專利名稱：雞傳染性法氏囊病病毒重組弱毒疫苗株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株重組弱毒疫苗株，尤其涉及一株表達(dá)流行毒株主要保護(hù)性抗原蛋 白VP2的雞傳染性法氏囊病病毒重組弱毒疫苗株，本發(fā)明還涉及該重組弱毒疫苗株在制備 防制雞傳染性法氏囊病生物制品中的應(yīng)用，屬于雞傳染性法氏囊病的防制領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由雞傳染性法氏囊病 病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種主要危害雛雞的急性、高度 接觸性、免疫抑制性、致死性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為“影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)的重 要疾病”。該病于1957年首次爆發(fā)于美國(guó)，現(xiàn)已大面積流行于歐州、東南亞、非州、南美洲等 地。中國(guó)的流行情況也比較嚴(yán)重，一直威脅著中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。IBDV有兩個(gè)血清型，僅血 清I型對(duì)雞致病。血清I型毒株由于不斷變異又分為經(jīng)典毒株、變異毒株、超強(qiáng)毒株(very virulent IBDV, vvIBDV)，其中vvIBDV的致死率高達(dá)60%以上，而且耐過(guò)雞群會(huì)呈現(xiàn)對(duì)禽
(MuIler H, Islam M R, Raue R. Research on infectious bursal disease-the past,the presentand the future. Vet. Microbiol. 2003,97 :153-165.)。最 近研究發(fā)現(xiàn)，野生鳥(niǎo)類也能感染wIBDV。免疫抑制、抗原變異，特別是wIBDV的出現(xiàn)，使得 該病的防控形勢(shì)更加嚴(yán)峻。IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，其基因組由兩個(gè)雙股RNA節(jié)段組成。B 節(jié)段長(zhǎng)2827bp，編碼具有RNA聚合酶活性的VPl蛋白。A節(jié)段長(zhǎng)3260bp，包括兩個(gè)開(kāi)放閱 讀框(ORF)小ORF在前，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白VP5;大ORF在后，編碼VP2、VP3和VP4蛋白。 VP2是IBDV唯一的衣殼蛋白，是IBDV主要的毒力蛋白和宿主保護(hù)性抗原(Garriga D， Querol-Audi J, Abaitua F, et al. The 2. 6-Angstrom structure of infectious bursal disease virus-derived T-Iparticles reveals new stabilizing elements of the virus capsid. J. Virol.，2006,80 :6895_6905·)。最近，IBDV新的變異趨向已被監(jiān)測(cè)到。本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室對(duì)分離鑒定的vvIBDV進(jìn)行 全基因組序列分析還發(fā)現(xiàn)，HLJ-0504代表了一群具有基因組新特征的vvIBDV，這類病毒具 有超強(qiáng)毒的A節(jié)段和介于強(qiáng)弱毒之間的B節(jié)段，VP2基因存在抗原漂變，其對(duì)SPF雞致死率 高達(dá)86. 7%，該類病毒在東北地區(qū)、廣西以及法國(guó)均有存在。依據(jù)主要保護(hù)性抗原基因VP2 繪制的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，HLJ-0504株在國(guó)內(nèi)流行毒株中具有代表性。疫苗免疫是防控wIBDV的主要手段，但wIBDV致病性很強(qiáng)且不適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)，活 疫苗株的獲得只能通過(guò)將野生vvIBDV在雞胚或CEF細(xì)胞上傳代致弱(Wang X Μ,Fu C Y, Gao H L, et al. Pathogenicantigenic and molecular characterization of very virulent strain (Gx) of infectious bursal disease virus isolated in China. Agri. Sci. China, 2003,2 :566-572. Wang X M, Zeng X W, Gao H L, et al. Changes inVP2 gene during the attenuation of very virulent infectious bursaldisease Virus strain Gx isolated in China. Avian Dis. ,2004,48 :77-83. Wang, X. , Zhang H. , Gao H. , et al. Changes inVP3 and VP5 genesduring the attenuation of very virulent infectious bursal disease virusstrain Gx isolated in China. Virus Genes，2007，34 :67_73. Yamaguchi T，Ogawa M，Inoshima Y，et al. Identification of sequence changesresponsibIe for the attenuation of highly virulent infectious bursaldisease virus. Virology, 1996,223 :219-223.)