專利名稱：一種高效生產(chǎn)2-o-葡萄糖基抗壞血酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)2-0-葡萄糖基抗壞血酸的方法，尤其是采用生物法高效生 產(chǎn)2-0-葡萄糖基抗壞血酸的方法。
背景技術(shù)：
L-抗壞血酸(簡稱VC)在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理作用，但其還原性強(qiáng)，極不穩(wěn)定， 這使得它在應(yīng)用上受到了很大的限制。VC的衍生物則大大提高了它的穩(wěn)定性，而不影響它 的生理功能。本專利就其衍生物之一 2-0-葡萄糖基抗壞血酸在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下的生 物合成。2-0-葡萄糖基抗壞血酸是L-抗壞血酸的一種重要衍生物，有著比L-抗壞血酸更 廣泛的應(yīng)用價值。1990年日本林原生物化學(xué)研究所與R山大學(xué)藥學(xué)系共同發(fā)現(xiàn)2-0-葡萄 糖基抗壞血酸AA-2G，并已確定大量合成這種維生素C衍生物的方法。目前，能進(jìn)行規(guī)?；?生產(chǎn)的也只有Hayashibara有限公司。當(dāng)前，對2-0-葡萄糖基抗壞血酸的研究主要集中于其生理功能。對于產(chǎn)量的提高 主要通過篩選能產(chǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶和優(yōu)化發(fā)酵過程中的參數(shù)等來提高轉(zhuǎn)化效率。曹新志(曹新 志，劉芳，明紅梅，武玉娟.2008.酶法合成葡萄糖基-L-抗壞血酸的產(chǎn)酶條件及轉(zhuǎn)化條件 優(yōu)化，農(nóng)產(chǎn)品加工.學(xué)刊，124:19-24.)提出了一種利用環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化L-抗壞血酸和 3 -環(huán)糊精生成_葡萄糖基L-抗壞血酸的方法，優(yōu)化條件后其產(chǎn)量僅為95. 36mg/L。黃敏 (黃敏，裘娟萍.2004.生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-0- a _D_吡喃型葡萄糖基_L_抗壞血酸的研究進(jìn) 展，工業(yè)微生物，34 41-44)等通過對酶法生產(chǎn)葡萄糖基維生素C的產(chǎn)酶條件及轉(zhuǎn)化條件的 優(yōu)化得到AA-2G產(chǎn)量為420mg/L。較低的產(chǎn)量影響了 2_0_葡萄糖基抗壞血酸的大規(guī)模生 產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效生產(chǎn)2-0-葡萄糖基抗壞血酸的方 法。本發(fā)明利用環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶高效的轉(zhuǎn)化合成2-0-葡萄糖基抗壞血酸的性質(zhì)，優(yōu) 化生產(chǎn)工藝，顯著提高了 2-0-葡萄糖基抗壞血酸產(chǎn)量，取得了意想不到的效果。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為利用環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶催化抗壞血酸與0 -環(huán)糊精的混合溶液合成2-0-葡 萄糖基抗壞血酸。所述催化參數(shù)為:pH 4. 5-6. 5 ；溫度為:35°C -45°C;振蕩速率100-250轉(zhuǎn)/分鐘； 時間12-48h。所述抗壞血酸與0 -環(huán)糊精的混合溶液為抗壞血酸濃度25-100g/L ； 0 -環(huán)糊精 濃度 25-100g/L。所述環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶用量為50-200U/mL。所述環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶來源于產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶菌株。
所述菌株為軟芽孢桿菌(Peanibacillus macerans JFB05-01)，保藏編號為CCTCC NO :M208063。所述菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。本發(fā)明提供的技術(shù)方案以廉價的環(huán)糊精為底物，降低了生產(chǎn)成本。利用環(huán)糊 精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，使2-0-葡萄糖基抗壞血酸產(chǎn)量提高了進(jìn)10倍，達(dá)到 8. 5g/L，取得了意想不到的效果。
