專利名稱：高穩(wěn)定性的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白a及其生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及高穩(wěn)定性的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A及其生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
蛋白A (Protein Α)來(lái)源于金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)，為其表面的一種膜蛋白。蛋白A具有與抗體特異性結(jié)合的能力，蛋白A親和層析柱已成為生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的純化抗體的親和柱，可從腹水，血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動(dòng)物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白。蛋白A可以通過(guò)基因工程重組技術(shù)生產(chǎn)。但是，目前市場(chǎng)銷售的蛋白A具有不穩(wěn)定的缺陷，從而影響其使用。本領(lǐng)域還需要進(jìn)一步優(yōu)化蛋白A及其生產(chǎn)技術(shù)，以提高其穩(wěn)定性以及抗原結(jié)合能力，進(jìn)而提高其應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的高穩(wěn)定性的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A及其生產(chǎn)方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A，其是(a) SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸(如1-10 個(gè)，較佳地1-5個(gè)，更佳地1-3個(gè))且具有(a)限定的蛋白相同的功能的由(a)衍生的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的缺失或添加發(fā)生在蛋白的羧基端、氨基端或者二者兼有。在本發(fā)明的另一方面，提供一種多核苷酸，其選自下組(i)編碼所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白。在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體，或基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的方法，包括步驟(1)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；和(2)從培養(yǎng)物中分離所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A。在另一優(yōu)選例中，在溫度20士 10°C下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，在溫度20士7°C下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；更佳地在溫度20士5°C下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；更佳地在溫度15士3°C下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞過(guò)程中采用IPTG或乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，采用0. 05-2. OmM濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的用途，用于結(jié)合抗體；或用于制備抗體親和柱；或用于抗體的純化。在本發(fā)明的另一方面，提供一種純化抗體的親和柱，其包括親和介質(zhì)，以及附著于所述親和介質(zhì)的所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A。在另一優(yōu)選例中，所述的親和介質(zhì)選自(但不限于)瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素、大孔吸附樹(shù)脂等。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1、左圖為金黃色葡萄球菌基因組抽提結(jié)果；右圖為全長(zhǎng)SPA(FL)與截短體 SPA (32-327) PCR產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果。圖中SPA-32指截短體SPA (32-327)。圖2、菌落PCR鑒定結(jié)果。圖3、將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的大腸桿菌BL21 (DE3)，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。其中，Lanel誘導(dǎo)前；Lane2，3，4，5 :0. 5mM IPTG 誘導(dǎo)后。圖4左圖=SDS-PAGE檢測(cè)在不同的溫度條件下培養(yǎng)重組SPA(32-327)BL21 (DE3) 細(xì)胞，獲得的培養(yǎng)上清和包涵體形式蛋白的表達(dá)情況。圖4右圖為SDS-PAGE檢測(cè)在不同的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)重組BL21 (DE3)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況。其中 Lane 1 誘導(dǎo)前；Lane 2 :0. ImM IPTG ；Lane 3 :0. 5mM IPTG ；Lane 4 1. OmM IPTG ；Lane 5 :10mM IPTG。Sup 上清；Pel 沉淀。圖5、不同溫度下SPA(32-327)的生長(zhǎng)曲線圖。圖6、發(fā)酵進(jìn)程曲線。圖7、SDS-PAGE電泳鑒定DEAE-FF純化蛋白。各泳道分別為1 =SPA(32-327)上清；2:流出液；3，4，5:目的蛋白。圖 8、Ni-NTA 純化 SPA (32-327)。圖9、SPA(32-327)凍干前后的穩(wěn)定性鑒定。其中各泳道分別為1 =SPA(32-327) 凍干前；2 :SPA (32-327)-His 凍干前；3 =SPA (32-327)凍干后；4 :SPA (32-327)-His 凍干后。圖10、不同蛋白濃度的 SPA(32-327)或 SPA(32-327)-His 的 Dottern 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次揭示一種高穩(wěn)定性的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A，與野生型蛋白A相比，該重組蛋白A穩(wěn)定性大大提高，具有更強(qiáng)的抗體結(jié)合能力。 在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，除非另外說(shuō)明，所述的“具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A”、 "SPA(32-327) ”、“截短體蛋白SPA(32-327) ”、“截短體蛋白”等可互換使用，均是指相對(duì)于野生型蛋白A，其氨基端缺少31個(gè)氨基酸的蛋白；更佳地，相對(duì)于野生型蛋白A，其羧基端還缺少100-200個(gè)氨基酸(如173個(gè)氨基酸)。