。這種傳統(tǒng)的疫苗株馴化方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，往往需要數(shù)年時(shí)間，而且結(jié)果 帶有隨機(jī)性。對(duì)于高致病力的、易變異的vvIBDV的防控，特別是突發(fā)疫情的防控，開(kāi)展疫苗 株的快速構(gòu)建研究迫在眉睫。反向遺傳技術(shù)是研究基因功能和進(jìn)行分子修飾的有力工具。國(guó)外研究者對(duì)建立快 速的疫苗株篩選方法做了一些探索工作。Mimdt等曾以疫苗株D78為親本毒，拯救獲得嵌合 病毒D78-Chim，該病毒對(duì)經(jīng)典毒和變異株的攻擊均能產(chǎn)生保護(hù)。此外，有研究者曾以缺失 VP5的策略試圖構(gòu)建疫苗株，VP5缺失雖然導(dǎo)致復(fù)制延遲但并不影響宿主對(duì)IBDV的體液免 疫反應(yīng)強(qiáng)度。Lim等曾通過(guò)點(diǎn)突變使wIBDV HK46株適應(yīng)非允許細(xì)胞CEF，但沒(méi)有進(jìn)一步評(píng) 估其致病性和免疫原性。在過(guò)去近60年里，IBDV曾經(jīng)出現(xiàn)過(guò)兩次大的變異，每次變異都因?yàn)樾露局?突破了原有疫苗免疫保護(hù)而造成了嚴(yán)重?fù)p失(MUller H，Islam M R，RaueR. Research on infectious bursal disease—the past, the present and the future.Vet. Microbiol. 2003，97 :153-165.)。近20年來(lái)，雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株(vvIBDV)在 危害養(yǎng)禽業(yè)的同時(shí)，也在發(fā)生和累計(jì)著微小的變異，是否會(huì)出現(xiàn)抗原性大的變異或者出現(xiàn) 毒力更強(qiáng)的毒株可能只是個(gè)時(shí)間問(wèn)題。傳統(tǒng)的傳代致弱的疫苗株馴化方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能 滿足突發(fā)疫情應(yīng)急防控的需要。所以，應(yīng)用先進(jìn)的反向遺傳操作技術(shù)，依據(jù)流行病學(xué)監(jiān)控信 息，針對(duì)流行毒株，有目的的快速構(gòu)建IBDV新型疫苗毒株具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株表達(dá)vvIBDV流行 毒株主要保護(hù)性抗原蛋白VP2的重組弱毒疫苗株，該毒株有較高的復(fù)制滴度，對(duì)雞無(wú)致病 性，遺傳穩(wěn)定性良好，有較好的免疫原性。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一株表達(dá)wIBDV流行毒株主要保護(hù)性抗原蛋白VP2的重組弱毒疫苗株 (rGtHLJVP2)，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3749 ；分類命名是雞傳染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus)；保藏時(shí)間是2010年4月20日保藏單位是中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明克隆了流行超強(qiáng)毒株HLJ-0504的主要保護(hù)性抗原基因VP2，將其核苷酸進(jìn) 行突變修飾(A889T/G980A)，然后將其替換IBDV弱毒株Gt基因組的相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建IBDV 重組基因組的感染性克隆，利用IBDV反向遺傳操作系統(tǒng)，拯救并鑒定了重組弱毒疫苗株 rGtHLJVP2。在感染性克隆里，IBDV基因組的兩端均克隆有核酶的cDNA序列。核酶的本質(zhì) 是一種具有剪切酶活性的RNA。錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)(hammerhead ribozyme,HamRz)核心序列 共有58個(gè)核糖核酸，自我剪切位點(diǎn)在其3'末端C處；丁肝病毒核酶結(jié)構(gòu)(h印atitis delta ribozyme, HdvRz)共有88個(gè)核糖核酸，自我剪切位點(diǎn)在其5‘末端G處。核酶序列的引入實(shí)現(xiàn)了從轉(zhuǎn)錄水平上控制重組IBDV基因組的完整性，這是實(shí)現(xiàn)高效病毒拯救的關(guān)鍵之一。 vvIBDV不能夠適應(yīng)CEF細(xì)胞，這是由VP2的253和284位氨基酸位點(diǎn)決定的(Qi X L，Gao H L, Gao Y L, et al. Naturally occurring mutations atresidues 253 and 284 in VP2 contribute to the cell tropism andvirulence of very virulent infectious bursal disease. Antiviral Res. ,2009,84 :225_233.)。