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      含有益生微生物的成長(zhǎng)乳的制作方法

      文檔序號(hào):392155閱讀:187來源:國知局
      專利名稱:含有益生微生物的成長(zhǎng)乳的制作方法
      含有益生微生物的成長(zhǎng)乳本發(fā)明涉及嬰兒和幼兒的營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域。特別地,本發(fā)明涉及包含待施用于大于10個(gè)月年齡的嬰兒和幼兒的益生微生物的成長(zhǎng)乳。這些益生微生物可為非復(fù)制型益生微生物, 例如生物活性的經(jīng)熱處理的益生微生物。母乳是嬰兒健康成長(zhǎng)和發(fā)育的理想的食物。在2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)把其推薦的專有的母乳喂養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間從4到6個(gè)月改變到6個(gè)月,因而應(yīng)該相應(yīng)地鼓勵(lì)和促進(jìn)母乳喂養(yǎng)。從第六個(gè)月起嬰兒行為開始變化。他們第一次坐起來或僅用一只手抓住玩具。嬰兒的營(yíng)養(yǎng)需要隨著嬰兒發(fā)育改變。營(yíng)養(yǎng)物如鐵和鈣變得更加重要。從一歲起,基于牛乳的飲料成為嬰兒食物中重要的一項(xiàng)。但是牛乳本身不適應(yīng)于幼兒的營(yíng)養(yǎng)需要。特別地,牛乳含有過多的蛋白質(zhì),過多的礦物質(zhì)、過少的鐵、過多的飽和脂肪酸和不足夠的不飽和脂肪。開發(fā)成長(zhǎng)乳(growing up milks ;GUM)以協(xié)助渡過這步。GUM保證了從母乳的較低蛋白質(zhì)水平到牛乳和成人使用的正常乳制品中存在的高蛋白質(zhì)水平的穩(wěn)定過渡。成長(zhǎng)乳(GUM)目標(biāo)為幫助初級(jí)階段學(xué)步幼兒最大化他們?cè)谏眢w和智力發(fā)育方面的潛力。GUM滿足了學(xué)步幼兒的蛋白質(zhì)需要,同時(shí)不會(huì)使仍未成熟的代謝系統(tǒng)過載。嬰兒和幼兒早期營(yíng)養(yǎng)的一個(gè)重要功能是生成健康的腸菌群和發(fā)育強(qiáng)壯的免疫系統(tǒng)。健康的腸菌群將促成功能性的胃腸道,這本身又有助于嬰兒和幼兒合適地消化攝入的食物并將減少胃痛。一般地嬰兒和幼兒每年患10次左右感冒。此類感冒是不舒服的并甚至可有更嚴(yán)重的后果。因此進(jìn)一步改善成長(zhǎng)乳的免疫加強(qiáng)作用是需要的。進(jìn)一步改善成長(zhǎng)乳的抗炎作用也是需要的。因此,本領(lǐng)域需要成長(zhǎng)乳,所述成長(zhǎng)乳確保從母乳的較低蛋白質(zhì)水平到存在于牛乳中高蛋白質(zhì)水平的穩(wěn)定過渡。此類成長(zhǎng)乳應(yīng)該具有改善的免疫加強(qiáng)作用、抗炎作用和/ 或應(yīng)該易于消化。如果通過使用天然成分來實(shí)現(xiàn)這一需要是優(yōu)選的,所述天然成分對(duì)于施用是安全且沒有副作用的,并且是使用本領(lǐng)域現(xiàn)有工業(yè)技術(shù)易于摻入到成長(zhǎng)乳組合物中的。本發(fā)明人已經(jīng)陳述了此需要。因此本發(fā)明的目的為改善本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)和提供 GUM組合物,所述GUM組合物滿足以上表述的需要。本發(fā)明人令人驚訝地看到通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題他們能夠達(dá)到此目標(biāo)。