專利名稱：全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由脫氧核苷一磷酸dNMP合成脫氧核苷三磷酸dNTP的方法。

背景技術(shù)：
脫氧核苷三磷酸是人工合成DNA的必備前體原料，人工合成DNA片段廣泛應(yīng)用于基因工程、分子生物學(xué)、生命科學(xué)、基因藥物等方面。三磷酸脫氧核苷是各種DNA聚合酶促反應(yīng)的底物，是DNA序列分析、基因分析、定點(diǎn)突變、PCR(Polymerase ChainReaction)、RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄和DNA標(biāo)記反應(yīng)不可缺少的低分子量生物有機(jī)分子。而DNA序列分析、定點(diǎn)突變、PCR及DNA芯片技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)、生物化學(xué)和現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究不可缺少的技術(shù)。尤其是PCR技術(shù)具有操作簡單應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)，它在基因分子克隆、蛋白質(zhì)工程、生物醫(yī)藥研發(fā)、遺傳和傳染性疾病診斷、法醫(yī)鑒定、親子檢定等領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。
隨著生物技術(shù)研究和工業(yè)化中DNA合成的PCR應(yīng)用，dNTP的需求在穩(wěn)定地增長。目前世界上只有少數(shù)幾家企業(yè)能夠生產(chǎn)三磷酸脫氧核苷，所采用的方法主要是利用脫氧核糖核酸水解產(chǎn)物的酶促或化學(xué)磷酸化，終產(chǎn)物的獲得要求多步反應(yīng)，生產(chǎn)工藝繁瑣，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低。
商業(yè)上主要通過化學(xué)方法生產(chǎn)dNTP，反應(yīng)是以dNMP相應(yīng)的三丁基銨鹽和正磷酸為底物，以二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)為催化劑，在吡啶或者二甲基酰胺(DMF)等有機(jī)溶劑中進(jìn)行?；瘜W(xué)法生產(chǎn)得到不同dNTP的產(chǎn)率為40～80％。然而，純化反應(yīng)混合物中的各個dNTP組分，其過程十分復(fù)雜并且成本很大，它需要分離非活性的dNMP、dNDP、DCC和正磷酸以及副產(chǎn)物如脫氧核糖核苷四磷酸或五磷酸等。另外，因?yàn)閺U氣處理的原則很嚴(yán)格，吡啶或者DMF溶劑一定要被還原，分離，然后回收。因此，化學(xué)法有很大的環(huán)境污染，并且通過反應(yīng)和純化后它的得率很低，成本也相對較高。
從經(jīng)濟(jì)和環(huán)境因素考慮，近年世界上已出現(xiàn)酶法合成脫氧核苷三磷酸，此法比化學(xué)方法更具優(yōu)勢。dNTP的合成需要兩個酶磷酸化的反應(yīng)，從dNMP生成dNDP和第二步生成dNTP。Ladner和Whitesides由從鯡魚精子DNA中分離的脫氧核苷一磷酸(dNMP)混合物合成dNTP[Ladner W，Whitesides G.Enzymatic synthesis of deoxyATP using DNAas starting material[J].J Org Chem，1985，501076-1079]。近年來，Jie Bao，Dewey D.Y.Ryu等人成功將編碼四種脫氧核苷單磷酸激酶的基因從Saccharomyces cerevisiae ATCC2610菌株的基因組中分離出來，分別為編碼脫氧腺苷酸激酶(AK)的ADK1，編碼脫氧鳥苷酸激酶(GK)的GUK1，編碼脫氧胞苷酸激酶(CK)的URA6，以及編碼脫氧胸苷酸激酶(TK)的CDC8基因。他們將這些基因克隆到E.coli BL21(DE3)菌株中，并使AK，GK，CK，TK過量表達(dá)。用純化的脫氧核苷酸激酶實(shí)現(xiàn)從脫氧核苷單磷酸到脫氧核苷二磷酸的轉(zhuǎn)化。第二步加入從家兔肌肉中提取的丙酮酸激酶(PK)實(shí)現(xiàn)從dNDP到dNTP的轉(zhuǎn)化[Bao J，Ryu DDY.Total Biosynthesis of Deoxynucleoside Triphosphates UsingDeoxynucleoside Monophosphate Kinases for PCR Application[J].Biotechnol Bioeng.2007，98(1)1-11]。