vvIBDV HLJ-0504核苷酸突變A889T/G980A 導(dǎo)致了 VP2的氨基酸突變Q253H和A284T，這是感染性克隆有感染性并在DFl和CEF細(xì)胞上 能夠拯救出重組病毒的前提。感染性克隆pCAGGGtAHLJVP2HRT與pCAGGGtBHRT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，經(jīng)IFA和電 鏡觀察證明，拯救出了重組弱毒疫苗株rGtHLJVP2。測(cè)序證明，本發(fā)明重組弱毒疫苗株 rGtHLJVP2是一株以弱毒株Gt為骨架，其主要保護(hù)性抗原基因VP2被wIBDV HLJ-0504相 應(yīng)區(qū)域替換了的重組病毒。本發(fā)明重組弱毒疫苗株(rGtHLJVP2)主要具有以下幾方面的特點(diǎn)(1)復(fù)制特性良好。rGtHLJVP2在CEF細(xì)胞上與Gt具有相似的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線， 接毒后48h-60h，病毒滴度可達(dá)到107TCID5Q/ml以上。在SPF雞的法氏囊內(nèi)，rGtHLJVP2與 Gt也具有相當(dāng)?shù)牟《据d量。(2)安全性好，對(duì)SPF雞無(wú)致病性。rGtHLJVP2盡管具有vvIBDV的VP2基因，但由 于做了分子修飾，與Gt對(duì)照組一樣，對(duì)SPF雞不呈現(xiàn)致病性。在接種SPF雞后的14天內(nèi)，試 驗(yàn)雞的精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀；法氏囊正常，沒(méi)有萎縮，沒(méi)有明顯的顯微病變。 rGtHLJVP2和弱毒疫苗株Gt —樣對(duì)SPF雞無(wú)致病性，但中等毒力疫苗B87對(duì)法氏囊造成了 嚴(yán)重萎縮和不可逆病理?yè)p傷。(3)遺傳穩(wěn)定性良好。rGtHLJVP2在CEF細(xì)胞和SPF雞上分別盲傳15代和5代， 病毒滴度保持穩(wěn)定，基因組沒(méi)有發(fā)生意外突變，毒力也沒(méi)有返強(qiáng)。(4)免疫原性良好。rGtHLJVP2免疫SPF雞后，7d 80%血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，IOd 100% 陽(yáng)轉(zhuǎn)，而且能夠100%保護(hù)強(qiáng)毒攻擊。rGtHLJVP2和中等毒力疫苗B87相當(dāng)，優(yōu)于弱毒疫苗 株Gt。總之，本發(fā)明重組弱毒疫苗株rGtHLJVP2具有良好的復(fù)制性、遺傳穩(wěn)定性和安全 性。在免疫效果上，本發(fā)明弱毒疫苗株和中等毒力疫苗相當(dāng)，優(yōu)于弱毒疫苗株。本發(fā)明重組 弱毒疫苗株具備了作為疫苗株的高效、低毒的特點(diǎn)，是一株良好的疫苗候選毒株，可以用于 雞傳染性法氏囊病(IBD)的防控。


圖1HLJ-0504株VP2基因的突變修飾及替換Gt株相應(yīng)區(qū)段流程圖。圖2感染性克隆示意圖。圖3用HLJ-0504株VP2基因替換Gt株基因組相應(yīng)區(qū)段過(guò)程中的各步PCR產(chǎn) 物；M. Ikb DNA Ladder Marker ； 1. PCR 產(chǎn)物 GtHLJ0504VP2I ；2. PCR 產(chǎn)物 GtHLJ0504VP2II ； 3. GtHLJ0504VP2III ；4. PCR 產(chǎn)物 GtAHLJVP2HRT。圖4重組病毒在CEF上的CPE (100X)；左.rGtHLJVP2 ；右.正常細(xì)胞對(duì)照。圖5間接免疫熒光檢測(cè)重組病毒(X 100)；左.rGtHLJVP2 ；右.正常細(xì)胞對(duì)照。圖6電鏡下的重組病毒rGtHLJVP2 (40000 X)。
圖7重組病毒rGtHLJVP2在CEF細(xì)胞上的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線。圖8重組病毒rGtHLJVP2體內(nèi)(法氏囊)復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線。圖9重組病毒接毒后雞囊重指數(shù)變化曲線。圖10重組病毒接種SPF雞的法氏囊的病理變化(20X)。圖11重組病毒誘導(dǎo)試驗(yàn)雞的抗體滴度。圖12不同疫苗免疫試驗(yàn)雞抗體消長(zhǎng)曲線。圖13試驗(yàn)雞二免及攻毒后各組雞囊重指數(shù)變化曲線；d p. i. dayspost-infection (接禾中后天數(shù))；d p. c. :days post challenge (攻毒后天數(shù))。圖14試驗(yàn)雞二免及攻毒后法氏囊的病理變化(20X) ；d p. i. dayspost-infection (接禾中后天數(shù))；d p. c. :days post challenge (攻毒后天數(shù))。圖15試驗(yàn)雞二免后法氏囊中的病毒載量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1重組弱毒疫苗株rGtHLJVP2的設(shè)計(jì)、拯救、鑒定及免疫效力初步評(píng)價(jià)1材料和方法1. 1 材料1. 1. 1 病毒HLJ-0504, vvIBDV[購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所菌毒種室(對(duì)外)]； Gt, IBDV弱毒疫苗株，由哈爾濱獸醫(yī)研究所禽免疫抑制病課題組(本發(fā)明人課題組)將 vvIBDV Gx株連續(xù)傳代致弱并保存，具體方法可參考有關(guān)文獻(xiàn)(Wang X Μ, Zeng X W, Gao H L, et al. Changes in VP2 geneduring the attenuation of very virulent infectious bursal disease Virus strain Gxisolated in China. Avian Dis. ,2004,48 :77_83 ；Wang, X. , Zhang H. , Gao H. , et al. Changes in VP3 and VP5 genes during the attenuation of very virulent infectiousbursal disease virus strain Gx isolated in China. Virus Genes，2007，34 :67-73.)