從屬權(quán)利要求進(jìn)一步發(fā)展了本發(fā)明的想法。因此,本發(fā)明人提出了提供包含益生菌劑的成長(zhǎng)乳組合物。成長(zhǎng)乳組合物為營(yíng)養(yǎng)組合物。特別地成長(zhǎng)乳為特定的營(yíng)養(yǎng)組合物,所述營(yíng)養(yǎng)組合物具有允許從母乳組合物到牛乳組合物的穩(wěn)定過渡的組成??芍鸩降刈龀龃苏{(diào)整??深A(yù)見若干不同的成長(zhǎng)乳伴隨此過渡。例如,在10個(gè)月年齡開始可施用一種成長(zhǎng)乳組合物,在12個(gè)月年齡開始可施用第二種成長(zhǎng)乳組合物而在24個(gè)月年齡開始可施用第三種成長(zhǎng)乳組合物。發(fā)現(xiàn)益生菌劑在成長(zhǎng)乳的結(jié)構(gòu)中能夠提供它們的健康益處。此外,例如雙歧桿菌, 存在于母乳中并且為給予母乳其天然保護(hù)性質(zhì)的一部分。因此,向嬰兒和幼兒營(yíng)養(yǎng)配方乳(formula)中加入益生微生物將使得它們更像母乳。然而,特別地由于待用水重構(gòu)的粉狀配方乳通常的貯存期限超過例如包含益生菌劑的酸奶飲料的貯存期限,通常益生菌劑不加入到此類配方乳中,這是因?yàn)槔缭谘娱L(zhǎng)的貯存期限期間能夠確保益生菌劑存活力的非確定性。本發(fā)明人現(xiàn)在能夠表明甚至非復(fù)制型益生菌劑能夠提供益生菌劑的健康益處和甚至可具有改善的益處。因此,本發(fā)明涉及包含待施用于從10個(gè)月年齡開始的嬰兒或幼兒的益生微生物的成長(zhǎng)乳組合物。成長(zhǎng)乳提供了具有平衡的脂肪酸組成的合適量的脂類。脂類是最好的能量提供者 (9kcal/g),為學(xué)步幼兒的增加的活動(dòng)所需。但是脂肪酸也是細(xì)胞膜構(gòu)建所需要的,并且是一些有生理活性的因子(例如激素、凝固因子等)重要的前體。FDA條例定義嬰兒為不大于12個(gè)月年齡的人(Title 21,Code of Federal Regulations 21CFR 105.3(e))。本發(fā)明的成長(zhǎng)乳組合物包含平衡的蛋白質(zhì)含量。一方面,尤其在生長(zhǎng)時(shí)期期間,例如構(gòu)建身體組織例如肌肉時(shí)需要蛋白質(zhì)。另一方面,高量蛋白質(zhì)為學(xué)步幼兒的仍未成熟的腎功能添加了負(fù)擔(dān)。如果腎功能還沒有成熟,高蛋白質(zhì)攝入能夠損害腎功能。研究提不大于I歲齡的兒童趨向于具有聞?dòng)趦嚎仆扑]的蛋白質(zhì)攝入。聞蛋白質(zhì)攝入也牽涉了以后生活中的肥胖癥。牛乳具有對(duì)于嬰兒和幼兒營(yíng)養(yǎng)次佳的脂肪酸組成。飽和脂肪酸高而不飽和脂肪酸低,牛乳沒有提供最佳和最健康的脂肪酸組成。生長(zhǎng)需要不飽和脂肪酸,例如用于在神經(jīng)系統(tǒng)中構(gòu)建細(xì)胞,并且研究顯示很多學(xué)步幼兒沒有接受推薦的水平。例如,腦極富含DHA(n-3 不飽和脂肪酸)。因此本發(fā)明的成長(zhǎng)乳組合物可具有在兩個(gè)家族的必需脂肪酸之間良好的平衡,在n-6脂肪酸如亞麻酸和n-3脂肪酸如α -亞麻酸之間具有約4_10的比率。如果作為干組合物提供,優(yōu)選GUM組合物水活度在O. 2以下,優(yōu)選地在O. 15以下以進(jìn)一步提高貯存穩(wěn)定性。例如,水活度在O. 91以下時(shí)大多數(shù)細(xì)菌不生長(zhǎng),而水活度在
