專利名稱：一種山羊產(chǎn)羔性狀的分子標(biāo)記選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種山羊產(chǎn)羔性狀的分子標(biāo)記選擇方法， 該方法采用檢測山羊干細(xì)胞因子(Kit ligand, KITL)基因內(nèi)含子1和6堿基突變多態(tài)性， 并分析其對產(chǎn)羔數(shù)的影響，結(jié)果表明=KITL基因由引物Pl和P2檢測的SNPs位點(diǎn)可作為山 羊產(chǎn)羔性狀選擇分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)的問世和電泳技術(shù)的改進(jìn)，各種分子遺傳標(biāo)記技術(shù)隨之興起，這些技術(shù) 給家畜的遺傳改良和新品種的培育提供了新的途徑和方法。特別是分子標(biāo)記技術(shù)與常 規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，孕育出一種全新的選種方式一標(biāo)記輔助選擇法(Marker assistant selection)。它可以克服傳統(tǒng)選種過程中根據(jù)表型選擇導(dǎo)致的環(huán)境偏差和抽樣誤差，提高 家畜選種的準(zhǔn)確性和高效性，加快優(yōu)良品種的選育，進(jìn)一步推動(dòng)我國畜牧業(yè)的發(fā)展。單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotide Polymorphisms, SNP)就是指基因組 DNA 序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNPs可以是兩個(gè)或多個(gè)等位基 因的多態(tài)，因此，通常所說的SNPs包括堿基的插入、缺失、插入/缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù) 的變化。一個(gè)SNP表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)核苷酸的變化，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換 (以一種嘧啶置換另一種嘧啶或一種嘌呤置換另一種嘌呤)以及顛換(嘌呤與嘧啶互換)所 引起。具有顛換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上，因?yàn)镃pG (核苷酸 對，其中G在DNA鏈中緊隨C后)二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中 大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附 近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs (cSNPs)、基因周邊SNPs (pSNPs)和基因間SNPs (iSNPs)等三類?？偟恼f來，cSNP比較少， 因?yàn)樵诰幋a區(qū)內(nèi)的變異率僅占有周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要 意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即 SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含 義”相同；另一種是非同義cSNPs，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋 白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)SNPs的非同義突變來說， 它們可能對基因功能有直接的重要影響，尤其對于編碼區(qū)突變來說，更可能會導(dǎo)致所編碼 的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響它的功能的發(fā)揮。基因序列上堿基的插入/缺失突變，同樣 將導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列改變，以致影響到蛋白的生物學(xué)功能，從 而造成對個(gè)體的表現(xiàn)型具有重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳 標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs 可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs很罕見， 故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs 即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核 苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測方法， 但是，其檢測費(fèi)用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時(shí)，在測序過程中需要非 常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢 測方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當(dāng)降低檢測費(fèi)用，但是， PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過程比較長，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陰性問題，所以，也并非 理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具 有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)， 檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷 酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測 平臺，對于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來說可實(shí)施性不強(qiáng)。Kit是976個(gè)氨基酸的蛋白，屬于跨膜酪氨酸激酶受體家族III型，其成熟蛋白的 分子量為 125 160kDa。Kit 的配體 KitL (Kit ligand, stem cell factor, SCF)是 248 個(gè)氨基酸的單體，其中189個(gè)氨基酸在胞外域，23個(gè)氨基酸在跨膜部分，36個(gè)氨基酸在胞質(zhì) 區(qū)。KitL存在兩種不同的形式，可溶性KitL (KitLl)和膜結(jié)合KitL (KitL2)。Kit和KitL 在造血干細(xì)胞和肥大細(xì)胞的維持和生存上起作用。Kit和KitL還在配子形成、黑素形成、血 細(xì)胞形成過程中起重要作用。