。1.1.2 質(zhì)粒pT-HLJ0504AHRT 將HLJ-0504基因組A節(jié)段克隆入pMD18T載體，A節(jié)段5，端和 3，端已分別加入核酶結(jié)構(gòu)的cDNA序列，分別為HamRz (58bp) 5' TGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTC3'和 HdvRz (88bp) 5' GGGTCG GCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG3 ‘。 pCAGGGtAHRT和pCAGGGtBHRT 分別將IBDV弱毒株Gt的基因組的A、B節(jié)段克隆入真核表達(dá) 載體pCAGGS，基因組兩端已分別引入了核酶結(jié)構(gòu)HamRz和HdvRz (Qi X L, Gao Y L, Gao H L,et al. An improved method forlnfectious bursal disease virus rescue using RNA polymerase II system. J. Virol. Methods，2007，142 :81_88.)。上述質(zhì)粒均由本發(fā)明人課
6題組構(gòu)建和保存。1.1.3細(xì)胞和單克隆抗體DFI 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)集存庫(kù)(American type culture collection, ATCC)； 原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)按常規(guī)方法用SPF雞胚制備；抗IBDVVP2蛋白單克隆抗體6H7D 由本發(fā)明人課題組制備；ToplOF'菌種由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存(ToplOF'菌種也可從生物 試劑公司購(gòu)買得到)。1. 1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于超濾負(fù)壓 隔離器中。1. 1.5主要試劑各種限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、dNTP 等購(gòu)于 大連寶生物公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；Plasmid Midi Kit為 QIAGEN 產(chǎn)品；LipofectamineTM-2000，Superscript RT-PCR Systems 試劑盒購(gòu)于英俊生物 技術(shù)有限公司(Invitrogen) ；Opti-MEM I Medium為GIBCO產(chǎn)品；熒光素(FITC)標(biāo)記的羊 抗鼠IgG為Sigma產(chǎn)品。1.2引物設(shè)計(jì)與合成用于RT-PCR、融合PCR以及點(diǎn)突變的引物見(jiàn)表1，由英俊生物技術(shù)有限公司 (invitrogen)合成。
權(quán)利要求
一株雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)重組弱毒疫苗株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.3749。
2.權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病病毒重組弱毒疫苗株在制備預(yù)防或治療雞傳 染性法氏囊病生物制品中的用途。
3.權(quán)利要求1所述的雞傳染性法氏囊病病毒重組弱毒疫苗株在制備診斷雞傳染性法 氏囊病生物制品中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了雞傳染性法氏囊病病毒重組弱毒疫苗株及其應(yīng)用。本發(fā)明克隆了流行超強(qiáng)毒株HLJ-0504的主要保護(hù)性抗原基因VP2，將其核苷酸進(jìn)行突變修飾，然后將其替換IBDV弱毒株Gt基因組的相應(yīng)區(qū)段，構(gòu)建IBDV重組基因組的感染性克隆，利用IBDV反向遺傳操作系統(tǒng)，拯救并鑒定了重組弱毒疫苗株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.3749；本發(fā)明重組弱毒疫苗株具有良好的復(fù)制性、遺傳穩(wěn)定性和安全性。在免疫效果上，本發(fā)明弱毒疫苗株和中等毒力疫苗相當(dāng)，優(yōu)于弱毒疫苗株。在生物安全性上，優(yōu)于中等毒力疫苗。本發(fā)明重組弱毒疫苗株具備作為疫苗株的高效、低毒的特點(diǎn)，是良好的疫苗候選毒株，可用于雞傳染性法氏囊病的防控。
文檔編號(hào)C12N15/40GK101935637SQ201010215328
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者王永強(qiáng), 王笑梅, 祁小樂(lè), 秦立廷, 高宏雷, 高玉龍, 高立 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所