專利名稱：用于誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的小分子rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙鏈RNA分子及其應(yīng)用，特別是一種能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞紅系分 化雙鏈RNA分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根據(jù)腫瘤干細(xì)胞理論(例如見C. T. Jordan, Μ. L. Guzman, Μ. Noble, Cancer Stem Cells, N. Engl. J. Med. 355 (2006) 1253-1261)及腫瘤細(xì)胞分化障礙異常的研究進(jìn) 展，近年來提出了腫瘤治療的新思路腫瘤誘導(dǎo)分化治療，即，利用分化誘導(dǎo)劑使腫瘤 細(xì)胞向正常細(xì)胞方向分化，減輕或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，從而治療腫瘤(例如見 M.Leszczyniecka 等’ Differentiation therapy of human cancer :basic science and clinicalapplications, Pharmacol. Therapeut. 90(2001) 105-156)。其中維甲酸和砷劑誘 導(dǎo)分化治療早幼粒細(xì)胞性白血病，對初診患者的臨床緩解率可達(dá)90% (例如見C. Massard 等 Tumour stem cell-targeted treatment :eliminationor differentiation，Annal. Oncology 17(2006) 1620-1624)。盡管實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)不少誘導(dǎo)分化劑，但現(xiàn)有的誘導(dǎo)分化劑主要是維甲類、 二甲基亞砜等小分子化合物及一些細(xì)胞因子(例如見D. Zhmg等，A critical role for the co—repressor N-CoR in erythroid differentiation andheme synthesis, Cell Res. 17(2007)804-814 ；F.Wolter Resveratrolenhances the differentiation induced by Butyrate in Caco—2 colon cancer cells，J. Nutr. 132(2002)2082—2086 ; B.Zochodne 等，Epo regulates erythroidproliferation and differentiation through distinct signaling pathways -implication for erythropoiesis and Friend virus-induced erythroleukemia, Oncogene 19 (2000)2296-2304)。其中，小分子化合物對人體多有一定的毒性，存在容易復(fù)發(fā)和產(chǎn)生耐藥性的問題， 例如全反式維甲酸可引起維甲酸綜合癥，嚴(yán)重者可危及生命(例如見P. Montesinos等， Differentiation syndrome in patients withacute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid andanthracycline chemotherapy characteristics, outcome, and prognostic factors, Blood 113(2009)775—783)；又例如臨床化療中 常用的抗癌藥物阿糖孢苷，具有很強(qiáng)的骨髓抑制作用(例如見M. C. Cha等，Low dose docosahexaenoicacid protects normal colonic epithelial cells from araC toxicity, BMCPharmaco1. 23(2005)7)。除小分子化合物類藥物外，一些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化(例如見 B. Zochodne 等,Epo regulates erythroid proliferation and differentiationthrough distinct signaling pathways imp 1i cat ion for erythropoiesis and Friendvirus-induced erythroleukemia, Oncogene 19 (2000) 2296-2304)，但細(xì)胞因子價(jià) 格非常昂貴，極大地限制了其在臨床上的應(yīng)用。此外，一些基因也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化(例如見D. C. Tomlinson等，F(xiàn)GFRlpromotes proliferation and survival via activation of the MAPKpathway in bladder cancer, Cancer Res. 69(2009)4613-4620 ;J. H. Schulte 等，Lysine-specific demethylase 1 is strongly expressed in poorIydifferentiated neuroblastoma implications for therapy, Cancer Res. 69 (2009) 2065-2071)，但由于基因治療存在的基 因轉(zhuǎn)染效率差、持續(xù)時(shí)間短、基因整合位點(diǎn)隨機(jī)等問題尚未解決，因而基因治療手段短期內(nèi) 還很難在臨床普及。