胞，顯示成纖維細(xì)胞型形態(tài)，而且保持表達(dá)三種干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90、⑶105和⑶166a， 并且理想地，還有STR0-1、⑶44、CD146系列。此外，理想地，它們還為CD34和CD45陰性。 然而，通過改變培養(yǎng)基，可能獲得軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。在以 下實(shí)施例中將進(jìn)一步列出培養(yǎng)基的細(xì)節(jié)。然而，簡言之，通過在添加Ix胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒(ITS)添加劑(Invitrogen， UK)、50 μ g/ml L-抗壞血酸鹽(Sigma，UK)和 5ng/ml 轉(zhuǎn)化生長因子 β 1 (TGF^ 1) ((Peprotech EC Ltd.，UK)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(添加2mML_谷氨酰胺、lOOU/ml青霉素G、100 μ g/ ml硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml兩性霉素B的Dulbecco改進(jìn)fegle培養(yǎng)基[DMEM])的細(xì)胞團(tuán) (pellet)培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)PC獲得軟骨細(xì)胞。使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加10% (v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、 100 μ g/ml硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml兩性霉素Β、50 μ g/ml L-抗壞血酸鹽、10 μ M地塞米松 和 5mM β -甘油磷酸鹽(Sigma，UK)的 Alpha 改進(jìn) Eagle 培養(yǎng)基(α -MEM) (Invitrogen, UK) 獲得骨細(xì)胞。使用成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加10 μ g/ml胰島素、1 μ M地塞米松、100 μ M吲哚美 辛、100 μ Μ3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤[IBMX] (Sigma, UK)的SCM)培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移至 成脂肪維持培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)M小時(shí)。然后再用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。這個(gè)培養(yǎng)基的 循環(huán)重復(fù)觀天。所述成脂肪維持培養(yǎng)基由添加10 μ g/ml胰島素的SCM組成。使用X-VIVOtmIO培養(yǎng)基(Lonza Group Ltd.，UK)培養(yǎng)用于神經(jīng)元細(xì)胞和雪旺細(xì)胞 系的PC，所述X-VIVOtmIO培養(yǎng)基中添加了 0. ImM β-巰基乙醇(Sigma,UK) U % (ν/ν)非必 需氨基酸(Invitrogen，UK)、100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml兩性霉 素B和80ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rhbFGF) (Peprotech EC Ltd.，UK)。使用以前描述的方法使這些細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元分化(16，17)。簡言之，對單細(xì)胞懸浮 液計(jì)數(shù)并以5. 6 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2接種于0. 1 % Matrigel (BD Biosciences, UK)包被的腔 室培養(yǎng)玻片(chamber slides)上，置于 DMEM-F12 (3 1)培養(yǎng)基中，所述 DMEM-F12 (3 1) 培養(yǎng)基添加了 40ng/ml hrbFGF、10 % (v/v) FCS、2mM L-谷氨酰胺、lOOU/ml 青霉素 G、 100 μ g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素B。培養(yǎng)細(xì)胞7天，每3天更換培養(yǎng)基。培 養(yǎng)7天之后，從培養(yǎng)基中去除rhbFGF，并用lOng/ml神經(jīng)生長因子(NGF)、lOng/ml腦源性生 長因子(BDNF)和10ng/ml神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin) 3 (NT3)替代。再培養(yǎng)細(xì)胞7天， 每3天更換培養(yǎng)基。如之前Toma等人Q005) (18)的描述進(jìn)行雪旺細(xì)胞的分化。將膠原酶處理 的細(xì)胞以與用于神經(jīng)元分化所述的密度相等的密度接種于聚-D-賴氨酸層粘連蛋白 (Iaminin)Q μ g/ml)包被的腔室培養(yǎng)玻片上。在DMEM_F12(3 1)中培養(yǎng)細(xì)胞7天，所述 DMEM-F12 (3 1)添加了 10% (v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml 青霉素 G、100 μ g/ml 硫 酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素B。然后用neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen，UK)替代該 培養(yǎng)基，所述 neurobasal 培養(yǎng)基含有 1 % (v/v) FCSU % (ν/ν) Ν2 添加劑(Invitrogen，UK)、4μ M 毛喉素(forskolin, Sigma, UK)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml 青霉素 GUOO μ g/ml 硫酸 鏈霉素、0· 25 μ g/ml 兩性霉素 B 和 10ng/ml heregulin β 1 (Peprotech EC Ltd.，UK)。在 該培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞7天。每3天更換培養(yǎng)基，50%的條件培養(yǎng)基被再應(yīng)用于細(xì)胞。相應(yīng)地并且優(yōu)選地，上述方法進(jìn)一步包括涉及分化所述選擇的PC的最終步驟，如 在此所述，其中通過以選定的方式將所述PC的培養(yǎng)條件變?yōu)橛糜诋a(chǎn)生選定的分化細(xì)胞而 實(shí)現(xiàn)分化。此外，在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了用于獲得肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì) 胞、雪旺細(xì)胞和/或神經(jīng)元細(xì)胞的方法，所述方法包括分化至少一種從口腔粘膜的固有層 獲得的祖細(xì)胞(PC)或其后代。在本發(fā)明的上下文中，“肌細(xì)胞”是指平滑肌細(xì)胞和橫紋肌細(xì)胞，“骨細(xì)胞(bone cells) ”是指成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞(osteocytes)。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了通過分化至少一種從口腔粘膜固有層分離的祖細(xì) 胞而獲得的至少一種分化的細(xì)胞。理想地，所述分化的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞、或肌細(xì)胞、或脂肪細(xì)胞、或骨細(xì)胞、或雪旺細(xì) 胞，和/或神經(jīng)元細(xì)胞。這種分化的細(xì)胞的實(shí)例包括能夠形成軟骨(通過標(biāo)記物聚集蛋白聚糖 (aggrecan)+、Sox9+、col2al A+型而證實(shí)的)、脂肪細(xì)胞(通過油紅0染色的表達(dá)而證 實(shí)的，并且理想地，還通過在信使RNA水平上的脂蛋白脂肪酶、CAATT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 α [CEBP α ]和過氧化物酶體增殖物激活受體、[PPAR γ ]的表達(dá)證實(shí)的)、骨細(xì)胞(通過 Von Kossa和堿性磷酸酶染色而證實(shí)的)(

圖12)、雪旺細(xì)胞(通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測 S100和髓鞘堿性蛋白(MBP)的產(chǎn)生而證實(shí)的)和神經(jīng)元細(xì)胞(通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測 巢蛋白(nestin)、β -微管蛋白III (TUJ-I)、神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白Μ、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (GFAP)和微管相關(guān)蛋白2(ΜΑΡ2)的產(chǎn)生而證實(shí)的；還參見圖6a_g)的細(xì)胞。在本發(fā)明這個(gè)方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分化的細(xì)胞和源自集落的細(xì)胞是采用 以上描述的方法獲得的。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)分化的細(xì)胞獲得的重建組織。本發(fā)明所述的PC和重建組織可以用于各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，因此在本發(fā)明的進(jìn)一步 方面，提供了用于藥物的本發(fā)明的分化的細(xì)胞或重建組織。例如，由這些細(xì)胞形成的骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和重建組織全部可 以應(yīng)用于治療創(chuàng)傷或燒傷，或修復(fù)由疾病如癌癥導(dǎo)致的損傷。