      O.80以下時(shí)大多數(shù)霉菌停止生長(zhǎng)。水活度(aw)是在系統(tǒng)中水的能量狀態(tài)的量度。它被定義為水的蒸氣壓力除以純水的蒸氣壓力。因而,蒸餾水的水壓力為I。本發(fā)明的成長(zhǎng)乳組合物可具有在70_80kcal/100ml范圍內(nèi)的熱密度,并且包含 2-3g/100kcal的量的蛋白質(zhì)源,12-15g/100kcal的量的糖源,和3-4. 6g/100kcal的量的脂類源。待施用于10-12個(gè)月年齡的嬰兒的本發(fā)明的成長(zhǎng)乳組合物可具有在約 70kcal/100ml范圍內(nèi)的熱密度,并且包含2. 2-2. 3g/100kcal的量的蛋白質(zhì)源,約 13g/100kcal的量的糖源,和4. 3至4. 4g/100kcal的量的脂類源。
      待施用于12-24個(gè)月年齡的兒童的本發(fā)明的成長(zhǎng)乳組合物可具有在約 70-80kcal/100ml范圍內(nèi)的熱密度,并且包含2. 2-2. 9g/100kcal的量的蛋白質(zhì)源,約 11. 9-13. 9g/100kcal的量的糖源,和3. 9至4. 6g/100kcal的量的脂類源。待施用于24個(gè)月以上年齡的兒童的本發(fā)明的成長(zhǎng)乳組合物可具有約 70kcal/100ml的熱密度,并且包含約2. 5g/100kcal的量的蛋白質(zhì)源,約14. 6g/100kcal的量的糖源,和3. 9至4. 6g/100kcal的量的脂類源。蛋白質(zhì)源可由乳清蛋白和酪蛋白組成。例如,可使用乳清對(duì)酪蛋白在約20 80 到80 20的范圍內(nèi),例如40 60到60 40的比率。糖源可基本由乳糖組成。然而也可使用乳糖對(duì)麥芽糖糊精在3 : I到I : I范圍內(nèi)的比率。本發(fā)明的喂養(yǎng)配方乳可包含0.2-0. 3g LC-PUFA/100g脂肪酸。LC-PUFA可選自 ARA、DHA或其組合。例如,LC-PUFA可包含ARA和DHA的組合。已經(jīng)顯示了含有DHA和ARA 的配方乳提供視覺和智力發(fā)育,與母乳哺育的嬰兒類似。本發(fā)明的喂養(yǎng)配方乳也可含有每IOOml配方乳I. 5-2. 5mg核苷酸。不認(rèn)為核苷酸和它們的堿基是“必需的,,因?yàn)閶雰荷眢w能夠從較簡(jiǎn)單的化合物合成它們。然而在某些時(shí)間,合成過程可能不能夠滿足需求,例如像在正常生長(zhǎng)或在胃腸疾病中迅速細(xì)胞更新時(shí)期的期間。在這些時(shí)間,身體更多依賴于核苷酸的飲食源。組合物可包含部分或僅非復(fù)制型益生微生物。本發(fā)明人驚異地發(fā)現(xiàn),例如,在免疫加強(qiáng)作用方面和/或在抗炎作用方面,非復(fù)制型益生微生物甚至可比復(fù)制型益生微生物更有效。這是令人驚異的,因?yàn)橐嫔鷦┙?jīng)常被定義為“當(dāng)以足夠的量施用時(shí)賦予宿主健康益處的活微生物”(FA0/WH0指南)。絕大多數(shù)公開的文獻(xiàn)涉及活益生菌劑。此外,若干研究調(diào)查了由非復(fù)制型細(xì)菌遞送的健康益處且它們多數(shù)表明了益生菌劑的失活,例如,通過熱處理,導(dǎo)致?lián)p失了它們聲稱的健康益處(Rachmilewitz, D.等人,2004, Gastroenterology 126 :520-528 ;Castagliuolo 等人,2005,F(xiàn)EMS Immunol. Med. Microbiol. 43 :197-204 ; Gill, H. S.和 K. J. Rutherfurd,2001,Br. J. Nutr. 86 :285-289 ;Kaila,M.等 A, 1995, Arch. Dis. Child 72:51-53.)。一些研究顯示了滅活的益生菌劑可保留一些健康作用(Rachmilewitz, D.等人,2004, Gastroenterology 126 :520-528 ;Gill, H. S.