近年來得到廣泛研究的小片段干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和非 編碼微RNA(microRNA，miRNA)因其對序列同源的靶基因表達(dá)的特異性高效抑制作用已成 為基因表達(dá)抑制技術(shù)的重要成員，并開辟了利用小分子RNA制備核酸藥物的新領(lǐng)域(例如 JAL S. M. Elbashir Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells, Nature 411(2001)494-498·)。與傳統(tǒng)的化合物類藥物和基因治療相比，利用小分子RNA制藥具有以下優(yōu)點(diǎn)小 分子RNA以序列互補(bǔ)的方式識別靶基因并抑制其表達(dá)，因而可以推論能夠作用于靶基因從 而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的小RNA (有效小RNA)的數(shù)量比傳統(tǒng)的化合物類藥物更多；可利用基因 工程技術(shù)及文庫技術(shù)對小分子RNA進(jìn)行大規(guī)模高通量篩選；與外源大分子基因需依靠細(xì)胞 內(nèi)表達(dá)不同，小分子RNA可由化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞內(nèi)表達(dá)等多種方式獲得，且成本較 低；與表達(dá)外源大分子基因不同，小分子RNA的分子小，易于導(dǎo)入細(xì)胞發(fā)揮作用；對小分子 RNA易于進(jìn)行基因工程改造及化學(xué)修飾，可提高其作用的特異性、有效性、穩(wěn)定性、靶向細(xì)胞 特異性等。因此小分子RNA在核酸制藥和基因治療中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。目前已報(bào)道的與K562細(xì)胞系或與其相應(yīng)的紅白血病細(xì)胞分化有關(guān)的siRNA都是 針對已知基因序列設(shè)計(jì)的，包括針對3種基因PU. 1、CATU BPl的siRNA。其中，PU. IsiRNA 僅對小鼠紅白血病細(xì)胞系MEL有紅系分化中作用(例如見M. Papetti等，Reprogramming Leukemia Cells toTerminal Differentiation and Growth Arrest by RNA Interference of PU. 1, Mol. Cancer Res. 5 (2007) 1053-1062 ；R. Blaybel 等，Downregulation of theSpi-l/PU. 1 oncogene induces the expression of TRIM 10/HERF 1, a key factorrequired for terminal erythroid cell differentiation and survival, Cell Res. 18 (2008) 834-845)，該細(xì)胞系是從Friend病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鼠紅白血病細(xì)胞中分離 出的細(xì)胞系，由于該小鼠紅白血病的發(fā)生、發(fā)展及表現(xiàn)與人類紅白血病有較大差異，因此其 對人類白血病治療的效果尚難預(yù)計(jì)。此外，已報(bào)道的CATl siRNA僅有影響K562的細(xì)胞生長速度的效果(例如見 T· MAEDA 等，Changes of Differentiation and Proliferation in K562Cells with Various Levels of Knockdown of Cationic Amino Acid Transporterl, Drag Metab. Pharmacokinet. 23(2008) 181-187)。BPl siRNA僅對K562細(xì)胞有升高β -珠蛋白表達(dá)量的效果(例如見0. P. Zoueva 等，Inhibition of beta protein lexpression enhances beta-globinpromoter activity and beta-globin mRNA levels in the human erythroleukemia(K562) cell line, Exp. Hemato1. 32(2004)700—708)。同時(shí)，由于已知可作為疾病靶標(biāo)的基因十分有限，因而針對已知基因序列設(shè)計(jì) siRNA的可能性被限制在很窄的范圍內(nèi)。