Kit和KitL分別由Steel和White spotting基因編碼，這兩 個(gè)位點(diǎn)突變的小鼠可以證明，Kit和KitL在PGCs的生存、遷移、增殖以及卵泡的發(fā)育中起 作用。KitL通過與Kit結(jié)合，激活了調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的信號通路，并激活了 PI3K通路，PI3K 通路在卵母細(xì)胞生長中起重要的調(diào)節(jié)作用。在小鼠卵巢中，Kit在膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞中表達(dá)，而KitL在顆粒細(xì)胞中表達(dá)。Kit 在卵子發(fā)生時(shí)期的卵原細(xì)胞有絲分裂過程中大量表達(dá)，并且在卵母細(xì)胞發(fā)育的所有時(shí)期都 表達(dá)。KitL mRNA在早期有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)很高，在后期有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中表 達(dá)下降。卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間存在著重要的相互作用。卵母細(xì)胞在生長、增殖、成熟和 受精的全過程中始終與顆粒細(xì)胞通過間隙連接保持著聯(lián)系，這種聯(lián)系對卵母細(xì)胞和顆粒細(xì) 胞的生長和增生都很重要。因此，Kit和KitL這一對受體-配體的相互作用，在卵母細(xì)胞 和顆粒細(xì)胞的相互作用中也有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種一種山羊產(chǎn)羔性狀的分子標(biāo)記選擇方法，該方法采 用檢測山羊干細(xì)胞因子(Kit ligand,KITL)基因內(nèi)含子1和6堿基突變多態(tài)性，并分析多態(tài) 性與關(guān)中奶山羊、西農(nóng)薩能奶山羊和布爾山羊的產(chǎn)羔性狀之間的關(guān)系；結(jié)果表明KITL基 因由引物Pl和P2檢測的SNPs位點(diǎn)可作為山羊產(chǎn)羔性狀選擇的分子標(biāo)記。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種山羊產(chǎn)羔性狀的分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于，包括下列步驟 1)以山羊基因組DNA為模板，在Taq DNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下， 利用引物Pl和P2在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，篩查山羊KITL基因內(nèi)含子2和6的堿基突變； 所述的引物Pl如下
上游引物 1F:5' - TTCCTATGAGGTTACCAATG -3'；下游引物 IR 5' - GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT -3，。所述的引物P2如下
上游引物 2F 5 ‘ - AGAGTTCACAAGACAAGGTT -3 ‘； 下游引物 2R 5' - ATTAGGTTACTGGCGTTATG -3，。所述的PCR擴(kuò)增的條件是15 μ L反應(yīng)體系，包括10 μ mol/L上下引物各0. 6 μ L ；2X Reaction Mix 5.825 μ L ；DNA Polymerase 0. 125 μ L ；50 ng/μ L DNA 模板 0. 6 μ L ；超純水 7. 25 μ L ；
所述的PCR反應(yīng)程序如下
利用引物Pl的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 11^11，941變性308，49.61退火408， 72°C延伸40s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；
利用引物P2的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 min，94°C變性30s，56. 7°C退火35s， 72°C延伸35s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。2)根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對引物Pl和P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大小判定，用限制性 內(nèi)切酶CViJ II消化引物Pl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切后的 擴(kuò)增片段，發(fā)現(xiàn)引物Pl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物存在2個(gè)堿基的突變，即316bp處有一個(gè)T — C的 突變(Li位點(diǎn))，363bp處有一個(gè)G — T的突變(L2位點(diǎn))；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測P2 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，引物P2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物存在1個(gè)堿基的突變，即249bp處有一個(gè)G — C的突 變(L3位點(diǎn))。3)然后對引物Pl和P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，以及與關(guān) 中奶山羊、西農(nóng)薩能奶山羊和布爾山羊的產(chǎn)羔數(shù)之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如下
在Ll位點(diǎn)，純合型T1T1在316bp位的堿基是T，雜合型T1C1在316bp位的堿基是T\C， 純合型C1C1在316bp位的堿基是C ；
在L2位點(diǎn)，純合型G2G2在363bp位的堿基是G，雜合型G2T2在363bp位的堿基是G\T， 純合型T2T2在363bp位的堿基是T ；
在L3位點(diǎn)，純合型G3G3在249bp位的堿基是G，雜合型G3C3在249bp位的堿基是G\C， 純合型C3C3在249bp位的堿基是C。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下技術(shù)效果