具體實施例方式實施例lPaenibacillus macerans環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的制備軟芽孢桿菌(Peanibacillusmacerans JFB05-01)，保藏編號為 CCTCC NO :M 208063，可在中國典型培養(yǎng)物保藏中心購買，為本實驗室提交菌株。取一環(huán)斜面菌體接種至 裝有80mL種子培養(yǎng)基的500ml。三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，37°C培養(yǎng)18h。將 培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照10% (體積比)的接種量，接種至裝有80mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，37°C發(fā)酵培養(yǎng)24h，HYG II型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜的轉(zhuǎn)速為200r/min。停止 發(fā)酵后將發(fā)酵液經(jīng)12000r/min離心20min，取上清即為粗酶。種子培養(yǎng)基(g^L—1)組成為可溶性淀粉40，蛋白胨25，玉米漿5，MgS04 -7H20 0. 5， CaCl20. 7，K2HP04 3H20 1，NaH2P04 2H20 2，NaN032, pH 值 7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g*L_0組成為玉米淀粉20，蛋白胨5，玉米漿浸出汁5，硫酸銨8， K2HP04 3H20 1，NaH2P04 12H20 2，NaN032, pH 值 7. 0，121°C 滅菌 15min。實施例2Bacillus licheniformis環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的制備取一環(huán)斜面菌體接種至裝有40mL種子培養(yǎng)基的250mL。三角瓶中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速 為200r/min，38°C培養(yǎng)12h。將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照10% (體積比)的接種量，接種至 三角瓶(250mL)裝產(chǎn)酶培養(yǎng)基40mL中，接種后于38°C恒溫振蕩培養(yǎng)96h后，4000r/min離 心20min，上清液即為粗酶液。種子培養(yǎng)基(gO組成為可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母膏5，MgS04 7H200. 2， K2HP04 3H20 1，NaH2P04 2H20 1，NaC035, pH 值 7. 0，121°C 滅菌 15min。發(fā)酵培養(yǎng)基(gO組成為可溶性淀粉10，蛋白胨5，酵母膏5，MgS04 7H200. 2， K2HP04 3H20 1，NaH2P04 2H20 2，Na2C032, pH 值 7. 0，121°C 滅菌 15min。實施例3合成2-0-葡萄糖基抗壞血酸將抗壞血酸與0 -環(huán)糊精溶于100mM的醋酸緩沖中，制備其混合溶液，加入環(huán)糊精 葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶粗酶液，使抗壞血酸濃度為50g/L，3 -環(huán)糊精濃度為50g/L，環(huán)糊精葡萄糖 苷轉(zhuǎn)移酶濃度為160U/mL。調(diào)整pH為5. 5，溫度為37°C，避光避氧，100轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)24h。反應(yīng)的過程 中取樣，利用HPLC檢測2-0-葡萄糖基抗壞血酸生成情況，當(dāng)反應(yīng)到達(dá)24h時，2-0-葡萄糖 基產(chǎn)量達(dá)到7g/L。2-0-葡萄糖基抗壞血酸測定方法(HPLC法)液相儀Agilent 1200液相儀色譜柱AgilentSB_Aq流速0. 5mL/min