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因此，需要提供這樣的SiRNA腫瘤誘導(dǎo)分化分子不僅能具有SiRNA的廉價(jià)、無毒 副作用、持續(xù)時(shí)間長、轉(zhuǎn)染效率高等有利效果，而且與現(xiàn)有siRNA誘導(dǎo)劑相比作用強(qiáng)、對腫 瘤細(xì)胞的多種指標(biāo)有效。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有分化誘導(dǎo)劑存在的上述問題，擴(kuò)展可用于治療白血病等腫瘤 的siRNA序列，本發(fā)明人利用基因工程技術(shù)從大容量隨機(jī)siRNA文庫(見本發(fā)明人的 W02004/001044 禾口 M. Chen 等 A universal plasmidlibrary encoding all permutations of small interfering RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. 102 (2005) 2356-2361，其全部內(nèi)容以援 引方式并入本文)中篩選出可誘導(dǎo)人慢性髓樣白血病K562細(xì)胞系向紅細(xì)胞方向分化(紅 系分化)的siRNA。<1>本發(fā)明提供了一種雙鏈RNA分子，其雙鏈互補(bǔ)序列分別是含有以下序列的序 列SEQ NO. 1 :5，ACAUGUACAUAGGGAUAUC3，；禾口SEQ N0. 2 5' GAUAUCCCUAUGUACAUGU3，，其中在SEQ NO. 1和SEQ N0. 2的5，端和/或3，端延伸有1 3個(gè)任意核苷酸。<2>本發(fā)明的另一方案是一種雙鏈RNA分子，其雙鏈互補(bǔ)序列分別是以下的序列SEQ NO. 1 :5，ACAUGUACAUAGGGAUAUC3，；禾口SEQ N0. 2 5' GAUAUCCCUAUGUACAU⑶3，。<3>本發(fā)明還提供了如上<1>或<2>所述的雙鏈RNA分子在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系 K562紅系分化的藥物中的應(yīng)用。<4>本發(fā)明的雙鏈RNA分子能夠使腫瘤細(xì)胞系K562的⑶235表達(dá)增加、ε -珠蛋 白表達(dá)增加、Y “珠蛋白表達(dá)增加、β “珠蛋白表達(dá)增加、GATA-2表達(dá)降低、和/或細(xì)胞增殖 速度減慢。<5>本發(fā)明還涉及如<1>或<2>所述的雙鏈RNA分子在制備治療人慢性髓樣白血 病的藥物中的應(yīng)用。<6>本發(fā)明還提供了編碼如<1>或<2>所述的雙鏈RNA分子的DNA分子。<7>本發(fā)明還提供了包含如<5>所述DNA分子的核酸載體。<8>本發(fā)明還提供了如<5>所述的DNA分子和/或如<6>所述的核酸載體在制備 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系Κ562紅系分化的藥物中的應(yīng)用。<9>本發(fā)明的DNA分子和/或核酸載體能夠使腫瘤細(xì)胞系Κ562的⑶235表達(dá)增 加、ε-珠蛋白表達(dá)增加、Y-珠蛋白表達(dá)增加、β-珠蛋白表達(dá)增加、GATA-2表達(dá)降低、和 /或細(xì)胞增殖速度減慢。<10>本發(fā)明還提供了如<5>所述DNA分子或如<6>所述的核酸載體在制備治療人 慢性髓樣白血病的藥物中的應(yīng)用。令人驚訝的是，本發(fā)明的可誘導(dǎo)人慢性髓性白血病Κ562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分化 (紅系分化)的clone-67 siRNA的序列目前尚未有報(bào)道。本發(fā)明的clone-67siRNA具有誘 導(dǎo)人慢性髓性白血病K562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分化(紅系分化)的作用，使K562細(xì)胞分化 程度增高，減慢其增殖速度，從而減輕其惡性表型。
本發(fā)明的cl0ne-67siRNA是從大容量隨機(jī)siRNA文庫中篩選出來的，不與已知的 任何基因具有同源性，因此不同于現(xiàn)有的治療白血病或誘導(dǎo)白血病細(xì)胞體外分化的siRNA。


下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，附圖中圖1顯示經(jīng)隨機(jī)挑選的12個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞的⑶235陽性細(xì)胞比例；圖2顯示clone_67siRNA轉(zhuǎn)染增加K562細(xì)胞的CD235表達(dá)；圖3顯示clone-67siRNA轉(zhuǎn)染增加K562細(xì)胞的ε -珠蛋白、γ -珠蛋白和β -珠
蛋白表達(dá)量；圖4顯示clone-67siRNA轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞的GATA-2和GATA-1表達(dá)量的改變；圖5.轉(zhuǎn)染clone_67siRNA后K562細(xì)胞的增殖速度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明使用的大容量隨機(jī)siRNA文庫是本發(fā)明人建立的大容量隨機(jī)siRNA文 庫(見 W02004/001044 ；禾口 M.Chen 等，A universal plasmid libraryencoding all permutations of small interfering RNA，Proc. Natl. Acad. Sci. 102(2005)2356-2361，其 全部內(nèi)容以援引方式并入本文)，該siRNA文庫中有大約3xl07個(gè)不同的siRNA序列。