專利名稱：油菜莖基潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光pcr分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種油菜莖基潰瘍病菌L印tosphaeria maculans (Desm. ) Ces. & de Not.實(shí)時(shí)熒光PCR(或稱Real-time PCR)分子檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
油菜蓮基饋蕩病 L印tosphaeria maculans (Desm. ) Ces. & de Not.是油菜 (Brassicanapus Linn)生產(chǎn)過程中的一種毀滅性病害。該病原菌的主要自然寄主為油菜， 甘藍(lán)，大白菜等十字花科的作物。該病害在田間可造成幼苗的死亡，成株倒伏、早衰，嚴(yán)重危 害著大田作物油菜籽的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病可以在多種氣候條件、不同栽培措施下發(fā)生和流 行，一般年份產(chǎn)量損失大約在10-20%，重災(zāi)年份的損失可達(dá)30-50%。在加拿大，即使采取 了嚴(yán)格的控制措施，該病害每年仍造成了該國(guó)油菜籽3億多美元的損失；在英國(guó)每年的損 失達(dá)5600萬歐元。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年由于該病原菌造成的損失在澳大利亞、歐洲及北美等世界 主要油菜產(chǎn)區(qū)，所造成的經(jīng)濟(jì)損失每年要高達(dá)9億美元左右。該病原菌目前在世界范圍油菜主產(chǎn)區(qū)如加拿大、澳大利亞、美國(guó)等油菜籽主要生 產(chǎn)國(guó)廣泛分布。目前，我國(guó)只有油菜黑脛病(Lbiglobosa)的發(fā)生報(bào)道，尚無油菜莖基潰瘍 病的發(fā)生和分布。油菜莖基潰瘍病菌可隨感病的植株、病殘?bào)w及種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。種子的帶菌 率通常為0. 1_5%，由此導(dǎo)致田間植株發(fā)病率為0. 1-19%。該病原菌可以假囊殼和菌絲的 形式在病殘?bào)w中越冬和越夏，也可以休眠菌絲的形式藏在種皮內(nèi)。在田間，該病原菌主要通 過子囊孢子和分生孢子進(jìn)行擴(kuò)散。油菜是我國(guó)主要油料作物，種植面積約800萬公頃，占全國(guó)油料作物總面積的 40%以上，油菜籽的產(chǎn)量占全國(guó)油料總產(chǎn)量的30%以上，居世界首位。油菜在中國(guó)廣泛種 植，且氣候條件與該病原菌發(fā)生地的氣候條件相似，因此，作為油菜莖基潰瘍病菌的主要自 然寄主，其病原菌傳入、定殖和擴(kuò)散的可能性都很大，我國(guó)已將該病菌列入“中華人民共和 國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄”。目前，檢疫口岸多利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和常規(guī)PCR技 術(shù)來檢測(cè)該病原菌，檢測(cè)不夠靈敏、快速。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適宜于檢疫口岸快速檢測(cè)使用的油菜莖基潰瘍病菌 Real-time PCR分子檢測(cè)的試劑盒，以便于快速、靈敏、準(zhǔn)確地對(duì)口岸進(jìn)口的油菜籽進(jìn)行油 菜莖基潰瘍病菌的檢測(cè)。本發(fā)明油菜莖基潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR分子檢測(cè)試劑盒，包括如下試劑基因表達(dá)通用混合試劑；ddH20 ；探針與引物混合物，包含5 μ mol · Γ1的LMpro探針、18 μ mol · L—1的LMf上游引物和18 μ mol · Γ1的LMr下游引物；陽性對(duì)照濃度為lOOng/μ L的油菜莖基潰瘍病菌DNA溶液；所說的LMf 上游引物序列為 5，-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3’，所說的LMr 下游引物序列為 5，-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3，，所說的LMpro 探針序列為 5，F(xiàn)AM-ATTGGATCCCCTAAAACC-NFQ-MGB3，，其中，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，NFQ(Non-Fluorescent Quencher)為非熒光淬滅基團(tuán)， MGB (Minor Groove Binder)為修飾基團(tuán)。本試劑盒中的基因表達(dá)通用混合試劑采用TaqMan Gene Expression Master Mix (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品)，包含超純AmpliTaq Gold DNA聚合酶，尿嘧啶-DNA糖 基化酶(UDG)，帶有脫氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)的脫氧核糖核苷酸(dNTP)，R0X 內(nèi)參染料以 及優(yōu)化的PCR緩沖液。