盡管如此，dNTP的產(chǎn)率仍較低，只有25％左右[Bao J，Bruque GA，RyuDDY.Biosynthesis of deoxynucleoside triphosphates，dCTP and dTTPReaction mechanismand kinetics[J].Enzyme Microb Technol.2005，36350-356；Bao J，Ryu DDY.Biosynthesisreaction mechanism and kinetics of deoxynucleoside triphosphates，dATP and dGTP[J].Biotechnol Bioeng.2005，89485-491]。另外，世界上已有數(shù)家研究機(jī)構(gòu)正在研發(fā)核苷酸還原酶，但這些正處在研發(fā)階段的核苷酸還原酶大都有反應(yīng)條件復(fù)雜和酶穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，不適合工業(yè)化，應(yīng)用范圍有限。
目前國內(nèi)外dNTP得率普遍不高、成本高并且生產(chǎn)工藝繁瑣的一個重要原因在于能量再生和偶聯(lián)效率低下。在dNTP的合成過程中需要消耗大量的能量(ATP)，因此需要兩個酶系即ATP的再生體系和dNTP的合成酶系。ATP的再生體系以糖為底物，通過糖酵解途徑(EMP)來實(shí)現(xiàn)，該途徑是能量再生的最經(jīng)濟(jì)的途徑之一，而供體ATP在dNTP合成過程中作為磷酸供體和能量而存在。因此dNTP合成的關(guān)鍵就在于如何建立一個高效的能量再生和自偶聯(lián)體系。采用酵母全細(xì)胞催化技術(shù)，可以克服合成過程中底物利用效率低、產(chǎn)物得率低和生產(chǎn)成本高等問題。同時，與酶法相比，由于使用的是全細(xì)胞，酶的穩(wěn)定性更好，耐有機(jī)溶劑的適應(yīng)性更強(qiáng)，更易實(shí)現(xiàn)能量和輔酶的原位再生。在現(xiàn)有技術(shù)中，糖通過EMP途徑生成ATP的效率很低，只能維持酵母一般的生命代謝，要加大EMP途徑的通量，超量表達(dá)底物磷酸化水平，只有通過基因工程技術(shù)或采用化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)改變代謝流的方法來實(shí)現(xiàn)，采用后者更方便，易于實(shí)現(xiàn)。在化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)下，可使EMP途徑的代謝流量發(fā)生明顯改變，ATP再生的速率也得到了很大的提高，當(dāng)其速率和dNTP合成體系的速率相匹配時，即實(shí)現(xiàn)dNTP的高效合成。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單而高效的脫氧核苷三磷酸dNTP的制備方法，以克服dNTP傳統(tǒng)制備復(fù)雜、成本高得率低、污染大等缺點(diǎn)。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下 全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，以脫氧核苷一磷酸和磷酸根離子為底物，以糖為能量供體，利用有透性的酵母細(xì)胞，在化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)的存在下建立高效的能量自耦聯(lián)和再生系統(tǒng)來制備脫氧核苷三磷酸。
其中，所述的脫氧核苷三磷酸dNTP是指脫氧腺苷三磷酸dATP、脫氧鳥苷三磷酸dGTP、脫氧胞苷三磷酸dCTP和脫氧胸苷三磷酸dTTP中的任意一種，其結(jié)構(gòu)式如下
其中，所述的脫氧核苷一磷酸dNMP是指脫氧腺苷一磷酸dAMP、脫氧鳥苷一磷酸dGMP、脫氧胞苷一磷酸dCMP、和脫氧胸苷一磷酸dTMP中的任意一種，其結(jié)構(gòu)式如下
其中，所述的脫氧核苷一磷酸的起始反應(yīng)濃度為1～100mM；所述磷酸根離子起始反應(yīng)濃度為0.01～1.0M；糖的起始反應(yīng)濃度為0.1～1.0M；所述磷酸離子可舉出正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉等無機(jī)磷酸鹽；所述的糖為葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖。
其中，所述的化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)是指金屬離子和有機(jī)化合物的組合；所述的金屬離子為Mg2+、K+和Na+中的任意一種或幾種；所述的有機(jī)化合物為乙醛和多元醇中的任意一種或兩種的組合；Mg2+可以是硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等無機(jī)鎂鹽，起始反應(yīng)濃度為1～100mM；K+可以是磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、氯化鉀等無機(jī)鉀鹽，起始反應(yīng)濃度為1～100mM；乙醛起始反應(yīng)濃度為10～80mL/L，多元醇可以是乙二醇、丙三醇、山梨醇或甘露醇，優(yōu)選丙三醇，多元醇起始反應(yīng)濃度為5～100mL/L。