明確了與山羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的功能基因KITL基因內(nèi)含子1和6的3個(gè)SNPs，這3個(gè)突 變能夠作為一個(gè)山羊產(chǎn)羔數(shù)分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更 準(zhǔn)確估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。本發(fā)明的方法為KITL基因的SNPs與山羊產(chǎn)羔性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便 用于山羊產(chǎn)羔性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的山羊種群。


圖1是利用引物Pl擴(kuò)增KITL基因內(nèi)含子1的瓊脂糖電泳圖，圖中M表示=Marker ； 圖2是利用引物P2擴(kuò)增KITL基因內(nèi)含子6的瓊脂糖電泳圖，圖中M表示=Marker ； 圖3是利用引物Pl擴(kuò)增KITL基因內(nèi)含子1的RFLP檢測圖，圖中，M表示=Marker ；1,8
和 12表示:Ι^(Τ316θ位點(diǎn)-T1T1 (316bp/170bp)，L2(G363T)位點(diǎn)-G2T2 (170bp/121bp/49bp)； 2 禾口 10 表示=L1 (T316C)位點(diǎn)-T1T1 (316bp/170bp)，L2 (G363T)位點(diǎn)-T2T2 (170bp) ；3 表示=L1 (T316C)位點(diǎn)-T1C1 (486bp/316bp/170bp)，L2 (G363T)位點(diǎn)-G2G2 (121bp/49bp);4 和 9 表示=L1 (T316C)位點(diǎn)-T1C1 (486bp/316bp/170bp), L2 (G363T)位點(diǎn)-T2T2 (170bp) ；5 表 示=L1 (T316C)位點(diǎn)-T1T1 (316bp/170bp), L2 (G363T)位點(diǎn)-G2G2 (121bp/49bp) ；6，7 和11 表示=L1 (T316C)位點(diǎn)-C1C1 (486bp)，L2 (G363T)位點(diǎn)-T2T2 (486bp)；
圖4是利用引物Pl擴(kuò)增KITL基因內(nèi)含子6的SSCP檢測圖，圖中，1，2和3表示GG基 因型；4和6表示CC基因型；5表示GC基因型； 圖5是KITL基因內(nèi)含子1的L1位點(diǎn)的測序圖； 圖6是KITL基因內(nèi)含子1的L2位點(diǎn)的測序圖； 圖7是KITL基因內(nèi)含子6的測序圖(L3位點(diǎn))。以下通過對山羊樣本采集及基因組DNA提取、檢測和濃度分析、山羊KITL基因內(nèi) 含子1和6擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯凝膠電泳分析實(shí)施例來進(jìn)一步對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式A、KITL基因內(nèi)含子1和6的PCR擴(kuò)增及其多態(tài)性的檢測 1、山羊血樣的采集及處理
取山羊血樣5 mL，加入0.2 μ L的ACD (檸檬酸2. 4g ；檸檬酸三鈉6. 6g ；葡萄糖7. 35g ； 定容至50mL，高壓滅菌)抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存?zhèn)溆?。本?shí)施例采用了 3個(gè)山羊群體共計(jì)681個(gè)母羊血樣，具體為西農(nóng)薩能羊血樣290 份，采自陜西省千陽薩能羊種羊場；關(guān)中奶山羊血樣193份，采自陜西周至綠色新世紀(jì)生物 有限公司；布爾山羊血樣198份，采自陜西麟游縣波爾山羊種羊場。2、血樣基因組DNA的提取、純化
1)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至1. 5 mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖 液，充分混勻，12000 r/min離心10 min (4°C )，棄去上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、 沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管 壁，37°C水浴1 h。DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超純水500mL，滅菌，調(diào)pH至8. 0，4°C保存?zhèn)溆谩?3)加蛋白酶K 3uL (20 mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加1 μ L蛋白酶κ混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動(dòng)離心管20 min,使其 充分混勻；4°C，12000 r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復(fù)一次。(5)加氯仿500 μ L，充分混勻20 min，4°C，12000 r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入 另一 1. 5mL離心管中。(6)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管 直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min。(7)4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用濃度為70%的冰冷乙醇漂洗DNA
沉淀2次。(8) 4°C,12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80°C保存。(10) 500 μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1%，加入蛋白酶K至終 濃度達(dá)到50 μ g/mL。(11)5°C保溫 IOh 左右。(12)用苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 1)混合物和氯仿分別抽提一次，其中的苯酚、 氯仿、異戊醇(25 24 1)混合物和氯仿等體積。(13) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。(14)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA。(15)倒掉液體，用濃度為70%乙醇洗滌后晾干，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待 檢測。3、DNA池的構(gòu)建
(1)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測
選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降解的 樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。(2) OD 值測定
