專利名稱：一株苯并[a]芘高效降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境有機(jī)污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株新型降解高環(huán)多環(huán)芳烴苯并[a]芘(BaP)的真菌降解特性的篩選及其在污染土壤生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
^1^77 (polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs) Mi^MΦWWI/l 污染物，因?yàn)槟承㏄AHs具有“三致”效應(yīng)，16種PAHs被美國環(huán)保局列為環(huán)境優(yōu)先監(jiān)測污染物，其中五環(huán)的PAH-BaP因其高的致癌和致畸作用而被廣泛關(guān)注，是中國環(huán)境主要污染物之一。微生物修復(fù)技術(shù)是PAHs污染去除最主要的方式。雖然，微生物修復(fù)技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、 高效、無二次污染、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但是PAHs污染的微生物修復(fù)卻因高環(huán)(四環(huán)以上) PAHs的難降解性而受到限制。以往報(bào)道中，研究者發(fā)現(xiàn)了一系列的菌株能夠降解、共代謝氧化或是礦化部分的高環(huán)多環(huán)芳烴，其中包括紅球菌、洋蔥伯克氏菌、少動(dòng)鞘氨醇假單胞菌等，它們能以四環(huán)多環(huán)芳烴(如芘和屈)為唯一的碳源和能源進(jìn)行礦化作用，而能夠利用 BaP作為唯一的碳源和能源進(jìn)行降解的菌株非常少見。Sudarat等報(bào)道了由真菌一微紫青霉菌和細(xì)菌-嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌組成的復(fù)配菌群可以利用BaP作為唯一的碳源和能源進(jìn)行降解，但兩株菌單獨(dú)使用時(shí)都不能利用其作為唯一的碳源和能源，這也增加了實(shí)際修復(fù)中的難度。Rafin等篩選出一株腐皮鐮孢霉菌，能以BaP為唯一的碳源和能源進(jìn)行降解，但對(duì)BaP(100mg/L)的12d降解率僅為4%。因此，篩選一株能單獨(dú)、高效降解BaP的菌株是非常有科學(xué)價(jià)值和環(huán)境污染修復(fù)現(xiàn)實(shí)意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有BaP降解技術(shù)存在的瓶頸問題，提供一種能高效、 快速降解高濃度BaP的菌株，并對(duì)其降解特性進(jìn)行研究。本發(fā)明的另一目的是提供上述菌株進(jìn)行污染土壤生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的BaP高效降解真菌來源于北京焦化廠污染土壤，經(jīng)人工富集、篩分及純化所得到。經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定，該菌株具有以下分類學(xué)特征麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)上菌落生長快，25°C黑暗條件下3天菌落直徑65-70mm，初期白色，后期灰黑色，質(zhì)地絮狀，稀疏；菌落背面與正面同色，無水溶性色素。菌絲無色，光滑，多分枝，具分隔，寬2. 5-12. 1 μ m。培養(yǎng)后期形成少量黑點(diǎn)，為分生孢子器，發(fā)育成熟后分生孢子從孔口擠出。分生孢子深褐色，橢圓形或卵圓形，直，雙細(xì)胞。此外，進(jìn)行rRNA基因序列測定(包括 18SrRNA片段，ITSl、5. 8rRNA, ITS2的全序列及^S區(qū)序列片段)，最終，鑒定為可可毛色二 3 (Lasiodiplodia theobromae)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明菌株L. theobromae在無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)中，對(duì) BaP(100mg/L)10天降解率達(dá)到52. 5%，此外在加入營養(yǎng)物質(zhì)(ImL) 土豆培養(yǎng)基(PDA)、調(diào)節(jié)PH = 5及加入底物水楊酸和琥珀酸鈉時(shí)，都能促進(jìn)菌株對(duì)于BaP的降解，最高降解率可達(dá)58.7%。L. theobromae同樣能降解高濃度(200mg/L)的菲(PHE)和芘(PYR)，對(duì)三者的降解能力PHE > PYR > BaP。此外L. theobromae在優(yōu)化條件(ImL PDA, pH = 5，水楊酸 (200mg/L))下對(duì)于BaP染毒(50mg/L) 土壤35天降解率可達(dá)到51. 4%，對(duì)于實(shí)際焦化廠污染土壤中16種PAHs 20天的降解率達(dá)到39.0% 96.7%，降解率隨著苯環(huán)數(shù)增加而降低。 利用這些特點(diǎn)，本發(fā)明L. theobromae可用于降解單一高環(huán)多環(huán)芳烴BaP或PAHs，或者用于 PAHs污染土壤的生物修復(fù)，并為利用BaP作為唯一碳源和能源進(jìn)行降解提供了一種新的種質(zhì)資源。