利用本發(fā)明油菜莖基潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR分子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)油菜莖基潰瘍 病菌的方法，包括如下步驟(1)提取待測(cè)樣品的DNA ；(2)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)以所得樣品DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系含有 10 μ L的基因表達(dá)通用混合試劑，1 μ L探針與引物的混合物，2 μ L樣品DNA，7 μ L的ddH20， 反應(yīng)總體積為20 μ L ；實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為95°C反應(yīng)IOmin ；95°C反應(yīng)15sec，60°C 反應(yīng)60sec，共40個(gè)循環(huán)；(3)結(jié)果分析實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用實(shí)時(shí)熒光PCR儀分析軟件，對(duì)擴(kuò)增的圖譜進(jìn)行分 析，當(dāng)初始循環(huán)數(shù)(Ct) <35時(shí)，判定實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)為陽性，表示所檢測(cè)的樣品中含有
油菜莖基潰瘍病菌。本發(fā)明試劑盒用于油菜莖基潰瘍病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，可針對(duì)該病原菌以種 子或病殘?bào)w傳播的特點(diǎn)，直接對(duì)油菜籽或植株病殘?bào)w進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法 和常規(guī)PCR方法相比，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，尤其可準(zhǔn)確檢出樣品中含量 較低的病原菌，特別適合對(duì)進(jìn)出境對(duì)油菜籽等十字花科作物的種子、植株及病殘?bào)w中油菜 莖基潰瘍病菌的快速檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1是油菜莖基潰瘍病菌RealtimePCR擴(kuò)增曲線。圖2是油菜莖基潰瘍病菌RealtimePCR特異性反應(yīng)擴(kuò)增曲線。圖3是油菜莖基潰瘍病菌RealtimePCR靈敏度檢測(cè)擴(kuò)增曲線。圖4是油菜莖基潰瘍病菌RealtimePCR靈敏度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1油菜莖基潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR分子檢測(cè)試劑盒組成為2xTaqMan Gene Expression Master Mix (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品)，ddH20，
20xTaqMan MGB探針和引物混合物，包含18 μ mol · Γ1的LMf上游引物、 18 μ mol · L"1 的 LMr 下游弓丨物、5 μ mol · L"1 的 Lmpro 探針；陽性對(duì)照為IOOng/ μ L的油菜莖基潰瘍病菌DNA溶液(菌株200782，美國(guó)菌種保 藏中心ATCC)；上述油菜莖基潰瘍病菌TaqMan MGB探針與引物的設(shè)計(jì)和合成通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)油菜莖基潰瘍病菌核糖體RNA(r RNA)基因(基因登錄號(hào)DQ133891、AJ550889、AJ550885)和其近似種油菜黑脛病菌 B 型種(L. biglobosa)r RNA 基因(NCBI 基因登錄號(hào)FJ172238、AM410082、DQ133893、 AJ550871)進(jìn)行比對(duì)后，根據(jù)油菜莖基潰瘍病菌r RNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITSdnternal transcriptionspacer 1) ITSl基因的保守序列，設(shè)計(jì)如下一對(duì)寡核苷酸引物和TaqMan MGB探針上游引物L(fēng)Mf 序列為 5，-GTTTCCTTGGTGGGCTTGC-3，；下游引物L(fēng)Mr 序列為 5，-TGTTACTGACGCTGACTGCAATT-3，；探針LMpro 序列為 5，F(xiàn)AM-ATTGGATCCCCTAAAACC-NFQ-MGB3，，其中，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，NFQ(Non-Fluorescent Quencher)為非熒光淬滅基團(tuán)， MGB (Minor Groove Binder)為修飾基團(tuán)。其預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為72bp ；以上TaqMan MGB探針與PCR引物由美國(guó)應(yīng)用生 物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)合成。實(shí)施例2油菜莖基潰瘍病菌的檢測(cè)1、用于檢測(cè)的油菜莖基潰瘍病菌菌株樣品(共七個(gè)樣品)，分別為200782 (美國(guó)菌種保藏中心ATCC)、J_2、J_4、J_9、J-Il (從加拿大油菜籽中分離到 的油菜莖基潰瘍病菌)、A-7 (從澳大利亞油菜籽中分離到的油菜莖基潰瘍病菌),UK-20 (英 國(guó)油菜莖基潰瘍病菌，安徽省農(nóng)科院作物研究所惠贈(zèng))。