本發(fā)明使用的K562細(xì)胞系(購自ATCC，貨號CCL-243)是從人慢性髓樣白血病患 者的腫瘤細(xì)胞中分離出的一個(gè)細(xì)胞系，屬于紅白血病細(xì)胞系，是研究白血病細(xì)胞分化的常 用細(xì)胞模型。K562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分化(紅系分化)后會(huì)出現(xiàn)一系列的特征性改變例 如⑶235、珠蛋白表達(dá)增高，并且隨著分化進(jìn)程的推進(jìn)，GATA-2的表達(dá)逐漸降低，而GATA-I 的表達(dá)逐漸增加；K562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分化(紅系分化)后隨著分化進(jìn)程的推進(jìn)，細(xì)胞 增殖速度逐漸減慢，進(jìn)入終末分化后最終將退出細(xì)胞周期不再增殖。本文中的術(shù)語“紅系分化”是指分化程度低的腫瘤細(xì)胞經(jīng)過一系列相關(guān)基因表達(dá) 的調(diào)控過程，向具有紅細(xì)胞性質(zhì)的無惡性的高分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程。紅系分化是本領(lǐng)域中 常用于評價(jià)細(xì)胞分化程度和藥物對腫瘤細(xì)胞分化調(diào)控效果的指標(biāo)之一。⑶235在造血前體細(xì)胞中不表達(dá)，而K562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分化(紅系分化)后 會(huì)出現(xiàn)的特征性改變之一是CD235開始表達(dá)并逐漸增加，成熟紅細(xì)胞保持高水平的CD235 量。血紅蛋白的產(chǎn)生是紅系分化的重要標(biāo)志之一，血紅蛋白由血紅素及珠蛋白組成， 組成血紅蛋白的主要是α-珠蛋白和β-珠蛋白，β-珠蛋白分5種ε-珠蛋白、γ(Α和 G)-珠蛋白，δ-珠蛋白及β-珠蛋白。Κ562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分化(紅系分化)后會(huì)出 現(xiàn)的特征性改變之一是某些種類的珠蛋白的表達(dá)增加。GATA-2和GATA-1是紅系分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子。Κ562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向分 化(紅系分化)后隨著分化進(jìn)程的推進(jìn)，GATA-2的表達(dá)逐漸降低，而GATA-I的表達(dá)逐漸增 加。利用實(shí)施例1中的篩選方法從上述大容量隨機(jī)siRNA文庫中以Κ562細(xì)胞為對象 篩選出CD235陽性的細(xì)胞，對這些陽性細(xì)胞中所含的siRNA編碼序列進(jìn)行測序，可得知引起 ⑶235表達(dá)增高的siRNA的序列，再進(jìn)一步對這些siRNA導(dǎo)入Κ562細(xì)胞后的作用進(jìn)行鑒定。
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以上述方法，我們從隨機(jī)SiRNA文庫中篩選到一個(gè)可誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅細(xì)胞方向 分化(紅系分化)的siRNA :clone-67，它的兩條互補(bǔ)鏈的DNA編碼序列分別為(方向?yàn)閺?5，至Ij 3，)ACATGTACATAGGGATATC 禾口 GATATCCCTATGTACATGT。不過，本發(fā)明并不限于clone-67的序列本身，本發(fā)明還包括clone-67siRNA的 序列為基礎(chǔ)，在其序列兩端各添加1 3個(gè)任意核苷酸的序列，這是因?yàn)閟iRNA的作用機(jī) 制是對同源序列的調(diào)控，已表明siRNA的作用效果主要取決于其中間的核心序列，而靠近 兩側(cè)的堿基序列對其作用效果的影響較小(例如見Q. Du等，A systematic analysis of the silencingeffects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites, Nucleic Acids Res. 33 (2005) 1671-1677.)，且在 siRNA 的兩側(cè)添加 1 3 個(gè)核苷酸不但不會(huì)減弱該siRNA的作用效果，還會(huì)增強(qiáng)siRNA的效果(例如見S. D. Rose 等，F(xiàn)unctional polarity is introduced by Dicer processing ofshort substrate RNAs, Nucleic Acids Res. 33(2005)4140-4156.及 D-H Kim 等，Synthetic dsRNA Dicer sustrates enhance RNAi potency and efficacy, Nature Biotech.23 (2005)222-226.)。實(shí)施例實(shí)施例1 12個(gè)陽性siRNA的篩選K562細(xì)胞用添加10%胎牛血清(購自Sigma，貨號12003C)的IMDM培養(yǎng)基(購 自Thermo-Fisher，貨號SH30228. 