若需要表示野生型的蛋白，除非另外說(shuō)明，其將被標(biāo)示為“野生型蛋白A”、 "SPA(FL)全長(zhǎng)蛋白”。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和蛋白是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的?！爸亟M的”是指借助基因工程手段來(lái)獲得(或大量制備)的蛋白、基因工程載體或細(xì)胞等。本發(fā)明的蛋白可以是重組蛋白、天然蛋白、合成蛋白，優(yōu)選重組蛋白。本發(fā)明的蛋白可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主， 本發(fā)明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的蛋白還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括所述具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白。本發(fā)明的蛋白片段、衍生物或類似物可以是(i) 有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的蛋白，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的蛋白，或(iii)成熟蛋白與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。 然而，所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A及其片段、衍生物和類似物的氨基酸序列中，相對(duì)于野生型蛋白A，其氨基端缺少31個(gè)氨基酸的蛋白更佳地，相對(duì)于野生型蛋白A，其羧基端還缺少100-200個(gè)氨基酸(如173個(gè)氨基酸)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A”指具有本發(fā)明的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A活性的SEQ ID NO :2序列的蛋白。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與所述具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A相同功能的、SEQ ID NO :2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-20個(gè)，更佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè)、1-3個(gè)、或1_2 個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的活性片段和活性衍生物。最好的，在這些SEQ ID NO :2的變異形式中，相對(duì)于野生型蛋白A，其氨基端缺少31個(gè)氨基酸的蛋白；更佳地，相對(duì)于野生型蛋白A，其羧基端還缺少100-200個(gè)氨基酸(如173個(gè)氨基酸)。蛋白的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用所述抗具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的抗血清獲得的蛋白或蛋白。本發(fā)明還提供了其他蛋白，如包含具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A或其片段的融合蛋白。發(fā)明還提供具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A或蛋白的類似物。這些類似物與具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的蛋白并不限于上述例舉的代表性的蛋白。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的蛋白的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。在本發(fā)明中，“具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A保守性變異蛋白”指與SEQ IDNO 2 的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)(如 1個(gè)、2個(gè)或3個(gè))氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成蛋白。這些保守性變異蛋白最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表 權(quán)利要求
1.一種具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A，其是(a)SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有(a)限定的蛋白相同的功能的由(a)衍生的蛋白。
2.一種多核苷酸，其選自下組(i)編碼權(quán)利要求1所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的多核苷酸；或( )與(i)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼SEQID N0:2所示氨基酸序列的蛋白。
4.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2或3任一所述的多核苷酸。
5.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的載體，或基因組中整合有權(quán)利要求2或3任一所述的多核苷酸。
6.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的方法，其特征在于，包括步驟(1)培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；和(2)從培養(yǎng)物中分離權(quán)利要求1所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在溫度20士10°C下培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞過(guò)程中采用IPTG或乳糖誘導(dǎo)表達(dá)。
9.權(quán)利要求1所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的用途，用于結(jié)合抗體；或用于制備抗體親和柱；或用于抗體的純化。
10.一種純化抗體的親和柱，其包括親和介質(zhì)，以及附著于所述親和介質(zhì)的權(quán)利要求1 所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A。
全文摘要
本發(fā)明涉及高穩(wěn)定性的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A及其生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了包含所述的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A的親和層析柱。本發(fā)明的具抗體結(jié)合能力的重組蛋白A與野生型蛋白A相比，穩(wěn)定性大大提高，具有更強(qiáng)的抗體結(jié)合能力。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102558316SQ201010614100
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者馮矗, 李素霞, 趙致 申請(qǐng)人:上海雅心生物技術(shù)有限公司