這對于治療面部損傷和疤痕 特別有意義。神經(jīng)細(xì)胞可以用于神經(jīng)障礙，如帕金森癥。雪旺細(xì)胞可以用于神經(jīng)損傷的修復(fù)和 治療脊髓損傷。有利地，所述PC或其后代包括分化的細(xì)胞，可以源自需要治療的患者，但是可供 選擇地，可以源自另一個(gè)體，并且被用于異源組織工程和移植。由于所述PC或其后代固有 的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，而且尤其是這些細(xì)胞抑制免疫應(yīng)答的能力，這種后者選擇可用于實(shí)施本 發(fā)明的研究。進(jìn)一步地，源自需要治療的個(gè)體或任何其他人的所述PC或其后代，可以與源自除 需要治療個(gè)體之外的個(gè)體的分化組織同時(shí)給予，并且在這種情況下，所述PC或其后代發(fā)揮有益的免疫抑制作用。因此，在本發(fā)明另一方面，提供了用于治療創(chuàng)傷、燒傷，或修復(fù)由疾病導(dǎo)致的損傷 的方法，所述方法包括用如前所述的分化的細(xì)胞或重建組織替代損傷組織，其中所述分化 的細(xì)胞或所述組織可以源自需要治療的患者，也可以源自另一個(gè)體的OMLP的PC。進(jìn)一步地，在本發(fā)明另一方面，提供了用于治療創(chuàng)傷、燒傷或修復(fù)由疾病導(dǎo)致的損 傷的方法，所述方法包括同時(shí)給予i)源自除需要治療的個(gè)體之外的個(gè)體的分化的細(xì)胞或 組織，其中細(xì)胞或組織并非源自O(shè)MLP的PC，和ii) OMLP的PC或其后代。由于OMLP的PC或其后代的免疫抑制性質(zhì)，以上部分ii)中所述PC可以源自任何 個(gè)體。本發(fā)明的這種后者方面的實(shí)例為同時(shí)輸入來自除需要治療的個(gè)體之外的個(gè)體的造血 干細(xì)胞，并且所述PC預(yù)防或用于治療GVHD。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了用于治療炎癥障礙或免疫障礙的方法，所述方法 包括向待治療的個(gè)體給予如上所述的祖細(xì)胞或其后代，包括分化的細(xì)胞或組織，或者通過 以上所述方法獲得的祖細(xì)胞或其后代。在本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，提供了如上所述的祖細(xì)胞或其后代，包括分化的細(xì)胞 或組織，或者通過以上所述方法獲得的祖細(xì)胞或其后代，包括分化的細(xì)胞或組織作為藥物 的應(yīng)用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述應(yīng)用為治療任何一種或多種以下障礙創(chuàng)傷、燒傷、組織 損傷、炎癥、自身免疫、GVHD異源造血干細(xì)胞(HSC)移植、糖尿病或免疫障礙。現(xiàn)在將參考以下附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明。其中圖1顯示被包被到纖維連接蛋白上并且根據(jù)粘附區(qū)別被分離的p75陽性細(xì)胞。圖2顯示在(a)DMEM/10% FCS, (b-c)X-VIV010培養(yǎng)基中擴(kuò)增的集落中不同的形 態(tài)。(b)顯示連接至層粘連蛋白基質(zhì)的典型神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，以及(c)顯示從這種球遷移出來 并具有神經(jīng)樣形態(tài)的細(xì)胞，與(a)中可見的成纖維細(xì)胞形態(tài)對比。圖3顯示SY5Y成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系的典型形態(tài)?？梢妴蝹€(gè)分化的神經(jīng)細(xì)胞從連 接至培養(yǎng)板的未分化細(xì)胞群中遷移出來(http://en. wikipedia. org/wiki/SHSY5Y)。圖4為如Li等人，2005所述的，使用X-VIV010培養(yǎng)基條件在單層培養(yǎng)物中擴(kuò)增分 離的集落時(shí)產(chǎn)生的神經(jīng)球的顯微照片。Bar = 50ym。圖5通過采用FITC偶聯(lián)二抗的免疫細(xì)胞化學(xué)法，對培養(yǎng)于X-VIV010培養(yǎng)基中 的未分化OMLP祖細(xì)胞中的神經(jīng)標(biāo)記物(a)神經(jīng)絲蛋白M (-ve)，(b) TUJ-1 (+ve)和(c) GFAP (+ve)，以及雪旺細(xì)胞標(biāo)記物(d)MBP (-ve)和(e) SlOO (+ve)的免疫定位。Bar = 50 μ m。 由于未觀察到信號，未顯示MAP2數(shù)據(jù)。圖6通過采用FITC偶聯(lián)二抗的免疫細(xì)胞化學(xué)法，對未分化的OMLP祖細(xì)胞中的神 經(jīng)標(biāo)記物(a)巢蛋白，(b)TUJ-I, (c)神經(jīng)絲蛋白M，(d)GFAP和(e)MAP2，以及雪旺細(xì)胞標(biāo) 記物(f)MBP和(g)S100的免疫定位(全部+ve)。Bar = 10 μ m(在圖6e中為50 μ m)。圖7顯示OMLP中胚胎和發(fā)育標(biāo)記物的陽性表達(dá)。通過RT-PCR確定在完整OMLP 消化物中胚胎標(biāo)記物(Nanog、0ct4、Sox2、KLF-4和hTERT)以及發(fā)育標(biāo)記物(Notch 1、2、3、 Delta 1和Jagged 2)的陽性表達(dá)。HuES9ESC RNA用作所有反應(yīng)的陽性對照。圖8顯示PC確實(shí)可以從OMLP分離，并且在體外快速擴(kuò)增。利用粘附區(qū)別由OMLP 消化物克隆擴(kuò)增PC(A)。從三位患者分離多個(gè)PC克隆，其顯示成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(A、B)和體外快速增殖，在達(dá)到細(xì)胞衰老之前總計(jì)> 50PDs(C、D、E)。圖9顯示OMLP PC表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物，并且不是造血或纖維細(xì)胞來源的。對擴(kuò)增 的克隆進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90、⑶105、⑶166和⑶44，以及造血/纖維細(xì)胞標(biāo)記物⑶；34和 CD45表達(dá)的FACS分析。從三位患者分離的PC克隆被證實(shí)為CD90+、CD105+、CD166+、CD44+、 CD34-和 CD45-。圖10顯示OMLP PC表達(dá)活性端粒酶。通過ICC，PC集落證明了端粒酶的表達(dá)㈧。 單層擴(kuò)增之后，通過Q-TRAP對表達(dá)定量。所有集落(n = 3)為活性端粒酶陽性(B、C、D)。 使用熱滅活(HI)作為對照。在丙烯酰胺凝膠上分離Q-TRAP產(chǎn)物證實(shí)了端粒重復(fù)序列“階 梯”效應(yīng)(E)。圖11顯示OMLP PC源自神經(jīng)嵴。在Jagged 1 (A、B、C)存在下，來自兩位患者的 PC的CFE顯著較高。通過ICC，在發(fā)育集落中通過神經(jīng)嵴標(biāo)記物(D)Snail, (E)Slug, (F) SoxlO, (G)Twist和(H)Notch 1的表達(dá)證實(shí)了神經(jīng)嵴來源。圖12顯示OMLP PC可以分化為間充質(zhì)細(xì)胞系。PC向下分化為間充質(zhì)細(xì)胞系。通 過Van Gieson's染色(A)和聚集蛋白聚糖ICC(B)證實(shí)向下分化為成軟骨細(xì)胞系。通過針 對鈣沉積的Von Kossa染色分析成骨細(xì)胞誘導(dǎo)(C)，以及通過針對脂滴的油紅0染色分析成 脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)(D)。圖13顯示OMLP PC上細(xì)胞表面(a，b)HLA I的表達(dá)水平。柱狀圖顯示OMLP-PC上 細(xì)胞表面(a，b)HLA I和(c，d)HLA II表達(dá)的表達(dá)水平和在IFNy存在/不存在時(shí)中熒光 強(qiáng)度的變化。注解紅色指示Ig對照，綠色指示第1天，藍(lán)色指示第2天，以及棕色指示第 7天。圖14顯示在未刺激的OMLP-PC中不存在HLA II蛋白。Western印跡證明在未刺 激的OMLP-PC中不存在HLA II蛋白，并且用IFNy刺激M小時(shí)之后誘導(dǎo)出HLA II蛋白。圖15顯示OMLP-PC對淋巴細(xì)胞增殖的非劑量依賴性抑制作用。單向MLC結(jié)果證 明OMLP-PC對淋巴細(xì)胞增殖的強(qiáng)效抑制作用。這些數(shù)據(jù)證明這種現(xiàn)象為非劑量依賴性的， 并且與通過用IFNy預(yù)刺激誘導(dǎo)HLA II表達(dá)無關(guān)。數(shù)據(jù)表示為CPM+/-標(biāo)準(zhǔn)差。這些數(shù) 據(jù)來自一個(gè)OMLP-PC克隆，但是代表了測試的所有克隆。***P < 0. 001通過單向ANOVA和 Bonferroni事后檢驗(yàn)確定。圖16顯示MSC對淋巴細(xì)胞增殖的可變的抑制作用。單向MLC結(jié)果顯示MSC對 淋巴細(xì)胞增殖的可變的抑制作用。這些數(shù)據(jù)證明這種現(xiàn)象為劑量依賴性的。數(shù)據(jù)表示為 CPM+/-標(biāo)準(zhǔn)差。圖17顯示OMLP-PC對T細(xì)胞增殖的非劑量依賴性抑制作用。單向MLC結(jié)果證明 OMLP-PC對T細(xì)胞增殖的強(qiáng)效抑制作用。這些數(shù)據(jù)證明這種現(xiàn)象為非劑量依賴性的，并且與 通過用IFNy預(yù)刺激誘導(dǎo)HLA II表達(dá)無關(guān)。數(shù)據(jù)表示為CPM+/-標(biāo)準(zhǔn)差。這些數(shù)據(jù)來自一個(gè) OMLP-PC克隆，但是代表了測試的所有克隆。< 0. 001通過單向ANOVA和Bonferroni 事后檢驗(yàn)確定。圖18顯示OMLP-PC對淋巴細(xì)胞增殖的非接觸依賴性抑制作用。單向MLC結(jié)果證明 OMLP-PC以非接觸依賴性方式對淋巴細(xì)胞增殖的強(qiáng)效抑制作用。這些數(shù)據(jù)證明這種現(xiàn)象為 非劑量依賴性的，并且與通過用IFN γ預(yù)刺激誘導(dǎo)HLA II表達(dá)無關(guān)。數(shù)據(jù)表示為CPM+/-標(biāo) 準(zhǔn)差。這些數(shù)據(jù)來自一個(gè)OMLP-PC克隆，但是代表了測試的所有克隆。