用紫外光光度計(jì)測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值，并計(jì)算DNA含量和0D26(1/0D28。 的比值。如OD26tZOD28tl比值小于1. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若 比值大于1. 8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(μ g/mL) = 50 X OD260 值 X 稀釋倍數(shù) (3)品種DNA池的構(gòu)建
DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50 ng/μ L，然后從西農(nóng)薩能奶山羊290個(gè)個(gè)體、 濃度為50ng/ μ L的DNA的樣品中取5 μ L混合構(gòu)建成DNA池；按照同樣的方法構(gòu)建關(guān)中和 布爾山羊的DNA池。4、PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)
根據(jù)NCBI上GenBank提供的山羊KITL基因的序列(登錄號NC_007303)設(shè)計(jì)引物Pl 和P2，在PCR條件下分別擴(kuò)增內(nèi)含子1和6，篩查山羊KITL基因內(nèi)含子1和6的突變。引物Pl如下
上游引物 1F:5' - TTCCTATGAGGTTACCAATG -3'； 下游引物 IR 5' - GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT -3，。引物P2如下
上游引物 2F 5 ‘ - AGAGTTCACAAGACAAGGTT -3 ‘； 下游引物 2R 5' - ATTAGGTTACTGGCGTTATG -3，。5、PCR擴(kuò)增山羊KITL基因內(nèi)含子1和6
分別以3個(gè)山羊群體的DNA池為模版，以引物Pl和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件及程序 如下所示
所述的PCR擴(kuò)增的條件是15 μ L反應(yīng)體系，包括10 ymol/L上下引物各0.6 yL ； 2 X Reaction Mix 5.825 μ L ；DNA Polymerase 0. 125 μ L (2.5 U/μ L); 50 ng/μ L DNA 模板0.6 μ L ；超純水7. 25 μ L0
所述的PCR反應(yīng)程序如下利用引物Pl的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 11^11，941變性308，49.61退火408， 72°C延伸40s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；
利用引物P2的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5 min，94°C變性30s，56. 7°C退火35s， 72°C延伸35s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。6、PCR產(chǎn)物純化和測序
PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1和2所示，可以清楚看到 486bp (圖1)和430bp (圖2)的條帶，說明目的基因片段擴(kuò)增成功；
然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的 凝膠，放入1. 5 mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR 產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下
(1)首先向吸附柱中加入500 μ L平衡液BL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60 ！水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上 下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中 的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱
重新放入收集管中。(6)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將離心吸 附柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50 ！溫 箱數(shù)分鐘，徹底晾干。(7)將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫 緩沖液，室溫放置2min。12000r/min離心lmin，收集DNA溶液。(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步 馬聚7 ο把以上以3個(gè)山羊群體DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn) 行雙向測序，對測序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點(diǎn)有兩個(gè)不同峰是發(fā)生了單核苷酸突變; 在西農(nóng)薩能和關(guān)中奶山羊群體中，發(fā)現(xiàn)引物Pl的擴(kuò)增產(chǎn)物存在2個(gè)堿基的突變，即316bp 處有一個(gè)T — C的突變(Li位點(diǎn))，363bp處有一個(gè)G — T的突變(L2位點(diǎn))；在西農(nóng)薩能奶 山羊、關(guān)中奶山羊和布爾山羊群體中，引物P2擴(kuò)增產(chǎn)物存在1個(gè)堿基的突變，即249bp處有 一個(gè)G —C的突變(L3位點(diǎn))。B、山羊KITL基因內(nèi)含子1和6的3個(gè)SNPs的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
(1)利用引物Pl對3個(gè)山羊群體681份基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在西農(nóng)薩能和關(guān)中 奶山羊群體中，獲得483個(gè)包含山羊KITL基因內(nèi)含子1的DNA片段；然后利用如下方法對 每個(gè)山羊的KITL基因內(nèi)含子2進(jìn)行基因分型，具體方法如下
取引物Pl的PCR產(chǎn)物5 μ L，10XNEB緩沖液0.2 μ L，CVM II內(nèi)切酶0. 5 yL，加超 純水至20 μ L，在37°C的條件下，孵育2h。取5 μ L的酶切產(chǎn)物與1 μ L上樣緩沖液混合， 點(diǎn)樣于10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠溶液中，在4°C的條件下，IlOV衡壓條件下電泳1. 5h。電泳結(jié)束后，加入0.1%的硝酸銀溶液中，于搖床上輕搖10 min，然后用蒸餾水洗滌凝膠2 次，加入顯色液(5g的Na0H、0. Ig的Na2CO3，加入0. 5mL甲醛，定容至250 mL)，于搖床上輕 搖15min，然后用蒸餾水洗滌凝膠2，拍照保存(圖3)。(2)利用引物P2對3個(gè)山羊群體681份基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得681個(gè)包 含山羊KITL基因內(nèi)含子6的DNA片段；然后利用如下方法對每個(gè)山羊的KITL基因內(nèi)含子 6進(jìn)行基因分型，具體方法如下