01B)在37°C 5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱(購自三洋)中 培養(yǎng)(除非另外指出，以下各實(shí)施例中K562細(xì)胞培養(yǎng)方式與此相同)，將包含3xl07個(gè)不同 siRNA編碼序列的隨機(jī)siRNA文庫混合質(zhì)粒用Lipofectamine 2000 (購自Invitrogen，貨 號11668-019)轉(zhuǎn)染入6. 7xl07個(gè)K562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，向培養(yǎng)液中加入G418 (購自 Merck，貨號345810 ；終濃度800ug/ml)殺死未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；14天后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為 IxlO7個(gè)細(xì)胞/ml，按照每IO6個(gè)細(xì)胞加入抗體Iug的比例用抗⑶235抗體(購自R&D，貨號 MAB1228)在 4°C標(biāo)記細(xì)胞半小時(shí)，再加入Dynabeads Pan Mouse IgG (購自 Invitrogen， 貨號110-41)磁珠，按照磁珠說明書的方法(即，用IOml試劑盒中的溶液1洗細(xì)胞一次，將 細(xì)胞重懸于溶液1中，濃度IxlO7個(gè)細(xì)胞/ml，加入磁珠1ml，4°C半小時(shí)，加一倍體積溶液1， 磁珠吸2分鐘，棄上清，用溶液1洗磁珠3次，棄上清，得到⑶235陽性的細(xì)胞)篩選出⑶235 陽性的細(xì)胞。提取以上篩選出的⑶235陽性細(xì)胞中的DNA，PCR擴(kuò)增出其中的siRNA編碼序列， 克隆入pCUH載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑取100個(gè)測序，再從測序得到 的siRNA編碼序列中隨機(jī)挑取12個(gè)進(jìn)行單獨(dú)驗(yàn)證(實(shí)施例2中詳述)，即分別將這12個(gè) siRNA按照其編碼序列化學(xué)合成與其相對應(yīng)的雙鏈siRNA (由Invitrogen合成)，以排除載 體可能對細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性影響，以驗(yàn)證每個(gè)siRNA誘導(dǎo)紅系分化的作用。實(shí)施例2 :12個(gè)siRNA使K562細(xì)胞的⑶235表達(dá)不同程度增加除12個(gè)隨機(jī)合成的siRNA之外，設(shè)立一個(gè)陰性對照組(Con)轉(zhuǎn)染時(shí)只加轉(zhuǎn)染試 劑 HiPerFect Transfection Reagent，不力卩 siRNA 組。以實(shí)施例1的方法培養(yǎng)K562細(xì)胞，并在細(xì)胞達(dá)到(匯合度約60%時(shí))時(shí)，用 HiPerFect Transfection Reagent (購自 Qiagen，Cat#301704)將這些 siRNA 雙鏈分別單 獨(dú)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，每次轉(zhuǎn)染時(shí)siRNA的濃度為25nM，第一次轉(zhuǎn)染后60小時(shí)進(jìn)行第二次 轉(zhuǎn)染，以第二次轉(zhuǎn)染后48小時(shí)72小時(shí)收集細(xì)胞，用于檢測紅系分化的指標(biāo)，從而鑒定這些SiRNA誘導(dǎo)紅系分化的作用。檢測分別以12個(gè)SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞的⑶235表達(dá)各組細(xì)胞兩次轉(zhuǎn)染 后72小時(shí)收集細(xì)胞，用FITC標(biāo)記的抗CD235抗體(購自BD Pharmingen，貨號559943) 4°C 染色1小時(shí)，PBS (磷酸鹽緩沖液)洗細(xì)胞3次后用Accuri公司的Accuri C6流式細(xì)胞儀 檢測⑶235的表達(dá)。測試結(jié)果如圖1所示，圖1是各SiRNA轉(zhuǎn)染后⑶235陽性細(xì)胞比例的流式細(xì)胞儀 檢測圖，從中可以看出，12個(gè)siRNA中有6個(gè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后72小時(shí)可使⑶235陽性 細(xì)胞百分比較陰性對照(Con)增加到1.5倍以上，其中cl0ne-67siRNA使陽性細(xì)胞百分比 升高的程度最高，因此預(yù)計(jì)cl0ne-67siRNA對K562細(xì)胞具有最強(qiáng)的誘導(dǎo)紅系分化能力，選 取該clone-67進(jìn)行以下多個(gè)紅系分化指標(biāo)的檢測。實(shí)施例3 :clone-67siRNA使K562細(xì)胞的CD235表達(dá)增加CD235細(xì)胞的培養(yǎng)方式和轉(zhuǎn)染方式同實(shí)施例2，除實(shí)施例2中獲得的 cl0ne-67siRNA之外，所有鑒定實(shí)驗(yàn)均設(shè)立兩個(gè)陰性對照組(除非另外指出，以下各實(shí)施 例中的陰性對照與此相同)轉(zhuǎn)染時(shí)只加轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect Transfection Reagent，不 加siRNA組(Con組)；轉(zhuǎn)染不作用于任何基因的陰性對照Allstars negative control siRNA(購自 Qiagen，Cat#1027280)組(Allstars 組)。