***P<0.001通過單向ANOVA和Bonferroni事后檢驗(yàn)確定。圖19顯示OMLP-PC對T reg細(xì)胞的數(shù)量沒有作用。FACS結(jié)果證明0MLP-PC對T reg細(xì)胞數(shù)量沒有作用。這些數(shù)據(jù)證明這種現(xiàn)象為非劑量依賴性的，并且與通過用IFNy預(yù) 刺激誘導(dǎo)HLA II表達(dá)無關(guān)。數(shù)據(jù)表示為平均Reg細(xì)胞+/_標(biāo)準(zhǔn)差。這些數(shù)據(jù)來自3 位患者。圖20顯示OMLP-PC對⑶3+⑶38+激活的T細(xì)胞的作用。FACS結(jié)果證明當(dāng)與應(yīng)答 細(xì)胞以接觸或透孔(transwells)方式共培養(yǎng)時(shí)，OMLP-PC對⑶3+⑶38+激活的T細(xì)胞數(shù)量 的作用。這些數(shù)據(jù)證明這種現(xiàn)象為非劑量依賴性的，并且與通過用IFNy預(yù)刺激誘導(dǎo)HLA II表達(dá)無關(guān)。數(shù)據(jù)表示為平均％⑶3+⑶38+T細(xì)胞+/-標(biāo)準(zhǔn)差。這些數(shù)據(jù)來自3位患者。圖21顯示OMLP-PC對⑶3+⑶25+激活的T細(xì)胞的作用。FACS結(jié)果證明當(dāng)與應(yīng)答 細(xì)胞以接觸或透孔(transwells)方式共培養(yǎng)時(shí)，OMLP-PC對⑶3+⑶25+激活的T細(xì)胞數(shù)量 的作用。這些數(shù)據(jù)證明這種現(xiàn)象為非劑量依賴性的，并且與通過用IFNy預(yù)刺激誘導(dǎo)HLA II表達(dá)無關(guān)。數(shù)據(jù)表示為平均％⑶3+⑶25+T細(xì)胞+/-標(biāo)準(zhǔn)差。這些數(shù)據(jù)來自3位患者。材料和方法祖細(xì)胞的分離和維持培養(yǎng)從認(rèn)可的患者(n = 3)獲得正常的無疾病口腔粘膜活組織檢查樣品，所述患者都 在英國卡的夫大學(xué)(Cardiff University)的 University Hospital of Wales 的 School of Dentistry經(jīng)過常規(guī)牙科處理。本研究先前已獲得地方倫理委員會批準(zhǔn)，并且依照 Helsinki 規(guī)定(Helsinki convention)告知捐贈者。如先前(6)所述的，酶消化活組織檢查樣品后獲得單細(xì)胞懸浮液。在70%乙醇中 對組織進(jìn)行表面消毒(30秒)，剪掉組織上任何多余的脂肪，并將其剪成5mm2的塊。然后將 組織與分散酶(Sigma，UK ；cat. no P-3417 ；2mg/ml) 一起于4°C下孵育過夜，以利于分離上 皮和固有層組織。第二天將上皮組織從固有層組織剝離并丟棄。然后將OMLP組織機(jī)械切 碎，并與梭狀芽孢桿菌 A 膠原酶(Roche Life Sciences, UK ；cat. no 103 586 ； lmg/ml)于 37°C下分解過夜。在含血清的培養(yǎng)基(SCM)中制備分散酶和膠原酶溶液，所述培養(yǎng)基(SCM) 添加2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml兩性霉素B 和 10% (ν/ν)熱滅活胎牛血清[FCS] (cat. no 10270-106) (Dulbecco，s 改進(jìn) Eagle 培養(yǎng) 基[DMEM] (cat. no21969-035)。培養(yǎng)基和添加劑購自英國的hvitrogen。然后，釋放的細(xì) 胞在重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基之前成團(tuán)、清洗和再次成團(tuán)，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加2mML-谷氨酰胺、 100U/ml 青霉素 G、100y g/ml 硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml 兩性霉素 B (Dulbecco’ s 改進(jìn) Eagle 培養(yǎng)基[DMEM] (cat. no 21969-0 ))。隨后利用與纖維連接蛋白的粘附區(qū)別分離PC(10，15)。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的OMLP單 細(xì)胞懸浮液接種至牛血漿纖維連接蛋白(10 μ g/ml于4°C下在PBS+
中稀釋過夜；Sigma, UK ；cat. no F-4759)包被的6孔板 上，于37°C下孵育20分鐘。丟棄在此時(shí)間范圍內(nèi)未粘附的細(xì)胞，并讓粘附的細(xì)胞于37°C、 5% CO2的潮濕氣氛下在SCM中形成單細(xì)胞集落(> 32個(gè)細(xì)胞，從我們的分析中消除任何 可能的短暫擴(kuò)充細(xì)胞)。在通過用0.05% (w/v)胰蛋白酶/0.53mM乙二胺四乙酸(EDTA) (Invitrogen, UK ；cat. no 25300-054)的胰蛋白酶消化進(jìn)行分離克隆環(huán)內(nèi)的細(xì)胞之前，對 指定集落內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行手工計(jì)數(shù)，并且以2X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2的密度重新接種于SCM中。
在達(dá)到融合時(shí)，通過采用0.05% (w/v)胰蛋白酶/0. 53mM乙二胺四乙酸(EDTA) (Invitrogen, UK ；cat. no 25300-054)的胰蛋白酶消化并且使用上述密度重新接種而將細(xì) 胞傳代。通過如先前所述的(19)對每次傳代的細(xì)胞數(shù)量直接計(jì)數(shù)，得到細(xì)胞群在體外的群 體倍增數(shù)。培養(yǎng)克隆的PC群直至衰老，所述衰老定義為常數(shù)PD值/周< 0. 5，并通過細(xì)胞 形態(tài)學(xué)評估。克隆的異源擴(kuò)增本方法包括許多以上以標(biāo)題“祖細(xì)胞的分離和維持培養(yǎng)”描述的技術(shù)。然而，在利 用與纖維連接蛋白的粘附區(qū)別分離PC之后，在單培養(yǎng)上作為異源祖細(xì)胞群被傳代和擴(kuò)增 之前，使粘附的細(xì)胞生長至融合。用于胚胎和發(fā)育標(biāo)記物的RT-PCR采用Trizol (Invitrogen，UK)從整個(gè)OMLP消化物提取RNA。按照廠商的說明， 使用隨機(jī)六聚體引物和莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase) (Promega, UK)從總RNA中得到cDNA。按照廠商的說明，使用 GoTaq (ftOmega，UK)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，起始變性步驟為94°C，5分鐘，接著40個(gè)循 環(huán)94°C (1分鐘)，Ta(30秒)，72°C (1分鐘)，以及最后的延長步驟為72°C，10分鐘。針對 Nanog (17) [F 5，TGC TTA TTC AGG ACA GCC CT 3，和 R 5，TCT GGT CTT CTG TTT CTT GAC T 3' ]Ta 44°C, 0ct4(2°) [F 5' CGA CCA TCT GCC GCT TTG AG 3'和 R 5' CCC CCT GTC CCC CAT TCC TA 3，]Ta60°C，Sox2[F 5，AAC CCC AAG ATG CAC AAC TC 3’ 和 R 5，CGG GGC CGG TAT TTA TAA TC3，]Ta 55°C，KLF_4[F 5，ACC CAC ACA GGT GAG AAA CC 3，和 R 5，ATG TGT AAG GCG AGG TGG TC 3，]Ta 55°C，hTERT(21) [F 5，CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA 3，和 R 5’ GGA TGA AGC GGA GTC TGG A 3，]Ta 55°C,Notch 1[F 5’ CTA CCT GTC AGA CGT GGC CT 3’ 和 R 5’ CGC AGA GGG TTG TAT TGG TTC G 3，]Ta 56°C，Notch 2[F5’ AAG CAG AGT CCC AGT GCC TA 3，和 R 5，CAG GGG GCA CTG ACA GTA AT 3，]Ta 56°C,Notch 3[F 5，CAG TCG CCT GAG AAT GAT CAC 3’ 和 R 5' GAA TGA CCA GCA GCA AGA CAG 3' ]Ta 53°C,Delta 1[F 5，ATC CTT GTC CTC ATG CTG CT 3，和 R 5，GCC TTG AAG CCA TTC TTG TC3，]Ta 53 °C 以及 Jagged 2 [F 5，CTA CAA TGG TGG CAT CTG TG 3，和 R 5，GCG ATA CCC GTT GAT CTC AT 3，]Ta 53°C的表達(dá)分析cDNA。使用I^rimerf引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)未公開的引物(http:// frodo. wi. mit. edu/cRi-bin/primer3/primer3 www. crD。在瓊脂糖凝膠上分離 PCR 產(chǎn)物， 并且用0. 005% (ν/ν)溴化乙錠顯像。在所有反應(yīng)中使用HuES9 ESC系cDNA為陽性對照。流式細(xì)胞術(shù)用于流式細(xì)胞術(shù)的擴(kuò)增細(xì)胞通過用Accutase (Sigma，UK)處理傳代，并且在染 色之前計(jì)數(shù)。細(xì)胞懸浮液在磷酸緩沖鹽(PBS)中清洗兩次以去除殘留的血清，然后用三 種干細(xì)胞標(biāo)記物CD90-別藻藍(lán)蛋白(APC, R&D Systems, UK)，CD105-R-藻紅蛋白(RPE) 和⑶166-異硫氰酸熒光素(FITC)(所有抗體進(jìn)行1 50稀釋；Ancell Inc.，USA)于 4°C下進(jìn)行三重標(biāo)記45分鐘。細(xì)胞還使用與用于造血和纖維細(xì)胞標(biāo)記物⑶34-FITC和 CD45-RPE(1 50 ；Ancell Inc.，USA)相同的方法分別染色。將細(xì)胞于PBS中清洗兩次，然 后用2%多聚甲醛于冰上固定5分鐘。在檢測之前，將固定的細(xì)胞懸浮液稀釋于Iml的PBS 中。用配備488nm和633nm激光激發(fā)源的FACSCanto 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,UK)分析細(xì)胞，每個(gè)樣品記錄30，000個(gè)事件。