圖1L. theobromae對(duì)MSM及PDA加入體系中BaP的降解比較2L. theobromae對(duì)不同pH下BaP的降解比較3添加不同代謝底物L(fēng). theobromae對(duì)BaP的降解比較 4L. theobromae 對(duì) PHE、PYR 和 BaP 的降解比較5初始和優(yōu)化條件下L. theobromae對(duì)土壤中BaP的降解比較6L. theobromae對(duì)實(shí)際焦化廠污染土壤中PAHs的降解圖
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1 :BaP降解菌L. theobromae的篩選分離。45mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)中加入5g焦化廠污染土壤和20顆玻璃珠，搖床振蕩培養(yǎng)1 后靜置。取5mL靜置分層后的上清液于含有45mL MSM(BaP濃度25mg/L)的滅菌三角瓶中，300C、150r/min避光振蕩培養(yǎng)。5d后，取5mL菌液轉(zhuǎn)移至BaP濃度為50mg/L的MSM 中，重復(fù)上述步驟，依次提高BaP濃度為25，50，75，100mg/L。在富集培養(yǎng)過程中，在MSM中加入了少量葡萄糖(每IOOmL MSM加入0. Ig葡萄糖)加快微生物生長。將最后一周期的培養(yǎng)液涂布于含有BaP(100mg/L)的牛肉膏固體培養(yǎng)基和土豆培養(yǎng)基(PDA)平板(60mg/L青霉素和100 μ g/mL鏈霉素)上，30°C恒溫培養(yǎng)。菌落生長至大小適中后，經(jīng)過數(shù)次平板劃線分離后得到單一 BaP降解細(xì)菌和真菌。上述所有操作都在無菌條件下進(jìn)行。無菌條件下，從斜面上用接種環(huán)挑取一環(huán)菌，接種于液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，真菌和細(xì)菌分別置于30°C，150r/min的搖床上培養(yǎng)24h和72h。培養(yǎng)后的菌液3000r/min離心分離 20min,倒掉上清液，加入一定量的滅菌MSM清洗，重復(fù)上述步驟清洗三次，MSM定容得到所需濃度的菌懸液。無菌條件下50mL三角瓶中加入18mL MSM、2mL菌懸液和一定體積的BaP丙酮儲(chǔ)備液，使微生物密度分別達(dá)到104個(gè)(細(xì)胞)/mL或0. Olg (菌絲濕重)/mL，BaP的濃度達(dá)到 100mg/L，30°C、150r/min避光振蕩培養(yǎng)。分別在1、2、4、7、IOd取樣測定BaP的殘留量?？瞻讓?duì)照實(shí)驗(yàn)采用高溫滅菌(121°C，30min)菌懸液。各實(shí)驗(yàn)組中每一處理均為3個(gè)重復(fù)。焦化廠污染土壤中共篩出5株降解BaP的活性菌株。其中細(xì)菌兩株，分別命名為 B-I和B-2 ；真菌三株，分別命名為F-l，F(xiàn)-2和F-3，測定了所有菌株對(duì)BaP的降解能力(見表1)。菌株F-I (鑒定結(jié)果為L. theobromae) IOd降解率最高，這是首次發(fā)現(xiàn)L. theobromae 對(duì)BaP有好的降解特性。表1篩選菌株的BaP降解率比較
權(quán)利要求
1.篩選出一株苯并[a]芘(BaP)高效降解菌，其特征在于該菌為可可毛色二孢菌 (Lasiodiplodiatheobromae)，并具有降解BaP和多環(huán)芳烴混合物(PAHs)的能力。
2.權(quán)利1中的L.theobromae對(duì)BaP的降解特征在無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)中能夠利用BaP為唯一的碳源和能源對(duì)其進(jìn)行降解，降解率達(dá)到50%以上;MSM中加入土豆培養(yǎng)基(PDA)在降解初期顯著促進(jìn)BaP的降解速率，提高總體降解率； L. theobromae可耐受較廣的pH范圍，在pH = 5時(shí)對(duì)BaP的降解率最高； 添加代謝底物琥珀酸鈉和水楊酸能促進(jìn)L. theobromae對(duì)BaP的降解； L. theobromae能夠修復(fù)單獨(dú)BaP染毒土壤和實(shí)際中多環(huán)芳烴污染的土壤。
3.權(quán)利要求1或2所述L.theobromae降解單一高環(huán)多環(huán)芳烴BaP污染物或PAHs污染物，或者在PAHs污染土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明篩選出一株降解高濃度苯并[a]芘(BaP)的新菌株-可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)。L.theobromae以BaP作為唯一碳源和能源10d降解率為52.5％。土豆培養(yǎng)基(PDA)在降解初期顯著促進(jìn)BaP的降解。L.theobromae耐受較廣的pH范圍，pH＝5時(shí)降解率最高。水楊酸和琥珀酸鈉能夠促進(jìn)L.theobromae對(duì)BaP的降解。菲、芘和BaP混合存在時(shí)，單個(gè)多環(huán)芳烴的降解率均降低。染毒土壤中的BaP(50mg/L)35d降解率可達(dá)51.4％。污染土壤修復(fù)后，多環(huán)芳烴降解率從39.0％到～96.7％，能夠用于多環(huán)芳烴污染土壤的實(shí)際修復(fù)中。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102465100SQ20101054840
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者劉海濱, 孫紅文, 張志遠(yuǎn), 王翠蘋, 許偉 申請(qǐng)人:南開大學(xué)