2、油菜莖基潰瘍病菌DNA的制備取各樣品培養(yǎng)的油菜莖基潰瘍病菌菌絲或菌絲塊少量，分別加入液氮充分研磨成 粉狀物后，利用真菌DNA提取試劑盒(DNeasy plant mini kit, QIAGEN公司產(chǎn)品)制備 各菌株的DNA。3.實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)τ ； PCR β. IS # ^ ^ 20 μ L, ^ 2xTaqMan Gene Expression Master Mix 10yL，20xTaqMan MGB探針及引物Mix 1 μ L，DNA模板2 μ L和ddH20 7 μ L，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95°C反應(yīng)IOmin ；95°C反應(yīng)15sec，60°C反應(yīng)60sec，40個(gè)循環(huán)。4.結(jié)果分析實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用實(shí)時(shí)熒光7500FAST PCR儀分析軟件，對(duì)擴(kuò)增的圖 譜進(jìn)行分析，當(dāng)初始循環(huán)數(shù)(Ct) <35時(shí)，判定實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)為陽性。檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)增圖 譜如圖1。圖1表明，參試的七個(gè)油菜莖基潰瘍病菌菌株均有良好的擴(kuò)增曲線，Ct值從左到 右分別為 16. 9 (200782)、20. 23 (J-9) ,21. 84 (J-4)、22. 36 (J-Il),22. 94 (J-2)、24. 32 (A-7) 和25. 77(UK-20)，表示實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)果均為陽性。實(shí)施例3油菜莖基潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的特異性試驗(yàn)
1.參試菌株近似種油菜黑脛病菌(L. biglobosa)菌株6個(gè)，其中2_2、9_4、12-2、19-3四 個(gè)菌株均為安徽省農(nóng)科院作物研究所李強(qiáng)生老師惠贈(zèng)；CK6和CK8為從加拿大油菜籽 中分離到的油菜黑脛病菌(L. biglobosa)；一個(gè)近似種草莖點(diǎn)病菌(Phoma herbarum) 和一個(gè)種腐病菌(Phomopsis longicolla)；從加拿大油菜籽中分離到的其他病菌 5 株， 分 別 為 CK3 (Leptosphaerulina chartarum)、CK7 (Alternaria alternata)、 CK9 (Alternariaoregonenis)、CK12(蕓苔交鏈孢菌 Alternaria brassicae)和 CK13(串孢 鐮刀菌Fusarium proliferatum)；另外，陽性對(duì)照為油菜莖基潰瘍病菌(ATCC :200782)；總 共14個(gè)菌株。2.制備參試菌株的DNA取少量培養(yǎng)的參試菌株菌絲或菌絲塊，加入液氮充分研磨成粉狀物后，利用真菌 DNA提取試劑盒(DNeasy plant mini kit，QIAGEN公司產(chǎn)品)制備菌株DNA。3.用實(shí)施例2相同的方法對(duì)共14個(gè)菌株的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)4.結(jié)果分析實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用實(shí)時(shí)熒光PCR儀分析軟件(7500FAST 2. 0)，對(duì)擴(kuò)增 的圖譜進(jìn)行分析，當(dāng)初始循環(huán)數(shù)(Ct) <35時(shí)，判定實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)為陽性。測(cè)試結(jié)果的 擴(kuò)增的圖譜如圖2。圖2表明，參試的14個(gè)菌株中只有陽性對(duì)照油菜莖基潰瘍病菌(ATCC 200782)有良好的擴(kuò)增曲線，其Ct值為12. 67 ；其余13個(gè)近似種及菌株均無擴(kuò)增反應(yīng)，表明 用本試劑及其建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)油菜莖基潰瘍病菌的檢測(cè)具有良好的特異性。實(shí)施例4油菜莖基潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn)1、參試菌株油菜莖基潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC編號(hào)；200782)。2、油菜莖基潰瘍病菌DNA的制備取少量培養(yǎng)的油菜莖基潰瘍病菌菌絲，加入液氮充分研磨成粉狀物后，利用真菌 DNA提取試劑盒(DNeasy plant mini kit，QIAGEN公司產(chǎn)品)制備菌株DNA。將菌絲DNA 的濃度分別定量至lOOng/μ L，然后用EASY DILUTION(TaKaRa公司產(chǎn)品)分別稀釋到如下 濃度5ng/ μ L>500pg/ μ L>50pg/ μ L、5pg/y L、500fg/y L>50fg/ μ L>5fg/ μ L 禾口 0. 