熒光團(tuán)偶聯(lián)免疫球蛋白和單一染色用作各自 的對照。在用Flowjo 7. 2. 2版軟件(Tree Star Inc. , USA)分析之前，補(bǔ)償所有數(shù)據(jù)。定量端粒擴(kuò)增法^-TRAP)使用先前Wege等人2003 所述的合適的Q-TRAP方法對擴(kuò)增克隆中活性端 粒酶的存在進(jìn)行分析和定量。簡言之，將細(xì)胞以10，000個(gè)細(xì)胞/μ 1的濃度于冰上的 TRAPEze IX CHAPS 裂解緩沖液(Chemicon International, UK)中裂解 30 分鐘。將裂 解的細(xì)胞于4°C下以20，OOOxg離心20分鐘。使用干冰迅速冷凍裂解物上清液，并且在使 用之前貯藏于_80°C下。制備總計(jì)20 μ 1的mastermix混合液12. 5 μ 1 Sybr Green PCR mix (Applied Biosystems, UK) UOOng TS 引物[5，AAT CCG TCG AGC AGA GTT 3，]、50ng ACX 引物[5，GCG GCG CTT ACC CTT ACC CTA ACC 3，] (Kim 和 Wu(1997) (23)先前公開了引 物序列)和焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水，每次反應(yīng)加入5 μ 1，相當(dāng)于10，000個(gè)細(xì)胞的 量。加熱使裂解物滅活(85°C，30分鐘)，并且裂解緩沖液用作陰性對照。制作501mel細(xì) 胞裂解物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(范圍1-10，000細(xì)胞)，以計(jì)算端粒酶的相對表達(dá)。所有反應(yīng)進(jìn)行三 次，使用AbiPrism 7000序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，UK)，并且數(shù)據(jù)表示為相對于 501mel陽性對照細(xì)胞系的10，000個(gè)細(xì)胞的端粒酶表達(dá)百分率?？扇苄訨agged 1存在下的集落形成效率利用如上所述的與纖維連接蛋白的粘附區(qū)別確定集落形成效率(CFE)。在 SCM+/-Notch 配體、重組鼠 Jagged Ι/Fc 嵌合體(R&D Systems，UK ;50ng/ml)中培養(yǎng) 9 天 使集落形成。每3天替換培養(yǎng)基和Jagged 1。CFE表示為形成的集落總數(shù)(> 32個(gè)細(xì)胞)與初始粘附細(xì)胞數(shù)量的比率。免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)發(fā)育集落將連接至纖維連接蛋白包被的多孔平板的發(fā)育集落中的細(xì)胞于4°C 下、在冰甲醇丙酮(1 1)中固定20分鐘。在PBS中清洗細(xì)胞，然后用0.1%丁fiton X100 (Sigma, UK)于室溫下滲透化20分鐘(僅有p75神經(jīng)生長因子[NGF]受體、Twist、 Slug和SoxlO抗體)。按照抗體廠商的說明，用于端粒酶染色的固定細(xì)胞與2N鹽酸于 室溫下孵育20分鐘，然后用0. IM硼酸鈉中和5分鐘。隨后，在適當(dāng)?shù)难?Dako UK Ltd.，UK;1 20稀釋)中于室溫下封閉細(xì)胞30分鐘。細(xì)胞于4°C下與一抗孵育過夜 (p75 NGF 受體[ME20. 4]1 100，Twist[H-81] 1 50 ;Slug[G_18] 1 100 ；Santa Cruz Biotechnology Inc. ,Santa Cruz,CA ；Snail [Abl7732]1 50 ；SoxlO[Ab25978]1 50 ；端 粒酶[Ab5181]l 2000 ；Abeam Pic, UK ；Notch 1 [bTAN20] 1 5 ；Developmental Studies Hybridoma Bank,USA) 0于室溫下孵育四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)抗-兔、FITC抗-小 鼠(Dako UK Ltd.，UK)、FITC 抗-羊和 FITC 抗-大鼠(Sigma, UK) 二抗 1 小時(shí)。后神經(jīng)和雪旺細(xì)胞分化如先前所述的，固定、清洗和封閉細(xì)胞。在封閉之前，
用0.2%Triton xioo使與微管相關(guān)蛋白2(MAP2)抗體一起孵育的細(xì)胞滲透化。于
4°C下將細(xì)胞在一抗(MAP2[HM-2]1 400;膠質(zhì)纖維相關(guān)蛋白(GFAP) [GF_5] 1 200 ；神 經(jīng)元特異性β-微管蛋白III[TUJ-1]1 1000 ；神經(jīng)絲蛋白M(NFM) [Ab9034]l 500 ； S100[4C4. 9]1 50;髓磷脂堿性蛋白(MBP) [EP1448Y] 1 100 ；Abeam Pic, UK)中孵育過 夜。二抗的孵育如上所述。
使用包含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (Vector Laboratories，UK)的封固 劑復(fù)染可用的細(xì)胞核，并且使用配備Nikon DXM1200照相機(jī)和Nikon ACT-I軟件(Nikon UK Ltd.)的 Olympus Provis AX70 顯微鏡(Olympus Optical Co. , UK Ltd.)顯像。成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞的分化對擴(kuò)增克隆的單細(xì)胞懸浮液實(shí)施多個(gè)間充質(zhì)細(xì)胞系的分化誘導(dǎo)方案。成軟骨細(xì)胞分化置于微離心管中的單細(xì)胞懸浮液在Iml SCM中以5X IO5個(gè)/管 的濃度于1500轉(zhuǎn)/分鐘(RPM)下成團(tuán)。過夜使得細(xì)胞團(tuán)形成。用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加 Ix胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒(ITS)添加劑(Invitrogen，UK)、50μ g/ml L-抗壞血酸鹽(Sigma, UK)和5ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子β 1 (TGF^ 1) (Peprotech EC Ltd.，UK)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)替代 SCM0每2天更換培養(yǎng)基，并且在吸出條件培養(yǎng)基之前離心細(xì)胞團(tuán)。持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)達(dá)到21 天。成骨細(xì)胞的分化將細(xì)胞以3X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2的濃度接種于6孔培養(yǎng)皿中。在 SCM中培養(yǎng)細(xì)胞直至達(dá)到融合，此時(shí)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加10% (v/v)FCS、2mM L-谷氨 酰胺、100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml兩性霉素B,50 μ g/ml L-抗 壞血酸鹽、10 μ M地塞米松和5mM β -甘油磷酸鹽(Sigma，UK)的Alpha改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基 (α-MEM) (Invitrogen,UK))替代培養(yǎng)基。每3天向培養(yǎng)物補(bǔ)充成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)總計(jì) 21天。成脂肪細(xì)胞的分化將細(xì)胞以3 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2的濃度接種于6孔培養(yǎng)皿中。在 SCM中培養(yǎng)細(xì)胞直至達(dá)到融合，此時(shí)用成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加10 μ g/ml胰島素、1 μ M地 塞米松、100 μ M吲哚美辛、100 μ M 3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤[IBMX] (Sigma，UK)的SCM) 替代培養(yǎng)基長達(dá)3天。然后，用成脂肪細(xì)胞維持培養(yǎng)基(添加10 μ g/ml的SCM)進(jìn)一步孵 育細(xì)胞1天。細(xì)胞在誘導(dǎo)和維持培養(yǎng)的循環(huán)中重復(fù)培養(yǎng)總計(jì)觀天。神經(jīng)元和雪旺細(xì)胞的分化在限定的ESC培養(yǎng)基04)中培養(yǎng)和擴(kuò)增分離的集落。如先前所述，將集落用胰 蛋白酶消化，并且接種至人層粘連蛋白包被的多孔板Oyg/Cm2;Sigma，UK)上。細(xì)胞在 X-VIVOtmIO 培養(yǎng)基(Lonza Group Ltd.，UK)中維持，所述 X-VIVOtmIO 培養(yǎng)基添加了 0. ImM β-巰基乙醇(Sigma, UK) U % (ν/ν)非必需氨基酸(Invitrogen, UK) U00U/ml 青霉素 G、 100 μ g/ml硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml兩性霉素B和80ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因 子(rhbFGF)(Peprotech EC Ltd.，UK)。將細(xì)胞傳代，并且通過于37°C下在lmg/ml梭狀芽孢桿菌膠原酶IV (Invitrogen， UK)中孵育分解神經(jīng)球5-10分鐘，隨后機(jī)械分解。使用先前描述的方案(16，17)將細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元分化。簡言之，對單細(xì)胞懸浮液 計(jì)數(shù)，并以5. 6 X IO3個(gè)細(xì)胞/cm2接種于0. 