其中，所述的酵母細(xì)胞為酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬中的任意一種，優(yōu)選的例子可舉屬于酵母屬的微生物釀酒酵母，面包酵母等；屬于假絲酵母屬的微生物近平滑假絲酵母；屬于畢赤酵母屬的奧默列氏畢赤酵母；屬于球擬酵母屬的微生物白色球擬酵母；屬于德巴利酵母屬的類球形德巴利酵母；屬于接合酵母屬的魯氏接合酵母；屬于克魯維酵母屬的馬克斯克魯維酵母；屬于漢遜酵母屬的杰丁漢遜酵母；屬于酒香酵母屬的異酒香酵母等。
酵母細(xì)胞的使用量為按濕菌體100～800g/L，優(yōu)選200～600g/L，即對于總體積為1L的反應(yīng)液，需加入100～800g濕菌體，優(yōu)選加入200～600g濕菌體。
酵母的利用形式為酵母細(xì)胞的干燥物、經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)分離離心得到的細(xì)胞、固定化細(xì)胞、細(xì)胞的凍干物、市售酵母粉、風(fēng)干酵母或廢酵母泥。
其中，有透性的酵母細(xì)胞是指通過化學(xué)、物理或生物方法處理過的細(xì)胞膜的通透性改變過的酵母細(xì)胞，所述化學(xué)、物理或生物方法包括表面活性劑法、有機(jī)溶劑法、凍融法、超聲波處理法、風(fēng)干法、冷凍干燥法或溶菌酶法。
表面活性劑法中使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑聚環(huán)氧乙烷胺或曲拉通X-100，陽離子型表面活性劑十六烷基三甲胺·溴化物，或陰離子表面活性劑月桂?！ぜ“彼猁}，表面活性劑使用量為0.1～50g/L，優(yōu)選1～20g/L，即表面活性劑法處理生產(chǎn)菌株時，將表面活性劑直接加入反應(yīng)液，對于總體積為1L的反應(yīng)液，加入0.1～50g，優(yōu)選加入1～20g。
有機(jī)溶劑法中使用的有機(jī)溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，有機(jī)溶劑濃度為0.1～50mL/L，優(yōu)選以1～20mL/L，即有機(jī)溶劑法處理生產(chǎn)菌株時，將有機(jī)溶劑直接加入反應(yīng)液，對于總體積為1L的反應(yīng)液，加入0.1～50mL，優(yōu)選加入1～20mL。
其它處理細(xì)胞透性的方法，如凍融法、超聲波處理法、風(fēng)干法等，采用先將菌株細(xì)胞處理后，再將處理好的菌株加入反應(yīng)液的方式。
上述制備脫氧核苷三磷酸的反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行，在pH 5.0～9.0、20～50℃條件下反應(yīng)2～24小時，優(yōu)選在pH 7.0～8.0、30℃條件下反應(yīng)2～24小時。
有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 1、本發(fā)明利用酵母細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，酵母細(xì)胞含酶種類豐富，具有催化多種生化反應(yīng)的潛力。特別酵母細(xì)胞具有輔酶(NADH，NADPH，ATP)再生功能，在催化氧化還原反應(yīng)、磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)方面可發(fā)揮重要作用。利用酵母細(xì)胞的酶系進(jìn)行酶催化反應(yīng)生產(chǎn)所需產(chǎn)品范圍廣泛、具有很好的市場前景。
2、本發(fā)明是建立在全細(xì)胞催化的基礎(chǔ)上的，其特點(diǎn)在于克服了其他方法底物轉(zhuǎn)化率不高、難于實(shí)現(xiàn)能量和輔酶再生等缺陷。與酶法相比，由于細(xì)胞具有維持其生命活動完整的多酶系統(tǒng)，各種酶又保持著原有生活細(xì)胞所處的狀態(tài)和特定位置，反應(yīng)所需要的能量和輔酶因子不需要外界供給，直接由細(xì)胞產(chǎn)生，因此能夠迅速有效地完成多步酶催化反應(yīng)，有轉(zhuǎn)化率高、成本低，以及污染小的優(yōu)點(diǎn)。同時與現(xiàn)有的化學(xué)方法相比，本發(fā)明是一種能明顯降低環(huán)境污染的生物轉(zhuǎn)化方法。
3、本發(fā)明建立了高效的能量自耦聯(lián)和再生系統(tǒng)，反應(yīng)利用了微生物體內(nèi)的酶系糖酵解(EMP)途徑酶系(己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸果糖激酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶)和dNTP合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶)進(jìn)行催化反應(yīng)，EMP途徑產(chǎn)生的ATP可以運(yùn)用于dNTP合成，另外通過化學(xué)物質(zhì)的加入，可以加快ATP的再生速率，形成高效的能量自耦聯(lián)和再生系統(tǒng)，使得dNTP過量積累。