取引物P2的PCR產(chǎn)物各5 μ L，與5 μ L的變性緩沖液(95%的甲酰胺、0. 5mol/L的 EDTA、0. 025% 二甲苯青FF和0. 025%的溴酚藍(lán))混合，95°C變性10 min,然后迅速放入冰水 混合物中作用10 min，最后點(diǎn)樣于10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠溶液中，在4°C的條件下， 250V電泳lOmin，之后150 V衡壓條件下電泳4h。電泳結(jié)束后，加入0. 1%的硝酸銀溶液中， 于搖床上輕搖lOmin，然后用蒸餾水洗滌凝膠2次，加入顯色液(5g的Na0H、0. Ig的Na2CO3, 加入0. 5mL甲醛，定容至250mL)，于搖床上輕搖15min，然后用蒸餾水洗滌凝膠2，拍照保存 (圖 4)。C、不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證
將利用引物Pl和P2的PCR產(chǎn)物的純合基因型和雜合基因型個(gè)體各挑出10個(gè)送至上 海生工進(jìn)行正反向測序，測序結(jié)果如圖5、6和7所示。D、SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析
基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。Paa = Νω/Ν，其中Paa代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；Naa表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)；N 為檢測群體的總數(shù)量。基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計(jì)算的公式 可以寫成PA= (2Nm + NAal + NAa2 +……+NAan)/2N。式中，Pa表示等位基因A頻率，Naa表 示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，NAai表示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，al-an為 等位基因A的η個(gè)不同的復(fù)等位基因；3個(gè)羊群體不同多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布、等位基因頻 率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表1所示。E、群體平衡性檢驗(yàn)
某基因位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡性檢測采用皮爾遜X2統(tǒng)計(jì)量，其公式為
其中， 為某一遺傳位點(diǎn)基因型應(yīng)有個(gè)數(shù)；i為基因型序號-A代表第i個(gè)基因型的實(shí) 際個(gè)體數(shù)量·’η為樣本數(shù)量.,Pi代表第i個(gè)基因型的理論頻率。山羊KITL基因內(nèi)含子1和內(nèi)含子6的SNPs的基因型分布、等位基因頻率和 Hardy-Weinberg平衡如表1所示。表1 :3個(gè)山羊品種的KITL基因的遺傳結(jié)構(gòu)分析
由表1可以看出，在L1位點(diǎn)，布爾山羊群體中不存在多態(tài)性，西農(nóng)薩能奶山羊和關(guān)中奶 山羊群體均處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)；在1^2位點(diǎn)，西農(nóng)薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和布爾山 羊群體均處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)，說明這3個(gè)山羊品種具有巨大的選種潛力。F、山羊KITL基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析
生產(chǎn)數(shù)據(jù)西農(nóng)薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和布爾山羊第1、2、3和4胎的產(chǎn)羔數(shù)。關(guān)聯(lián)分析樣本有完整產(chǎn)羔性狀記錄的關(guān)中奶山羊193頭、西農(nóng)薩能奶山羊290頭和布爾山羊198頭。關(guān)聯(lián)分析模型
利用SPSS (13.0)軟件分析品種、年齡、場和基因位點(diǎn)等因素與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性。先 對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特 征，利用t分析、ANOVA或多元線性模型分析基因型效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影產(chǎn)羔性狀的因素不同，考慮到場效應(yīng)(Farm)、品種效應(yīng) (Breed)、種公畜效應(yīng)(S)、種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)(SD)、年齡(Age)、基因型效應(yīng)(Genotype) 及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用了以下固定模型進(jìn)行分析，同時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行取舍。完整模 型如下
Yijtapq =^ + Farmi + Breedj + Sp+SDq+Agek+ Genotypem +Xn + eiJknmpq 其中yijhmM 個(gè)體表型記錄；μ 總體均值；Farmi 場別效應(yīng)；Breedj 品種效應(yīng)；SP 種公畜效應(yīng)；SDq 種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)；Agek 年齡效應(yīng)；Genotypem 標(biāo)記基因型效應(yīng)； Xn 為各種二級和二級以上互作效應(yīng)，如:FarmXBreed, FarmXAge, FarmXGenotype, BreedXAge, BreedXGenotype, AgeXGenotype, BreedXAgeXGenogype 等；eiJkn]npq 隨機(jī) 誤差；運(yùn)用SPSS (13. 0)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乘法擬合線性模型，對各基因型 間產(chǎn)羔性狀指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。分析結(jié)果如表2和3所示