1 % Matrigel (BD Biosciences, UK)包被的腔室 培養(yǎng)玻片上，所述腔室培養(yǎng)玻片置于添加了 40ng/ml hrbFGFU0% (v/v)FCS、2mM L-谷氨酰 胺、100U/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性霉素B的DMEM-F12 (3 1) 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)細(xì)胞7天，每3天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)7天之后，去除培養(yǎng)基中的hrbFGF，并 用lOng/ml神經(jīng)生長因子(NGF)、10ng/ml腦源性生長因子(BDNF)和lOng/ml神經(jīng)營養(yǎng)因 子3(ΝΤ;3)替代。再培養(yǎng)細(xì)胞7天，每3天更換培養(yǎng)基。雪旺細(xì)胞的分化如Toma等人Q005) (18)先前所描述的。將膠原酶處理的細(xì)胞以與用于神經(jīng)元分化的密度相等的密度接種于聚-D-賴氨酸層粘連蛋白包被的腔室培養(yǎng)玻 片上Qyg/ml)。細(xì)胞在DMEM-F12(3 1)中培養(yǎng)7天，所述DMEM-F12 (3 1)添加10% (v/v)FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素GUOO μ g/ml硫酸鏈霉素和0. 25 μ g/ml兩性 霉素B。然后，用neurobasal培養(yǎng)基(InvitrogenjK)替代培養(yǎng)基，所述neurobasal培養(yǎng) 基含有 (v/v)FCS, 1% (ν/ν)Ν2 添加劑 Qnvitrogen,UK)、4 μ M 毛喉素(Sigma，UK)、2mM L-谷氨酰胺、lOOU/ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml兩性霉素B和lOng/ml heregulin β 1 (Peprotech EC Ltd. , UK)。在該培養(yǎng)基中進(jìn)一步維持細(xì)胞7天。每3天更 換培養(yǎng)基，將50%的條件培養(yǎng)基再應(yīng)用于細(xì)胞。免疫組織化學(xué)取培養(yǎng)21天之后的分化的成軟骨細(xì)胞團(tuán)的10 μ m冷凍切片。在PBS中清洗切片 10分鐘，然后于室溫下在羊血清(1 20 ；Dako UK Ltd.，UK)中封閉30分鐘。于4°C潮濕 的箱內(nèi)，將切片在聚集蛋白聚糖抗體[1 50 ；6B4] (Cardiff University,Bruce Caterson 教授饋贈)中孵育過夜。隨后在PBS中清洗切片10分鐘，并且于室溫下與抗-小鼠二抗 (1 50 ；Dako UK Ltd.，UK)孵育1小時(shí)。在PBS中清洗切片，然后在蓋玻片下用熒光封固 介質(zhì)(fluorescence mounting medium) (Dako UK Ltd.，UK)封固。如先前 ICC 所述的，對 載玻片顯像。組織學(xué)成軟骨細(xì)胞團(tuán)的Van Gieson's染色如先前所述的，制備從成軟骨細(xì)胞分化的細(xì) 胞團(tuán)切出的冷凍切片。在水中清洗切片，然后用天青石藍(lán)染色5分鐘。切片用水沖洗，然 后用Mayer’ s蘇木素進(jìn)一步染色5分鐘。切片在水中清洗，然后在包含1 % (ν/ν)鹽酸的 70% (ν/ν)乙醇中分化。切片在自來水中進(jìn)一步清洗5分鐘，然后用Van Gieson's染色3 分鐘。再次清洗載玻片片，然后在蓋玻片下用DPX封固劑(Sigma，UK)封固。用于成骨細(xì)胞分化的Von Kossa染色于4°C下，在70% (ν/ν)乙醇中固定分化 的細(xì)胞過夜。在PBS中清洗細(xì)胞，然后于黑暗中與5% (w/v)硝酸銀(Sigma，UK)孵育5分 鐘。清洗之后，在包含5% (w/v)碳酸鉀的10% (ν/ν)甲醛溶液中孵育細(xì)胞2分鐘。細(xì)胞 在水中充分清洗15-20分鐘，然后在Farmers還原劑(0. 1% (w/v)硫代硫酸鈉和0. 1% (w/ ν)鐵氰化鉀)中孵育30秒。顯像之前，在水中進(jìn)一步清洗細(xì)胞15-20分鐘。用于成脂肪細(xì)胞分化的油紅0染色于室溫?cái)嚢柘?，?0% (ν/ν)異丙醇(Sigma， UK)中清洗固定于70%乙醇中的分化細(xì)胞5分鐘。于室溫?cái)嚢柘?，用油紅0(含0.25% (w/ ν)油紅0(Sigma，UK)的異丙醇)將細(xì)胞染色10分鐘。在用水清洗和顯像之前，細(xì)胞在60% (ν/ν)異丙醇中簡單沖洗。用于成脂肪細(xì)胞標(biāo)記物的RT-PCR采用Trizol (Invitrogen,UK)從0MLP-PC分化的成脂肪細(xì)胞中提取RNA。按照廠 商的說明，使用隨機(jī)六聚體引物和莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(!Iomega，Μ)，從0. 5 μ g 總RNA中生成cDNA。按照廠商的說明，使用GoTaq (Promega,UK)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，起
始變性步驟為94°C，5分鐘，接著40個(gè)循環(huán):94°C (1分鐘)，Ta(30秒)，72°C (1分鐘)，以 及最后延長步驟為72°C，10分鐘。針對脂蛋白脂肪酶的表達(dá)[F 5’ CCT GCT CGT GCT GAC TCT GG 3，禾口 R 5，CAT CCT GTC CCA CCA GTT TGG 3，]，CAATT/CAATT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 α [CEBP α ] [F 5' CCG GCC TCT TCC CTT ACC AG 3'禾P R 5' CCA CCG ACT TCT TGG CCT TG3’]以及過氧化物酶體增殖物激活的受體Y [PPAR γ ] [F 5’ CCA CAG GCC GAG AAG GAG AA 3，和R 5，CCA GCA GCC CTG AAA GAT GC3，]分析cDNA。使用Primerf引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì) (http://frodo.wi.mit. edu/cRi-bin/primer3/primer3 www, cri)設(shè)計(jì)弓I物。在瓊月旨糖凝 膠上分離PCR產(chǎn)物，并且用0.005% (ν/ν)溴化乙錠顯像。免疫調(diào)節(jié)活性O(shè)MLP-PC的細(xì)胞培養(yǎng)如先前所述的，于37°C，5% 0)2下，在含血清的培養(yǎng)基(SCM)中單層培養(yǎng)之前建立 的OMLP-PC克隆。對于需要用IFNy刺激的克隆，在用添加100U/ml IFNy的SCM刺激之 前，使細(xì)胞生長至60%融合。將細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中維持1、2或7天。第3天更換培養(yǎng)基， 并且用新鮮IFNy重新刺激細(xì)胞。OMLP-PC細(xì)胞外的HLA I和II表達(dá)的FACs分析OMLP-PC在含有/不含100U/ml IFN γ的情況下生長，并且在刺激后的第1、2和7 天通過FACS分析HLA I和II的表達(dá)。去除細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，并且貯存于_80°C下用于進(jìn)一步分析。用PBS清洗細(xì)胞， 然后使用ACCUtaseTM(Sigma，UK)從塑料制品上分離細(xì)胞，然后再次在PBS中清洗。細(xì)胞于 1700RPM下離心5分鐘，除去上清液，并且將細(xì)胞重懸于含0. 牛血清蛋白(BSA)的PBS 中。該步驟重復(fù)一次。于室溫下、黑暗中，將細(xì)胞與HLA-I或HLA-II抗體(1 50稀釋； Dako, UK)孵育15分鐘。與抗體孵育之后，細(xì)胞再次離心，并且在含0. 1% BSA的PBS中清 洗。細(xì)胞再次成團(tuán)，然后重懸于200ul含0. 1 % BSA的PBS中，用于如先前所述的FACSCanto 流式細(xì)胞儀(BD Biosciences, UK)分析。用于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外HLA I和II表達(dá)分析的Western印跡OMLP-PC在含有/不含100U/ml IFN γ的情況下生長，并且在刺激后第1、2和7天 通過Wfestern印跡分析HLA I和II的表達(dá)。在PBS中清洗細(xì)胞，然后于包含l%Triton X-100/0. 25M 蔗糖的 Complete 蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science,UK)中裂解細(xì)胞。 將蛋白質(zhì)提取物超聲處理以釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，然后使用BCA蛋白分析(PiercejK)定量。在12%丙烯酰胺的分離凝膠上檢測蛋白質(zhì)提取物(5ug)以分離蛋白質(zhì)，然后于 4°C，30V下轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜過夜。膜用包含5%脫脂奶粉(Biorad，UK) ,0. l%Tween 20 (TBS-T)的Tris緩沖鹽封閉，在含0. ι %Tween 20 (PBS-T)的PBS中清洗3次，與HLA II抗體(1 250稀釋于2%脫脂奶粉；Dako，UK)于室溫下孵育1小時(shí)。膜在PBS-T中清 洗3次，然后用抗小鼠馬-辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗(1 3000稀釋于2%脫脂奶 粉中；BioradjK)于室溫下孵育1小時(shí)。膜隨后在PBS-T中清洗2次，在PBS中清洗一次， 然后通過ECL 檢測(GE Healthcare, UK)來檢測蛋白。通過混合的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(MLC)確定OMLP-PC對淋巴細(xì)胞增殖的作用OMLP-PC在含有/不含100U/ml IFN γ的情況下生長，并且在刺激后第7天通過 MLC分析。細(xì)胞在使用ACCUtaseTM(Sigma，UK)從塑料制品上被分離之前用PBS清洗，并且 再次在RPMI培養(yǎng)基中清洗，所述RPMI培養(yǎng)基包含10%人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ ml青霉素G、100 μ g/ml硫酸鏈霉素、0. 25 μ g/ml兩性霉素B。細(xì)胞于1700RPM下離心5分 鐘，然后重懸于上述RPMI培養(yǎng)基中用于計(jì)數(shù)。細(xì)胞用20GyY射線輻射，用于確立MLC。外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)如先前所述05)制備。