檢測以clone_67siRNA、Con和Allstars瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞的CD235表達(dá)各 組細(xì)胞兩次轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收集細(xì)胞，用FITC標(biāo)記的抗⑶235抗體(購自BD Pharmingen, 貨號559943) 4°C染色1小時(shí)，PBS (磷酸鹽緩沖液)洗細(xì)胞3次后用Accuri公司的Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測⑶235的表達(dá)。測試樣品制備和測定方法100ulPBS緩沖液中5x10s 個(gè)細(xì)胞，加0. 5ug抗體，流式細(xì)胞儀在525nm處用儀器設(shè)定程序Protocol :525nm. PRO收集 20000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上。測試結(jié)果如圖2和表1所示，圖2A是⑶235表達(dá)量的流式細(xì)胞儀檢測圖，其中左圖 是Con的細(xì)胞流式分析，中間圖是Allstars的細(xì)胞流式分析，右圖是cl0ne-67siRNA的細(xì) 胞流式分析，圖2B是上述3個(gè)分析結(jié)果的疊加圖，圖2C是顯示上述3組的⑶235陽性細(xì)胞 的百分比的柱狀圖。圖中的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差是3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。** 代表顯著性t檢驗(yàn)ρ < 0. 01。從中可以看出與Con陰性對照相比，clone-67siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染K562細(xì)胞后72小時(shí)可使⑶235陽性細(xì)胞百分比從平均16. 57%增加到平均61. 46%，統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析有顯著差異，且細(xì)胞的CD235表達(dá)強(qiáng)度顯著增加，而Allstars陰性對照對K562細(xì) 胞的⑶235表達(dá)無明顯改變。表1.⑶235陽性細(xì)胞的百分比 實(shí)施例4 :clone-67siRNA使K562細(xì)胞的ε -珠蛋白、γ -珠蛋白和β -珠蛋白的 表達(dá)增加⑶235細(xì)胞的培養(yǎng)方式和轉(zhuǎn)染方式同實(shí)施例2，檢測以clone-67siRNA、Con和Allstars瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞的ε-珠蛋白、Y-珠蛋白和β _珠蛋白的相對表達(dá)以 Taqman熒光定量PCR法檢測珠蛋白相對于內(nèi)參基因β -肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量，Taqman引物及 探針(表2)由ABI公司的PrimerExpress 2. 0軟件設(shè)計(jì)。引物由Invitrogen公司合成， 探針由Takara公司合成。以Trizol (購自Invitrogen，貨號15596-026)提取細(xì)胞總RNA，提取方法為按 每3. 5cm直徑的培養(yǎng)皿面積加Trizol 1ml，充分混勻裂解細(xì)胞，室溫放置5分鐘，每Iml Trizol加0. 2ml氯仿，劇烈混勻，室溫放置3分鐘，4°C下12000g離心15分鐘，取上層液相， 按每Iml Trizol量加0. 5ml異丙醇，充分混勻，室溫放置10分鐘，4°C下12000g離心10分 鐘，吸棄上清，用75%乙醇洗RNA沉淀一次，將RNA沉淀晾干，用無RNase水溶解，紫外定量。 取 3ug 總 RNA用superscript II Reverse Transcriptase (購自 Invitrogen)按照說明書 的方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體積為20ul，從產(chǎn)物中取出Iul用iQ Multiplex Powermix (購 自Bio-Rad)在Biorad公司的iQ5熒光定量PCR儀上進(jìn)行二重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)(儀器參 數(shù))，熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)第一步95°C 3分鐘，第二步95°C 15秒，第三步57°C 55秒， 第二、第三步重復(fù)40個(gè)循環(huán)。