5fg/y L03、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)用實(shí)施例2相同的方法對(duì)各濃度的菌株DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，每個(gè)濃度設(shè) 置三次重復(fù)試驗(yàn)。4、結(jié)果分析實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用實(shí)時(shí)熒光7500FAST PCR儀分析軟件，對(duì)擴(kuò)增的圖 譜進(jìn)行分析，當(dāng)初始循環(huán)數(shù)(Ct) ^ 35時(shí)，判定實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)為陽性。擴(kuò)增的圖譜如圖3。圖3表明，菌絲DNA的濃度從5ng/ μ L、500pg/ μ L、50pg/ μ L、 5pg/ μ L、500fg/ μ L、50fg/ μ L和5fg/ μ L均有良好的擴(kuò)增曲線，Ct平均值從小到大依次為 16. 2,19. 89,23. 54,27. 29,30. 87,34. 44,34. 48 和 36. 99，因此，所建立的油菜蓮基潰蕩病 菌real-timePCR檢測(cè)的靈敏度可達(dá)IOfg的菌絲DNA。并且，圖4可見，菌絲DNA的濃度在5ng/yL 50fg/yL范圍內(nèi)，real-time PCR具有良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)，可對(duì)未知 的油菜莖基潰瘍病菌DNA進(jìn)行定量分析。
權(quán)利要求
一種油菜莖基潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR分子檢測(cè)試劑盒，其特征是包括如下試劑基因表達(dá)通用混合試劑，ddH2O；探針與引物的混合物，包含5μmol·L 1的LMpro探針、18μmol·L 1的LMf上游引物和18μmol·L 1LMr的下游引物；陽性對(duì)照濃度為100ng/μL的油菜莖基潰瘍病菌DNA溶液；所說的LMf上游引物序列為5’ GTTTCCTTGGTGGGCTTGC 3’，所說的LMr下游引物序列為5’ TGTTACTGACGCTGACTGCAATT 3’，所說的LMpro探針序列為5’FAM ATTGGATCCCCTAAAACC NFQ MGB3’，其中，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，NFQ(Non Fluorescent Quencher)為非熒光淬滅基團(tuán)，MGB(Minor Groove Binder)為修飾基團(tuán)。
2.用權(quán)利要求1的試劑盒檢測(cè)油菜莖基潰瘍病菌的方法，其特征是包括如下步驟(1)提取待測(cè)樣品的DNA;(2)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)以所得樣品DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系含有10 μ L 的基因表達(dá)通用混合試劑，1 μ L探針與引物的混合物，2 μ L樣品DNA，7 μ L的ddH20，反應(yīng) 總體積為20 μ L ；實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為95°C反應(yīng)IOmin ；95°C反應(yīng)15sec，60°C反應(yīng) 60sec，共40個(gè)循環(huán)；(3)結(jié)果分析實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用實(shí)時(shí)熒光PCR儀分析軟件，對(duì)擴(kuò)增的圖譜進(jìn)行分析，當(dāng) 初始循環(huán)數(shù)(Ct) <35時(shí)，判定實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)為陽性，表示所檢測(cè)的樣品中含有油菜莖 基潰瘍病菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種油菜莖基潰瘍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR分子檢測(cè)試劑盒，包含基因表達(dá)通用混合試劑、ddH2O、探針與引物混合物及陽性對(duì)照。探針與引物混合物包含5μmol·L-1的LMpro探針、18μmol·L-1的LMf上游引物和18μmol·L-1的LMr下游引物；陽性對(duì)照為濃度為100ng/μL的油菜莖基潰瘍病菌DNA溶液。本試劑盒可直接對(duì)油菜籽或植株病殘?bào)w檢測(cè)，快速、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，尤其可用于檢測(cè)病原菌含量較低的樣品，特別適合對(duì)進(jìn)出境油菜籽等十字花科作物的種子、植株及病殘?bào)w中油菜莖基潰瘍病菌的快速檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101928779SQ20101902606
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者吳新華, 吳晶, 吳翠萍, 孫民琴, 安榆林, 李彬, 粟寒, 陳貫源 申請(qǐng)人:江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心