4、本發(fā)明利用代謝工程原理，加入鎂離子、鉀離子，以及乙醛和多元醇的組合物，主要起到以下幾方面作用 1)調(diào)節(jié)代謝通量，使系統(tǒng)內(nèi)的代謝途徑流量發(fā)生明顯改變，流向甘油的代謝流量大幅減少。代謝通量經(jīng)調(diào)節(jié)后，EMP的支路途徑被強(qiáng)烈抑制，使得EMP主途徑得以加強(qiáng)，從而提高了對能量的利用率，而dNTP的積累正需要ATP供給能量與磷酸根，dNTP進(jìn)而得以大量積累。
2)加快NADH再生，維持胞內(nèi)NADH/NAD+比率，恢復(fù)細(xì)胞的氧化還原平衡。并且將NADH氧化途徑轉(zhuǎn)向乙醇發(fā)酵途徑，從而加大糖酵解途徑的通量，促進(jìn)dAMP到dATP的轉(zhuǎn)化。
3)加入鎂離子、鉀離子等金屬離子，使得FDP的累積速率明顯加快，刺激丙酮酸激酶活性；另一方面是由于磷酸烯醇式丙酮酸的分解，使得原來由甘油磷酸脫氫酶催化磷酸二羥丙酮引起的NAD的再生，仍由乙醇脫氫酶擔(dān)當(dāng)。而乙醛和多元醇可以有效地保證并加快NADH再生，維持酶活及其穩(wěn)定性。由此，金屬離子和有機(jī)物可以互相促進(jìn)，兩者產(chǎn)生高效的協(xié)同作用，使系統(tǒng)內(nèi)的代謝途徑流量發(fā)生明顯改變，流向甘油的代謝流量大幅減少，實(shí)現(xiàn)dNTP的高效合成。
4)保證酵母酶系的酶活及其穩(wěn)定性，有利于提高dNTP的合成效率。

具體實(shí)施例方式 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
實(shí)施例1 酵母培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖40，尿素2.0，磷酸二氫鉀1.5，七水合硫酸鎂0.5，七水合硫酸鋅4.0×10-3，七水合硫酸亞鐵3.0×10-3，四水合氯化錳0.3×10-3，無水氯化鈣1.0×10-3，生物素0.05×10-3。釀酒酵母接種量10％，于30℃下120rpm搖床培養(yǎng)24小時，離心4000rpm，20分鐘。取酵母泥，-7℃保藏備用。
以下實(shí)施例使用的酵母都是按上述培養(yǎng)方式培養(yǎng)。
實(shí)施例2利用dAMP制備dATP。
在容量為500mL的燒杯中調(diào)制由dAMP 1.49mmol，葡萄糖0.072mol，面包酵母泥100g，硫酸鎂14.96mmol，磷酸二氫鈉0.036mol，丙三醇3mL，十六烷基三甲胺.溴化銨0.3g和水組成的反應(yīng)液300mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，于30℃條件下低速攪拌反應(yīng)6小時，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對dATP進(jìn)行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含dATP 2.59g/L，dATP的得率達(dá)到93.6％(mol計(jì))。
實(shí)施例3利用dAMP制備dATP。
在容量為500mL的燒杯中調(diào)制由dAMP 1.66mmol，葡萄糖0.08mol，風(fēng)干后的面包酵母泥110g，氯化鉀8.05mmol，磷酸二氫鈉0.036mol，乙醛3mL和水組成的反應(yīng)液300mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，于30℃條件下低速攪拌反應(yīng)6小時，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對dATP進(jìn)行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含dATP 2.85g/L，dATP的得率達(dá)到92.4％(mol計(jì))。
實(shí)施例4利用dCMP制備dCTP。
在容量為500mL的燒杯中調(diào)制由dCMP 1.50mmol，葡萄糖0.068mol，釀酒酵母90g，風(fēng)干處理，氯化鎂6.89mmol，氯化鉀5.37mmol，磷酸二氫鈉0.03mol，乙醛3mL，丙三醇3mL，曲拉通X-100 6g和水組成的反應(yīng)液300mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，于37℃條件下低速攪拌反應(yīng)18小時，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對dCTP進(jìn)行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含dCTP 0.71g/L，dCTP的得率達(dá)到25.6％(mol計(jì))。