簡言之，通過600xg下的Ficoll-Hypaque密度梯度離心20分鐘，從肝素化的血液中純化PBL。在上述RPMI培養(yǎng)基 中，應(yīng)答PBL(A)與來自供體池(Px)或自體同源對照(Ax)的等量的輻射刺激物PBL—起 孵育。將輻射的OMLP-PC以相對于應(yīng)答物100% -0. 001%的比率添加至培養(yǎng)物中，并且于 37°C，5%C02下孵育5天。培養(yǎng)物在氚代胸腺嘧啶脫氧核苷摻入(IuCi)M小時(shí)之后的第6 天冷凍。第7天，將培養(yǎng)物解凍并且記錄增殖。用TomTec收獲機(jī)(Harvester 96,Tomtec, Orange, CT, USA)于玻璃纖維過濾器上自動收獲細(xì)胞。通過混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物確定在T細(xì)胞絲裂原存在下對淋巴細(xì)胞增殖的作用如上所述，建立標(biāo)準(zhǔn)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(MLC)MLC，以相對于應(yīng)答細(xì)胞1 1至 0.01 1的比率添加OMLP-PC。將T細(xì)胞絲裂原-植物血凝素(PHA)以10ug/ml添加至培 養(yǎng)物。如上所述，第4天記錄增殖。確定OMLP-PC誘導(dǎo)的免疫抑制是否為接觸依賴性的如先前所述，在12孔板格式中建立MLC。將OMLP-PC以相對于應(yīng)答細(xì)胞0. 1 1 至0. 01 1的比率添加至培養(yǎng)物。接觸培養(yǎng)物包括被直接添加至MLC培養(yǎng)物的0MLP-PC。 透孔培養(yǎng)物包括被接種至具有0. 4um孔徑膜的插入物上的0MLP-PC。這將細(xì)胞與直接接觸 應(yīng)答細(xì)胞分開，但是確保它們共有相同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)物維持培養(yǎng)5天，然后去除PBL并且 再裝入96孔板中，然后于37°C下，用氚代胸腺嘧啶脫氧核苷刺激M小時(shí)。如先前所述記錄 增殖。如下所述，去除一部分PBL用于FACS分析。針對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和T細(xì)胞激活標(biāo)記物對刺激的PBL的FACS分析將從透孔和以上接觸研究中去除的PBL于1700RPM下離心5分鐘。將上清液去除， 并且貯存于-80°C下用于進(jìn)一步研究。于含0. BSA的PBS中重懸并且清洗細(xì)胞團(tuán)。如 先前所述，制備用于FACS的細(xì)胞用于HLA I和II檢測。針對⑶38、⑶3、⑶25和⑶4或者 ⑶25、⑶3、⑶127和⑶4對細(xì)胞進(jìn)行四重標(biāo)記。將自體同源對照和A+Px細(xì)胞孵育物用作對 照。結(jié)果OMLP中胚胎和發(fā)育標(biāo)記物的表達(dá)表明祖細(xì)胞群的存在RT-PCR證實(shí)胚胎和多能標(biāo)記物Nanog和0ct4在整個(gè)OMLP組織消化物中的陽性 表達(dá)。在組織分離物中還檢測到人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的表達(dá)，這表明存在位于OMLP 中端粒酶陽性的細(xì)胞亞群。在整個(gè)組織中還存在iPS標(biāo)記物Sox2和KLF-4 (以及Nanog和 0ct4)。在整個(gè)OMLP消化物中，與Notch信號通路相關(guān)的發(fā)育標(biāo)記物Notch受體1、2和3， 以及Notch配體Delta 1和Jagged 2的表達(dá)也是陽性，表明存在未成熟細(xì)胞類型和正在進(jìn) 行Notch信號傳輸(圖7)。PC群可以從OMLP可靠的分離并且在體外進(jìn)行快速增殖在我們的實(shí)例中，通過與纖維連接蛋白的粘附區(qū)別，已從OMLP分離出PC。如先前 報(bào)道的，干細(xì)胞和祖細(xì)胞群的一個(gè)特征在于它們通過形成源自單細(xì)胞的集落的自我更新能 力。這種OMLP纖維連接蛋白粘附的細(xì)胞群從單個(gè)粘附的細(xì)胞成功地生成克隆，并且在發(fā)育 的集落和擴(kuò)增的克隆中證明成纖維樣形態(tài)，本質(zhì)上的雙極性(圖8A和B)。這種細(xì)胞群的 特征在于高的初始增殖率(平均> 4PDs/周)，然后確立IPD/周的恒定水平，并且以大約 50-60PD到達(dá)細(xì)胞衰老(圖8C-E)。這些生長動力學(xué)參數(shù)代表了從所有患者分離和擴(kuò)增的全部克隆。OMLP PC表達(dá)細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)記物在使用在此所述的流式細(xì)胞術(shù)方法確定干細(xì)胞系列標(biāo)記物STR0-1、⑶44、⑶146、 ⑶90、⑶105、⑶166，以及造血和纖維細(xì)胞標(biāo)記物⑶34和⑶45表達(dá)之前，以單層培養(yǎng)擴(kuò)增克 隆。來自所有被測試患者的全部克隆都被證明STR0-1、⑶44、⑶146、⑶90、⑶105和⑶166 的陽性表達(dá)，但是CD34和CD45為陰性(圖9，STR0-1和⑶146的數(shù)據(jù)未示出)。OMLP PC表達(dá)活性端粒酶通常認(rèn)為除了干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞之外，體細(xì)胞中端粒酶活性被降低。相反地，已證 明人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)缺少端粒酶活性，盡管它們具有干細(xì)胞特性(3)。通過ICC評估 發(fā)育的OMLP集落中端粒酶的表達(dá)，并且通過Q-TRAP評估來自所有患者的擴(kuò)增克隆中端粒 酶的表達(dá)。在測試的全部發(fā)育集落中證明了端粒酶的陽性表達(dá)(圖10A)，并且在擴(kuò)增的克隆 中維持端粒酶的陽性表達(dá)(圖10B-D)。在丙烯酰胺凝膠上分離Q-TRAP產(chǎn)物，證實(shí)了與端粒 重復(fù)序列擴(kuò)增一起觀察到典型的“階梯”效應(yīng)(圖10E)。擴(kuò)增克隆中的端粒酶的相對水平 是患者特異性的，但是相同患者的克隆之間變化不大，與達(dá)到細(xì)胞衰老的克隆相匹配的患 者的總?cè)后w倍增(PDs)之間的小差異相關(guān)(圖8B)。源自神經(jīng)嵴的OMLP PC已證明通過可溶性Jagged 1或γ -分泌酶抑制劑暴露減弱Notch信號傳導(dǎo)，這 對MSC和神經(jīng)嵴干細(xì)胞(NCSC)的增殖有不同的作用。先前已報(bào)道的Y-分泌酶抑制劑 N-[N-3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸t(yī)-丁酯(DAPT)減緩了 MSC的生長，最 終導(dǎo)致細(xì)胞分裂被抑制。相反地，NCSC暴露于可溶性Jagged 1抑制細(xì)胞的神經(jīng)元分化，并 且因此使得增殖和擴(kuò)增增加。發(fā)現(xiàn)在可溶性Jagged 1存在下，OMLP PC的集落形成效率(CFE)顯著高于(P <0. 05)對照培養(yǎng)基中的CFE (圖11A-B)，支持了在NCSC中觀察到的結(jié)果，并且由此表明 此PC群是神經(jīng)嵴來源的。為進(jìn)一步證實(shí)OMLP PC的神經(jīng)嵴來源，在發(fā)育集落中通過ICC研 究了限定的神經(jīng)嵴標(biāo)記物和發(fā)育標(biāo)記物Notch 1的產(chǎn)量。轉(zhuǎn)錄因子SOX10、Snail、Slug和 Twist肯定主要定位于細(xì)胞核，但是還發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)隔室(compartment)中(圖11C-G)。在 PC的細(xì)胞質(zhì)中鑒定了 Notch 1。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持此PC群是神經(jīng)嵴來源的。在利用與纖維連接蛋白的粘附區(qū)別分離的細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)另外的神經(jīng)嵴標(biāo)記物p75 神經(jīng)生長因子(NGF)的表達(dá)(圖1)。在粘附至發(fā)育集落頂部的細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)這種標(biāo)記物的陽 性表達(dá)。這些細(xì)胞顯示出與發(fā)育集落中的那些細(xì)胞相當(dāng)不同的形態(tài)。這些數(shù)據(jù)表明，除了 在此表征的P75-細(xì)胞群外，還存在仍然未表征的p75+細(xì)胞群。OMLP PC為多能的，并且可以生成多細(xì)胞系細(xì)胞來自多克隆的OMLP PC向下分化為間充質(zhì)和神經(jīng)來源的細(xì)胞系。軟骨細(xì)胞分化的證據(jù)是通過細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)物中膠原蛋白和聚集蛋白聚糖 (aggrecan)的產(chǎn)生而證明的(圖12A和B)。在成骨細(xì)胞分化PC培養(yǎng)物中觀察到礦化(圖 12C)。利用油紅0染色在成脂肪細(xì)胞刺激的培養(yǎng)物中觀察到脂滴，并且針對標(biāo)記物脂蛋白 脂肪酶、CEBP-α和PPAR γ的RT-PCR測試為陽性(圖12D ;RT_PCR數(shù)據(jù)未示出)。這些數(shù) 據(jù)證實(shí)OMLP PC為多能的，并且能夠產(chǎn)生間充質(zhì)細(xì)胞類型成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，如先前針對從多個(gè)位置如骨髓和牙髓分離的干細(xì)胞所證明的。采用在SCM中以單層連續(xù)擴(kuò)增的PC不可能分化神經(jīng)元和雪旺細(xì)胞(數(shù)據(jù)未示 出)。為了確實(shí)地誘導(dǎo)神經(jīng)元和雪旺細(xì)胞分化，克隆在層粘連蛋白包被的平板中在限定的 ESC培養(yǎng)基存在下以單層擴(kuò)增。PC的形態(tài)隨著在這些限定的條件下的孵育而變化，伴有明 顯的神經(jīng)球樣體的形成(圖2A和4)，與來自SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞中觀察到的 現(xiàn)象相似(圖幻。