表2 西農(nóng)薩能和關(guān)中奶山羊品種的KITL基因內(nèi)含子1不同基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān) 聯(lián)分析
同一列中不同小寫字母表示差異顯著<0. 05)，下表同。
表3 西農(nóng)薩能奶山羊、關(guān)中奶山羊和布爾山羊品種的KITL基因內(nèi)含子6不同基 因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析
統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，采用引物Pl和P2擴(kuò)增的山羊KITL基因內(nèi)含子1和6與關(guān)中奶山羊、 西農(nóng)薩能奶山羊和布爾山羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，因此，用引物Pl和P2檢測的SNPs位點(diǎn)可 用作山羊產(chǎn)羔性狀選擇的分子標(biāo)記。
權(quán)利要求
一種山羊產(chǎn)羔性狀的分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于，包括下列步驟1)以山羊基因組DNA為模板，在Taq DNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，利用引物P1和P2在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，篩查山羊KITL基因內(nèi)含子1和6的堿基突變；所述的引物P1如下上游引物1F5′ TTCCTATGAGGTTACCAATG 3′；下游引物1R5' GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT 3'。所述的引物P2如下上游引物2F5′ AGAGTTCACAAGACAAGGTT 3′；下游引物2R5' ATTAGGTTACTGGCGTTATG 3'；所述的PCR擴(kuò)增的條件是15μL反應(yīng)體系，包括10μmol/L的引物P1、P2的上下游引物各0.6 μL；2×Reaction Mix 5.825 μL；DNA Polymerase 0.125μL(2.5 U/μL)；50 ng/μL DNA 模板0.6 μL；超純水7.25 μL。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下利用引物P1的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，49.6℃退火40s，72℃延伸40s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；利用引物P2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，56.7℃退火35s，72℃延伸35s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；2)根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對引物P1和引物P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大小判定，用限制性內(nèi)切酶CviAⅡ消化引物P1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切后的擴(kuò)增片段，發(fā)現(xiàn)引物P1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物存在2個(gè)堿基的突變，即316bp處有一個(gè)T→C的突變L1位點(diǎn)，363bp處有一個(gè)G→T的突變L2位點(diǎn)；采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，引物P2擴(kuò)增產(chǎn)物存在1個(gè)堿基的突變，即249bp處有一個(gè)G→C的突變L3位點(diǎn)；3)對引物P1和引物P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，以及與關(guān)中奶山羊、西農(nóng)薩能奶山羊和布爾山羊的產(chǎn)羔數(shù)之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如下在L1位點(diǎn)，純合型T1T1在316bp位的堿基是T，雜合型T1C1在316bp位的堿基是T\C，純合型C1C1在316bp位的堿基是C；在L2位點(diǎn)，純合型G2G2在363bp位的堿基是G，雜合型G2T2在363bp位的堿基是G\T，純合型T2T2在363bp位的堿基是T；在L3位點(diǎn)，純合型G3G3在249bp位的堿基是G，雜合型G3C3在249bp位的堿基是G\C，純合型C3C3在249bp位的堿基是C。
全文摘要
一種山羊產(chǎn)羔性狀的分子標(biāo)記選擇方法，以山羊基因組DNA序列為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，利用引物P1和P2在PCR條件下分別擴(kuò)增KITL基因內(nèi)含子1和6，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判定目的片段的大小；用限制性內(nèi)切酶CviAⅡ消化引物P1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶切后的擴(kuò)增片段，引物P1的擴(kuò)增產(chǎn)物存在2個(gè)堿基的突變；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測引物P2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，引物P2的擴(kuò)增產(chǎn)物存在1個(gè)堿基的突變，然后對引物P1和P2的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，以及與關(guān)中奶山羊、西農(nóng)薩能奶山羊和布爾山羊的產(chǎn)羔數(shù)之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，表明KITL基因由引物P1和P2檢測的SNPs位點(diǎn)可作為山羊產(chǎn)羔數(shù)性狀選擇的分子標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK101899526SQ201010263060
公開日2010年12月1日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者侯金星, 安小鵬, 宋宇軒, 崔易虹, 曹斌云, 朱廣琴, 楊明明, 王建剛, 王韻斐, 陳秋菊 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)