實(shí)施例5利用dCMP制備dCTP。
在容量為500ml的燒杯中調(diào)制由dCMP 1.61mmol，葡萄糖0.076mol，魯氏接合酵母100g，反復(fù)凍融3次，氯化鉀8.05mmol，磷酸二氫鈉0.03mol，丙三醇3mL和水組成的反應(yīng)液300mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，于37℃條件下低速攪拌反應(yīng)18小時，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對dCTP進(jìn)行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含dCTP 0.80g/L，dCTP的得率達(dá)到26.9％(mol計(jì))。
實(shí)施例6利用dGMP制備dGTP。
在容量為500ml的燒杯中調(diào)制由dGMP 1.30mmol，葡萄糖0.065mol，魯氏接合酵母90g，硫酸鎂16.62mmol，磷酸二氫鈉0.03mol，乙醛3mL，十六烷基三甲胺.溴化銨0.3g和水組成的反應(yīng)液300mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，于37℃條件下低速攪拌反應(yīng)12小時，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對dGTP進(jìn)行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含dGTP 0.99g/L，dGTP的得率達(dá)到45.0％(mol計(jì))。
實(shí)施例7利用dGMP制備dGTP。
在容量為500ml的燒杯中調(diào)制由dGMP 1.44mmol，葡萄糖0.068mol，釀酒酵母90g，風(fēng)干處理，硫酸鎂14.96mmol，磷酸二氫鈉0.03mol，乙二醇3mL，曲拉通X-1006mL和水組成的反應(yīng)液300mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至6.5，于37℃條件下低速攪拌反應(yīng)12小時，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對dGTP進(jìn)行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含dGTP1.13g/L，dGTP的得率達(dá)到46.4％(mol計(jì))。
實(shí)施例8利用dTMP制備dTTP。
在容量為500ml的燒杯中調(diào)制由dTMP 1.50mmol，葡萄糖0.09mol，異酒香酵母150g，硫酸鎂14.96mmol，磷酸二氫鈉0.036mol，乙醛3mL，甲苯3mL和水組成的反應(yīng)液300mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，于30℃條件下低速攪拌反應(yīng)10小時，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對dTTP進(jìn)行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含dTTP 0.84g/L，dTTP的得率達(dá)到34.8％(mol計(jì))。
實(shí)施例9利用dTMP制備dTTP。
在容量為500ml的燒杯中調(diào)制由dTMP 1.64mmol，葡萄糖0.10mol，釀酒酵母100g，風(fēng)干處理，氯化鎂6.89mmol，氯化鉀8.05mmol，磷酸二氫鈉0.036mol，乙醛3mL，丙三醇3mL，丙酮6mL和水組成的反應(yīng)液300mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，于30℃條件下低速攪拌反應(yīng)10小時，反應(yīng)結(jié)束后，用高氯酸沉淀，用HPLC對dTTP進(jìn)行定量分析，轉(zhuǎn)化液中含dTTP 0.95g/L，dTTP的得率達(dá)到36.0％(mol計(jì))。
權(quán)利要求
1.一種全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于以脫氧核苷一磷酸和磷酸根離子為底物，以糖為能量供體，利用有透性的酵母細(xì)胞，在化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)的存在下建立高效的能量自耦聯(lián)和再生系統(tǒng)來制備脫氧核苷三磷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的脫氧核苷三磷酸是指脫氧腺苷三磷酸dATP、脫氧鳥苷三磷酸dGTP、脫氧胞苷三磷酸dCTP和脫氧胸苷三磷酸dTTP中的任意一種，其結(jié)構(gòu)式如下