利用限定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，擴(kuò)增的克隆夠能向下成功地分化成神經(jīng)元細(xì)胞 系，如用ICC通過神經(jīng)標(biāo)記物巢蛋白、TUJ-I (β -III微管蛋白)、NFM、GFAP和ΜΑΡ2的陽性表 達(dá)所檢測的(圖6B-F)，以及分化成雪旺細(xì)胞系，如通過雪旺細(xì)胞特異性標(biāo)記物MBP和SlOO 的陽性表達(dá)而檢測的(圖6G和H)。在分化之前，克隆僅表達(dá)TUJ-l(i3-III微管蛋白)、 GFAP和S100，但是這比分化時(shí)觀察到的水平的程度低很多(圖5B、C和E)。OMLP PC具有免疫調(diào)節(jié)性O(shè)MLP-PC在它們的細(xì)胞表面表達(dá)HLA I但是不表達(dá)HLA IIFACS分析證實(shí)未刺激的OMLP-PC克隆在它們的細(xì)胞表面表達(dá)HLA I，但是不表達(dá) HLA 11(圖13a和b)。用100U/ml IFN γ刺激M小時(shí)之后，HLA I表達(dá)上調(diào)，但是直到第 7天才誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)HLA 11(圖13c和d)。來自被分析的3位患者中每一個(gè)的3個(gè)克 隆的這些結(jié)果是一致的。用IFN γ刺激M小時(shí)之后OMLP-PC表達(dá)細(xì)胞內(nèi)HLA II對來自在含有/不含100U/ml IFN γ下孵育1、2或7天的OMLP-PC克隆的總蛋白 提取物進(jìn)行Western印跡分析。印跡證實(shí)在未刺激的OMLP-PC中，細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)都未檢 測到HLA II的表達(dá)(圖14)。用IFNy刺激，M小時(shí)之后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HLA II的表達(dá)(圖 14)，但是從上述FACS結(jié)果，我們可以假設(shè)這種蛋白直到第7天才被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜。這些數(shù) 據(jù)代表被測試的全部克隆和患者。OMLP-PC的強(qiáng)效免疫抑制性，并且可以直接作用于T細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(MLC)培養(yǎng)證明，利用來自其他多種供體的集聚的淋 巴細(xì)胞孵育觀察到對應(yīng)答細(xì)胞的巨大增殖作用。在自體同源對照培養(yǎng)物中觀察到，向培養(yǎng) 物添加OMLP-PC抑制這種增殖作用回復(fù)至基礎(chǔ)水平。有趣地，顯示這種作用是非劑量依賴性的，證明98-99%的淋巴細(xì)胞增殖被抑制， 無論是否以相對于應(yīng)答細(xì)胞10%或0.001 %的比率添加OMLP-PC(圖15)。還觀察到用 IFN γ預(yù)先刺激7天的OMLP-PC與那些未刺激的細(xì)胞有相似的抑制水平，表明這種作用不依 賴于HLA II表達(dá)(圖15)。當(dāng)與使用間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為免疫抑制刺激物的培養(yǎng)物直接對比時(shí)，顯示 出對淋巴細(xì)胞增殖的劑量依賴性作用(圖16)。使用10%比率的MSC實(shí)現(xiàn)95%的淋巴細(xì) 胞增殖，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量降低至0. 001 %時(shí)，僅觀察到有65%的抑制。這等同于以相對于應(yīng)答細(xì) 胞0.001%的比率，OMLP-PC抑制淋巴細(xì)胞增殖的有效性平均起來為33倍多。另外，與用 OMLP-PC克隆觀察到的準(zhǔn)確重復(fù)相比，采用MSC培養(yǎng)物觀察到重復(fù)序列之間巨大的變化。在T細(xì)胞絲裂原-PHA存在下進(jìn)行的MLC培養(yǎng)顯示OMLP-PC能減少T細(xì)胞增殖，直 接回復(fù)至基礎(chǔ)水平，與用IFNy預(yù)先刺激無關(guān)(圖17)。這些結(jié)果證實(shí)OMLP-PC可以直接作 用于T細(xì)胞，雖然仍然不清楚這是否是通過與上述單向MLC淋巴細(xì)胞抑制中觀察到的機(jī)制 相同。
使用非接觸依賴性機(jī)制OMLP-PC具有免疫抑制性使用OMLP-PC直接接觸或與應(yīng)答細(xì)胞一起透孔培養(yǎng)進(jìn)行單向MLC。獲得的數(shù)據(jù)證 明OMLP-PC的強(qiáng)效免疫抑制作用，與PC直接接觸的細(xì)胞和沒有直接接觸的細(xì)胞相比，淋巴 細(xì)胞增殖之間沒有顯著差異(圖18)。與處理無關(guān)，觀察到淋巴細(xì)胞增殖被完全抑制，回復(fù) 到基礎(chǔ)水平。這種作用也不依賴于在檢測中使用的OMLP-PC的濃度，并且與在MLC檢測中 使用之前用IFNy預(yù)先刺激細(xì)胞無關(guān)。OMLP-PC的免疫抑制機(jī)制可能依賴于培養(yǎng)方法在與OMLP-PC接觸和透孔共培養(yǎng)MLC之后，F(xiàn)ACS分析恢復(fù)的外周血淋巴細(xì)胞 (PBLs)，確定T細(xì)胞亞群的水平。已證明被稱為T reg細(xì)胞的⑶3+、⑶4+和⑶127低表達(dá) 的T細(xì)胞在與集聚的供體淋巴細(xì)胞孵育時(shí)數(shù)量增至三倍。這些數(shù)量似乎并不隨著向培養(yǎng)物 添加OMLP-PC而變化，與用IFN γ預(yù)先刺激或接觸無關(guān)(圖19)。激活的T細(xì)胞水平的變化被再歸類為表達(dá)C38+和⑶3+、⑶25+(IL_2受體)的成 熟CD3+T細(xì)胞，并且對其分析。有趣地，雖然觀察到的與細(xì)胞-細(xì)胞接觸相關(guān)的免疫抑制水 平?jīng)]有差異，但是在透孔培養(yǎng)系統(tǒng)中觀察到激活的CD3+、CD38+T細(xì)胞的水平下降(圖20)， 以及在接觸系統(tǒng)中觀察到⑶3+⑶25+T細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖21)。這些作用不依賴于用IFNy預(yù) 先刺激。未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，生成的圖為來自3位患者的平均百分比。討論ASC群已經(jīng)成為用于許多組織工程應(yīng)用的多能未分化細(xì)胞的值得注意的來源。由 于它們在體外快速擴(kuò)增，但仍然達(dá)到有限水平的能力，限制了對移植潛在的致瘤影響的擔(dān) 心，它們具有明顯的優(yōu)于ESC和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)的優(yōu)勢。此外，這些細(xì)胞是多能的， 刺激時(shí)易于分化，并且沒有關(guān)于使用干細(xì)胞成體來源的現(xiàn)行的倫理或法律問題。在本研究中，我們首次證明存在固有于OMLP中的新PC群。這些細(xì)胞可以在體外 由單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)增，生成用于精確表征的同源細(xì)胞群。這種富集過程在產(chǎn)生和擴(kuò)增足夠 細(xì)胞數(shù)量的ASC群用于治療應(yīng)用上提供了明顯的優(yōu)勢。我們已特意使用細(xì)胞的克隆群(而 不是來自未分選的整個(gè)組織的異源分離物)用于這種表征研究，因?yàn)檫@樣能夠準(zhǔn)確定義純 細(xì)胞群。與未分選的或整個(gè)組織分離物相比，這還提供了有關(guān)移植時(shí)這些細(xì)胞如何響應(yīng)和 分化的更為精確的表征。干細(xì)胞/克隆分選的優(yōu)勢先前已被Kotobuki等人Q004)證明， 他們證明用于骨組織工程應(yīng)用的分選的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的成骨潛能增強(qiáng)06)?？寺U(kuò)增的OMLP PC 通過陽性表達(dá) STR0_1、CD44、CD146、CD90、CD105 和 CD166，而 ⑶34和⑶45為陰性而被理想地表征，排除了造血或纖維細(xì)胞來源。這些數(shù)據(jù)還證實(shí)OMLP PC具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的表達(dá)情況(XT)。單層培養(yǎng)中的擴(kuò)增已證實(shí)這些細(xì)胞將 經(jīng)歷快速擴(kuò)增期，但是壽命有限，在大量細(xì)胞群倍增之后(>50PDs)進(jìn)入復(fù)制衰老。與 MSC相反(3)，在發(fā)育集落中和大規(guī)模傳代之后，OMLP PC顯示活性端粒酶的表達(dá)，為分離的 OMLP細(xì)胞的干細(xì)胞顯型提供進(jìn)一步支持。在粘附至纖維連接蛋白的發(fā)育集落中，CFE在Notch配體、可溶性Jagged 1的存 在下增加以及神經(jīng)嵴標(biāo)記物Slug、Snail、TWiSt和SoxlO的表達(dá)，證實(shí)這些細(xì)胞的神經(jīng)嵴來 源。這些細(xì)胞在體內(nèi)的顱面位置表明這種細(xì)胞群產(chǎn)生于頭部神經(jīng)嵴區(qū)域，這由這種細(xì)胞群 產(chǎn)生間充質(zhì)和外胚層來源的細(xì)胞系的可塑性作為證據(jù)支持的證據(jù)，所述細(xì)胞系包括成骨細(xì) 胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和雪旺細(xì)胞。有趣地，OMLP PC能夠產(chǎn)生的多能性和細(xì)胞系情況，可與在顱面區(qū)域中限定的NCSC的多能性和細(xì)胞系情況相比較。我們的數(shù)據(jù)簡潔地證明了 OMLP-PC的強(qiáng)效免疫調(diào)節(jié)能力。在以上討論的研究中，我們已經(jīng)證明了 OMLP-PC與成體和胎兒MSC類似，在它們的 細(xì)胞表面表達(dá)HLA I而不表達(dá)HLA II (28, 29) ο胎兒和成體MSC中HLA I和II的表達(dá)水平 之間的差異歸因于用IFNY刺激細(xì)胞。此處已證明與IFNY —起孵育對-48小時(shí)，顯示成 體MSC上調(diào)它們的細(xì)胞表面表達(dá)的HLA II (29)，然而在胎兒MSC中，誘導(dǎo)細(xì)胞表面表達(dá)HLA II需要刺激7天。在OMLP-PC中，我們證明了對IFN γ刺激胎兒MSC樣的應(yīng)答，直至第7天 才觀察到細(xì)胞表面表達(dá)。相反地，在OMLP-PC中，通過Wfestern印跡于刺激M小時(shí)內(nèi)可檢 測到細(xì)胞內(nèi)HLA II的水平。這是與在成體和胎兒MSC中報(bào)道的相似的應(yīng)答時(shí)間08，四)。