珠蛋白的表達(dá)量先以內(nèi)參基因肌動(dòng)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn) 化，轉(zhuǎn)染cl0ne-67siRNA組的標(biāo)準(zhǔn)化珠蛋白表達(dá)量再進(jìn)一步以Con組的標(biāo)準(zhǔn)化珠蛋白表達(dá) 量(設(shè)定為1.0)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果表示為珠蛋白的相對表達(dá)倍數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立 重復(fù)3次，結(jié)果表示為3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。表2用于定量PCR實(shí)驗(yàn)的Taqman引物和探針序列 引物及探針序列均為5’ 一 3’測試結(jié)果如圖3所示，A顯示了上述3組的ε -珠蛋白的相對表達(dá)量，B顯示了上 述3組的Y-珠蛋白的相對表達(dá)量，C顯示了上述3組的β-珠蛋白的相對表達(dá)量，均表 示為均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 3)。**代表顯著性t檢驗(yàn)ρ <0.01。由圖可知與Con陰性對照 相比，clone-67siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后72小時(shí)可使細(xì)胞的ε-珠蛋白、γ-珠蛋白和 β-珠蛋白的表達(dá)分別增加1.9、1. 6及2倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異。Allstars陰性對照 對Κ562細(xì)胞的珠蛋白表達(dá)無明顯改變。實(shí)施例5 :clone-67siRNA使K562細(xì)胞的GATA-2表達(dá)降低
⑶235細(xì)胞的培養(yǎng)方式和轉(zhuǎn)染方式同實(shí)施例2，檢測以clone-67siRNA、Con和 Al 1 stars瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞的GATA-2和GATA-1表達(dá)。按照標(biāo)準(zhǔn)Western法進(jìn)行 檢測，其中抗GATA-2和GATA-I多克隆抗體及抗β _肌動(dòng)蛋白單克隆抗體均購自Santa Cruz (貨號 sc-9008 及 sc-13053)。二抗為 Goat anti-rabbit IgG-HRP 禾口 goat anti-mouse IgG-HRP (均購自 SantaCruz，貨號 sc-2004 及 sc-2005)。顯色試劑盒為 ECL Plus Western BlottingDetection Reagents (購自 Amersham&Phamacia，貨號 RPN2132)。具體實(shí)驗(yàn)步驟 為常規(guī)聚丙稀酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后利用轉(zhuǎn)膜儀(購自Bio-Rad，貨號170-3940)按 轉(zhuǎn)膜儀說明書將電泳蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用脫脂奶封閉液室溫封閉膜1小時(shí)，用孵育液將 一抗1 400稀釋，將膜浸入一抗稀釋液中，4°C過夜，用TBS洗液室溫洗膜3次，每次15分 鐘，用孵育液將二抗1 4000稀釋，將膜浸入二抗稀釋液中，室溫1小時(shí)，用TBS洗液室溫 洗膜 3 次，每次 15 分鐘，將膜取出，按 ECL Plus Western BlottingDetection Reagents 試 劑盒說明書，用試劑盒中的ECL試劑覆蓋膜，室溫放置1分鐘后，曝光X光片。以上Western blot所用的封閉液、孵育液及TBS洗液的具體配方按照分子生物學(xué)教科書配置。以上實(shí)驗(yàn) 均獨(dú)立重復(fù)3次。檢測結(jié)果如圖4所示，A顯示對GATA-2的表達(dá)量的影響，B顯示對GATA-I的表達(dá) 量的影響。從圖中可知，與Con陰性對照相比，clone-67siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后72小 時(shí)可使細(xì)胞的GATA-2表達(dá)降低，而GATA-I的表達(dá)無明顯改變，Allstars陰性對照對K562 細(xì)胞的GATA-2和GATA-I表達(dá)均無明顯改變。實(shí)施例6 :clone-67siRNA使K562細(xì)胞在軟瓊脂和液體培養(yǎng)基中的增殖速度減慢⑶235細(xì)胞的培養(yǎng)方式和轉(zhuǎn)染方式同實(shí)施例2，軟瓊脂集落生長實(shí)驗(yàn)按照 CytoSelect 96-ffell Cell Transformation Assay kit (購自 CellBiolabs)的說明書 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每組(每組3個(gè)孔)細(xì)胞均按3000個(gè)/孔的密度接種于96孔板上，37°C 5% C02條件下培養(yǎng)8天后對集落中的細(xì)胞數(shù)用FLUOstar多功能微板測試儀(購自BMG)在 485/520nm (激發(fā)/發(fā)射)波長處進(jìn)行定量檢測。液體培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖速度的檢測按照CellTiter 96 aqueousone-solution cell proliferation assay kit (購自Promega)的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用FLUOstar多功能微 板測試儀(每組3個(gè)孔)(購自BMG)在492nm處測量吸光值。