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的脫氧核苷一磷酸是指脫氧腺苷一磷酸dAMP、脫氧鳥苷一磷酸dGMP、脫氧胞苷一磷酸dCMP、和脫氧胸苷一磷酸dTMP中的任意一種，其結(jié)構(gòu)式如下
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的脫氧核苷一磷酸的起始反應(yīng)濃度為1～100mM；所述磷酸根離子起始反應(yīng)濃度為0.01～1.0M；糖的起始反應(yīng)濃度為0.1～1.0M；所述的糖為葡萄糖、果糖、蔗糖或麥芽糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)是指金屬離子和有機(jī)化合物的組合；所述的金屬離子為Mg2+和K+中的任意一種或兩種的組合；所述的有機(jī)化合物為乙醛和多元醇中的任意一種或兩種的組合；Mg2+起始反應(yīng)濃度為1～100mM，K+起始反應(yīng)濃度為1～100mM，Na+起始反應(yīng)濃度為1～100mM，乙醛起始反應(yīng)濃度為10～80mL/L，多元醇起始反應(yīng)濃度為5～100mL/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的多元醇為乙二醇、丙三醇、山梨醇或甘露醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的酵母細(xì)胞為酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、球擬酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和酒香酵母屬中的任意一種，酵母的使用量為按濕菌體計(jì)100～800g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的酵母細(xì)胞為釀酒酵母、近平滑假絲酵母、面包酵母、奧默列氏畢赤酵母、白色球擬酵母、類球形德巴利酵母、魯氏接合酵母、馬克斯克魯維酵母、杰丁漢遜酵母或異酒香酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、7或8所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的有透性的酵母細(xì)胞是指通過化學(xué)、物理或生物方法處理過的細(xì)胞膜的通透性改變過的酵母細(xì)胞，所述化學(xué)、物理或生物方法包括表面活性劑法、有機(jī)溶劑法、凍融法、超聲波處理法、風(fēng)干法、冷凍干燥法或溶菌酶法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的表面活性劑法中使用的表面活性劑為非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑或陰離子表面活性劑，使用濃度為0.1～50g/L。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述的有機(jī)溶劑法中使用的有機(jī)溶劑為二甲苯、甲苯、脂肪酶、丙酮或乙酸乙酯，使用濃度為0.1～50ml/L。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，其特征在于所述制備脫氧核苷三磷酸的反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行，在pH 5.0～9.0、20～50℃條件下反應(yīng)2～24小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種全細(xì)胞生物合成脫氧核苷三磷酸的新技術(shù)，是以脫氧核苷一磷酸dNMP和磷酸根離子為底物，以糖為能量供體，利用有透性的酵母細(xì)胞，在化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)的存在下反應(yīng)來制備脫氧核苷三磷酸。本發(fā)明通過運(yùn)用全細(xì)胞催化和代謝工程的原理，采用化學(xué)效應(yīng)物質(zhì)調(diào)控代謝流量，建立了高效的能量自耦聯(lián)和再生系統(tǒng)，最終實(shí)現(xiàn)脫氧核苷三磷酸的高效制備。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)脫氧核苷三磷酸生產(chǎn)工藝的不足，具有工藝簡單、轉(zhuǎn)化率高、成本低，以及污染小等特點(diǎn)。
文檔編號C12R1/78GK101768617SQ20101902602
公開日2010年7月7日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者應(yīng)漢杰, 姚月蘭, 熊健, 陳勇, 柏建新, 苑巍, 張磊 申請人:南京工業(yè)大學(xué), 南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責(zé)任公司