在MLC培養(yǎng)物中，證明OMLP-PC對應(yīng)答淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)效免疫抑制作用，抑制淋巴 細(xì)胞增殖回復(fù)至基礎(chǔ)水平。在這種應(yīng)答中，證明98-99%的細(xì)胞是有作用的，并且這種作用 不依賴于使用的OMLP-PC與應(yīng)答細(xì)胞的比率，以及用IFN γ預(yù)先刺激7天以誘導(dǎo)HLA II的 表達(dá)。這些結(jié)果證明通過這些細(xì)胞能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖的效率，并且它們的作用方法并 不是通過經(jīng)典陳述的通路。相反地，用成體MSC進(jìn)行的比較試驗(yàn)證明通過這些細(xì)胞作用的 免疫抑制方式是劑量依賴性的，并且它們的效率較低-在使用的最低細(xì)胞細(xì)胞比率時(shí)降 低33倍。這些結(jié)果還證明在用于轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的克隆細(xì)胞群中進(jìn)行研究的明顯優(yōu)勢。就 OMLP-PC而言，克隆和患者之間的復(fù)制是高度同源的，然而在MSC培養(yǎng)物中觀察到極大的可 變性，其包含異源的細(xì)胞群(這通過比較圖15和16中的數(shù)據(jù)可見)。我們使用T細(xì)胞絲裂原PHA證明OMLP-PC可以直接作用于T細(xì)胞，抑制它們的增 殖，而使用透孔培養(yǎng)技術(shù)證明在常規(guī)MLC條件下觀察到的免疫抑制作用是非接觸依賴性 的，并且不依賴于細(xì)胞表面HLA II表達(dá)的誘導(dǎo)。接觸和透孔試驗(yàn)中使用的應(yīng)答細(xì)胞的FACS 分析證明，雖然在接觸或透孔培養(yǎng)物中觀察到的免疫抑制水平?jīng)]有差異，但是在2個(gè)處理 組之間證明了激活的T細(xì)胞水平的差異。在接觸培養(yǎng)物中誘導(dǎo)了 CD3+CD38+T細(xì)胞和在透 孔研究中抑制了 CD3+CD25+T細(xì)胞，表明與應(yīng)答細(xì)胞直接接觸的OMLP-PC和在透孔系統(tǒng)中的 OMLP-PC的作用方式不同。后者的作用直接通過釋放至培養(yǎng)基并且影響T細(xì)胞的一個(gè)或多 個(gè)可溶性因子。OMLP-PC能夠以非劑量依賴性方式作用，并且不依賴于HLA II在它們的細(xì)胞表面 或細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。這些作用通過非接觸依賴性方式發(fā)生。從成體OMLP分離的多能PC提供了優(yōu)于使用其他ASC來源的幾個(gè)重要的優(yōu)勢?？?腔粘膜是容易得到活組織檢查的位置，對在常規(guī)牙科處置期間進(jìn)行活組織檢查的患者來說 僅要求微創(chuàng)，因此與外科手術(shù)如骨髓穿刺用于分離BMSC相比，為患者提供了極大的優(yōu)勢。 口腔粘膜中的愈合響應(yīng)快速和傷痕形成最小也使得PC的分離比從皮膚取樣更吸引人，皮 膚取樣導(dǎo)致疤痕形成。分離任何年齡的自體同源祖細(xì)胞也提供了放心的免疫相容性。(患 者很少能使用他們自己的骨髓穿刺物用于干細(xì)胞應(yīng)用，而是依賴于異源的供體。這些明顯 伴隨免疫排斥的高風(fēng)險(xiǎn)，這將被使用自體同源PC克服)。此外，我們的數(shù)據(jù)還表明OMLP-PC 對淋巴細(xì)胞增殖和抑制異源誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的強(qiáng)效作用，從而表明成體OMLP PC還應(yīng)用于 異源移植中，并且進(jìn)一步地，應(yīng)用于治療免疫相關(guān)疾病，例如但不限于GVHD或自身免疫。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.一種用于從口腔粘膜固有層獲得祖細(xì)胞(PC)的方法，所述方法包括(a)通過去除脂肪組織和細(xì)胞的上皮層處理來自受試者口腔粘膜的樣品；(b)去除剩余的固有層細(xì)胞外基質(zhì)，形成細(xì)胞的混合懸浮液；(c)分離潛在的祖細(xì)胞，并且使它們形成集落；以及(d)利用祖細(xì)胞的特征性標(biāo)記物選擇集落。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(a)包括從口腔粘膜去除脂肪組織，并且 用酶消化所述組織從而去除口腔粘膜的上皮層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述步驟(b)包括酶消化。
4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(c)包括區(qū)別粘附至細(xì)胞結(jié)合 劑，并且隨后培養(yǎng)結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(c)包括形成細(xì)胞的克隆群或 細(xì)胞的異源群。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述步驟(d)包括為了確定以下一種或 多種標(biāo)記物是否被表達(dá)而分析細(xì)胞hTERT、Nanog、0ct4、KLF-4、Sox2、SoxlO、Slug、Snail、 Twist、CD90、CD105、CD166、STR0-1、CD44、CD146、CD34、CD45、Notchl/2/ 或 3、Delta 1 和 Jagged2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述標(biāo)記物利用熒光激活細(xì)胞分選(FACQ分析來鑒定。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法還包括擴(kuò)增步驟(d)中選擇的集落。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述方法還包括在預(yù)先選擇的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)所述集落或細(xì)胞，從而促進(jìn)祖細(xì)胞分化為選擇的顯型，所述顯型取決于所述預(yù)先選擇 的培養(yǎng)條件。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述祖細(xì)胞被培養(yǎng)以形成任何一種以下顯型軟 骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法獲得的至少一種分化的細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法獲得的分化組織，其中所述組織用于組織工程目的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分化組織，其中在選擇的支架之上或之內(nèi)提供所述組織。
14.一種用于治療創(chuàng)傷、燒傷或修復(fù)由疾病導(dǎo)致的損傷的方法，所述方法包括采用通過 權(quán)利要求1-10所述的方法獲得的PC、根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法形成的分化細(xì)胞或 組織，或者根據(jù)權(quán)利要求11-13所述的分化細(xì)胞或組織替代損傷的組織。
15.一種用于治療創(chuàng)傷、燒傷或修復(fù)由疾病導(dǎo)致的損傷的方法，所述方法包括同時(shí)給予 i)源自非被治療個(gè)體的個(gè)體的分化細(xì)胞或組織，所述細(xì)胞或組織并非是源自口腔粘膜固有 層(OMLP)的PCjnii) 口腔粘膜固有層(OMLP)的PC或其后代。
16.一種分離的人成體祖細(xì)胞及其后代，其中所述細(xì)胞源自口腔粘膜固有層，并且進(jìn)一 步地，其中所述細(xì)胞為多能的、自我更新的和具有免疫調(diào)節(jié)性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的分離的人成體祖細(xì)胞及其后代，其中所述細(xì)胞為任何一 種或多種以下標(biāo)記物陽性hTERT、CD90、CD105、CD166、STR0-1、CD44、CD146、Nanog、0ct4、Sox2、KLF-4、Notchl/2/ 或 3、Delta 1、Jagged 2、SoxlO、Slug、Snail 禾口 Twist。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的分離的人成體祖細(xì)胞及其后代，或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (iPS)，其中所述細(xì)胞為四種以下標(biāo)記物陽性Nanog、KLF-4、Sox2和0ct4。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18所述的分離的人成體祖細(xì)胞及其后代，其中所述細(xì)胞為細(xì)胞 標(biāo)記物⑶；34和⑶45陰性。
20.一種用于治療炎性障礙或免疫病癥的方法，所述方法包括給予被治療的個(gè)體通過 根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的方法獲得的祖細(xì)胞或其后代，包括分化的細(xì)胞或組織。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的方法獲得的祖細(xì)胞或其后代，或者權(quán)利要求16-19所述 的祖細(xì)胞作為藥物的應(yīng)用。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞用于治療任何一種或多種以下疾病 創(chuàng)傷、燒傷、組織損傷、炎癥、包括自身免疫的免疫障礙、GVHD、異源造血干細(xì)胞(HSC)移植 或者糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自口腔粘膜固有層的新的祖細(xì)胞群的分離和應(yīng)用。所述新的祖細(xì)胞群為高度增殖的，并且能夠分化為一系列細(xì)胞系。而且，這些新的祖細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)活性，并且因此可以用于組織的異源轉(zhuǎn)移或用于協(xié)助對抗免疫障礙。
文檔編號C12N5/074GK102089424SQ200980122121
公開日2011年6月8日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日
發(fā)明者L·C·戴維斯, P·史蒂芬 申請人:加的夫大學(xué)學(xué)院咨詢有限公司