以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，A是各組細(xì)胞在軟瓊脂上的增殖速度，B是各組細(xì)胞在液體 培養(yǎng)基中的增殖速度。從中可以看出，與Con陰性對照相比，clone-67siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染K562 細(xì)胞48小時(shí)后細(xì)胞在軟瓊脂上的增殖速度減慢，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有差異；在液體培養(yǎng)基中的增 殖速度也減慢，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異。結(jié)果表示為3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。** 代表顯著性t檢驗(yàn)ρ < 0. 01，*代表顯著性t檢驗(yàn)ρ < 0. 05。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，根據(jù)以上描述中公開內(nèi)容和具體實(shí)施方式
可以容易地 設(shè)計(jì)其它等同實(shí)施方式的基礎(chǔ)，從而實(shí)現(xiàn)與本發(fā)明相同的目的，例如以cl0ne-67siRNA的 序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行在其序列兩端各添加1 3個(gè)任意核苷酸也會(huì)取得同樣的誘導(dǎo)分化效果， 這是因?yàn)閟iRNA的作用機(jī)制是對同源序列的調(diào)控，已表明siRNA的作用效果主要取決于其 中間的核心序列，而靠近兩側(cè)的堿基序列對其作用效果的影響較小，且在siRNA的兩側(cè)添 加1 3個(gè)核苷酸不但不會(huì)減弱該siRNA的作用效果，還會(huì)增強(qiáng)siRNA的效果。本領(lǐng)域技術(shù) 人員還會(huì)意識到，這種等同實(shí)施方式不背離所附權(quán)利要求書中闡明的本發(fā)明精神和范圍。
權(quán)利要求
一種雙鏈RNA分子，其雙鏈互補(bǔ)序列分別是含有以下序列的序列SEQ NO.15’ACAUGUACAUAGGGAUAUC3’；和SEQ NO.25’GAUAUCCCUAUGUACAUGU3’，其中在SEQ NO.1和SEQ NO.2的5’端和/或3’端延伸有1～3個(gè)任意核苷酸。
2.一種雙鏈RNA分子，其雙鏈互補(bǔ)序列分別是以下的序列 SEQ NO. 1 :5’ ACAUGUACAUAGGGAUAUC3’ ；禾口SEQ NO. 2 :5’ GAUAUCCCUAUGUACAU⑶3’。
3.如權(quán)利要求1或2所述的雙鏈RNA分子在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系K562紅系分化的藥 物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述雙鏈RNA分子使腫瘤細(xì)胞系K562的CD235表達(dá) 增加、ε-珠蛋白表達(dá)增加、Y-珠蛋白表達(dá)增加、β-珠蛋白表達(dá)增力口、GATA-2表達(dá)降低、 和/或細(xì)胞增殖速度減慢。
5.如權(quán)利要求1或2所述的雙鏈RNA分子在制備治療人慢性髓樣白血病的藥物中的應(yīng)用。
6.編碼如權(quán)利要求1或2所述的雙鏈RNA分子的DNA分子。
7.包含如權(quán)利要求5所述的DNA分子的核酸載體。
8.如權(quán)利要求5所述的DNA分子和/或如權(quán)利要求6所述的核酸載體在制備誘導(dǎo)腫瘤 細(xì)胞系Κ562紅系分化的藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述DNA分子和/或所述核酸載體使腫瘤細(xì)胞系 Κ562的⑶235表達(dá)增加、ε-珠蛋白表達(dá)增加、γ -珠蛋白表達(dá)增加、β -珠蛋白表達(dá)增力口、 GATA-2表達(dá)降低、和/或細(xì)胞增殖速度減慢。
10.如權(quán)利要求5所述的DNA分子和/或如權(quán)利要求6所述的核酸載體在制備治療人 慢性髓樣白血病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的小分子RNA，及其在在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系K562紅系分化中的應(yīng)用。所述小分子RNA不僅具有siRNA的廉價(jià)、無毒副作用、持續(xù)時(shí)間長、轉(zhuǎn)染效率高等有利效果，而且與現(xiàn)有人白血病細(xì)胞紅系分化siRNA誘導(dǎo)劑相比作用強(qiáng)、對腫瘤細(xì)胞分化的多種指標(biāo)有效。
文檔編號C12N15/63GK101892235SQ20101022841
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者盧雅彬, 朱寧, 熊元, 范翠青, 陳梅紅 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司