檢測器DAD柱溫25°C檢測波長238nm流動相6. 86g KH2P04, 5mL甲醇，溶于1000mL超純水，用磷酸調(diào)pH至2. 0。實施例4合成2-0-葡萄糖基抗壞血酸將抗壞血酸與0 -環(huán)糊精溶于100mM的醋酸緩沖中，制備其混合溶液，加入環(huán)糊精 葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶粗酶液，使抗壞血酸濃度為50g/L，3 -環(huán)糊精濃度為25g/L，環(huán)糊精葡萄糖 苷轉(zhuǎn)移酶濃度為100U/mL。調(diào)整pH為4. 5，溫度為45°C，避光避氧，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)24h。反應(yīng)的過程 中取樣，利用HPLC檢測2-0-葡萄糖基抗壞血酸生成情況，當(dāng)反應(yīng)到達(dá)24h時，2-0-葡萄糖 基產(chǎn)量達(dá)到7. 5g/L。2-0-葡萄糖基抗壞血酸測定方法(HPLC法)同實施例3。實施例合5成2-0-葡萄糖基抗壞血酸將抗壞血酸與0 -環(huán)糊精溶于lOOmM的醋酸緩沖中，制備其混合溶液，加入環(huán)糊精 葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶粗酶液，使抗壞血酸濃度為100g/L，3 -環(huán)糊精濃度為100g/L，環(huán)糊精葡萄 糖苷轉(zhuǎn)移酶濃度為200U/mL。調(diào)整pH為6. 5，溫度為35°C，避光避氧，250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)12h。反應(yīng)的過程 中取樣，利用HPLC檢測2-0-葡萄糖基抗壞血酸生成情況，當(dāng)反應(yīng)12h時，2-0-葡萄糖基產(chǎn) 量達(dá)到8. 5g/L。2-0-葡萄糖基抗壞血酸測定方法(HPLC法)同實施例3。實施例合6成2-0-葡萄糖基抗壞血酸將抗壞血酸與0 -環(huán)糊精溶于100mM的醋酸緩沖中，制備其混合溶液，加入環(huán)糊精 葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶粗酶液，使抗壞血酸濃度為100g/L，3 -環(huán)糊精濃度為100g/L，環(huán)糊精葡萄 糖苷轉(zhuǎn)移酶濃度為50U/mL。調(diào)整pH為5，溫度為38°C，避光避氧，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)48h。反應(yīng)的過程中 取樣，利用HPLC檢測2-0-葡萄糖基抗壞血酸生成情況，當(dāng)反應(yīng)到達(dá)48h時，2-0-葡萄糖基 產(chǎn)量達(dá)到7g/L。2-0-葡萄糖基抗壞血酸測定方法(HPLC法)同實施例3。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種高效生產(chǎn)2 O 葡萄糖基抗壞血酸的方法，其特征在于利用環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶催化抗壞血酸與β 環(huán)糊精的混合溶液合成2 O 葡萄糖基抗壞血酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶來源于產(chǎn)環(huán)糊 精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述菌株為軟芽孢桿菌(Peanibacillus maceransJFB05-01)，保藏編號為 CCTCC NO :M 208063。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述環(huán)糊精葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶用量為 50-200U/mLo
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述催化參數(shù)為pH4. 5-6. 5 ；溫度為 350C -450C ；振蕩速率100-250 轉(zhuǎn) / 分鐘；時間12_48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述抗壞血酸與β-環(huán)糊精的混合溶液為 抗壞血酸 25-100g/L ； β -環(huán)糊精 25-100g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效生產(chǎn)2-O-葡萄糖基抗壞血酸的方法。該方法以L-抗壞血酸和β-環(huán)糊精為底物轉(zhuǎn)化合成2-O-葡萄糖基抗壞血酸，合成條件為溫度35℃-45℃，pH 4.5-6.5，β-環(huán)糊精濃度25-100g/L，抗壞血酸濃度25-100g/L，糖基轉(zhuǎn)移酶用量50-200U/mL。本發(fā)明的方法操作簡單，容易控制，轉(zhuǎn)化條件要求寬泛，2-O-葡萄糖基抗壞血酸產(chǎn)量高，產(chǎn)量可達(dá)8.5g/L，為生物轉(zhuǎn)化法大規(guī)模生產(chǎn)2-O-葡萄糖基抗壞血酸提供了可能。
文檔編號C12P19/60GK101914601SQ20101024846
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者劉龍, 堵國成, 張子臣, 李江華, 陳堅 申請人:江南大學(xué)