和 K. J. Rutherfurd, 2001, Br. J. Nutr. 86 :285-289),但明確地,本領(lǐng)域迄今認(rèn)為活益生菌劑為更有效的。根據(jù)本發(fā)明的組合物可包含任意有效量的益生微生物,例如對(duì)應(yīng)于約IO6到 IO12CfVg干重的量。益生微生物可為非復(fù)制型益生微生物?!胺菑?fù)制型”益生微生物包括已被熱處理的益生細(xì)菌。這包括失活的、死亡的、非活的和/或以片段例如DNA、代謝物、細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物、和/或細(xì)胞壁物質(zhì)存在的微生物?!胺菑?fù)制型”意為沒有活細(xì)胞和/或菌落形成單位能夠由經(jīng)典的平板培養(yǎng)法檢出。 此類經(jīng)典的平板培養(yǎng)法總結(jié)于微生物學(xué)書中James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology.第7版,Springer Science,New York, N. Y. 790p。一般地,能夠按如下示出活細(xì)胞不存在在瓊脂平板上沒有可見的菌落或在用不同濃度的細(xì)菌制備物(“非復(fù)制型”樣本)接種和在適當(dāng)條件(需氧和/或厭氧環(huán)境至少 24小時(shí))溫育之后液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中沒有增加的濁度。為了本發(fā)明的目的,定義益生菌劑為“對(duì)宿主的健康或安康具有有益作用的微生物細(xì)胞制備物或微生物細(xì)胞組分”(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人“Probiotics : how should they be defined” Trends Food Sci. Technol. 1999 :10107-10)。使用非復(fù)制型益生微生物的可能性提供了若干優(yōu)勢(shì)。在嚴(yán)重免疫損傷的兒童中, 由于患菌血癥的潛在危險(xiǎn)在特殊情形中活益生菌劑的使用可受限制??蔁o任何問題地使用非復(fù)制型益生菌劑。額外地,提供的非復(fù)制型益生微生物在保持健康益處同時(shí)允許熱重構(gòu)。本發(fā)明的組合物包含足夠至少部分地產(chǎn)生健康益處的量的益生微生物和/或非復(fù)制型益生微生物。實(shí)現(xiàn)此的足夠的量被定義為“治療有效量”。對(duì)此目的有效的量將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多因素例如重量和兒童的總體健康狀態(tài),并取決于食物基質(zhì)的影響。在預(yù)防性的應(yīng)用中,對(duì)消費(fèi)者施用足夠至少部分地減少患病危險(xiǎn)的量的根據(jù)本發(fā)明的組合物,所述消費(fèi)者易感或有患病的危險(xiǎn)。定義此類量為“預(yù)防有效量”。再一次,準(zhǔn)確的量取決于許多因素例如兒童的健康和重量狀態(tài),并取決于食物基質(zhì)的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)卣{(diào)整治療有效量和/或預(yù)防有效量??傊畞碚f,本發(fā)明的組合物含有治療有效量和/或預(yù)防有效量的益生微生物和/ 或非復(fù)制型益生微生物。一般地,治療有效量和/或預(yù)防有效量是每日劑量在約0. 005mg-1000mg益生微生物和/或非復(fù)制型益生微生物范圍內(nèi)。在數(shù)量方面,“短時(shí)間高溫度”處理的非復(fù)制型微生物可以對(duì)應(yīng)于IO4和IO12等價(jià)的cfu/g干組合物之間的量存在于組合物中。顯而易見地,非復(fù)制型微生物不形成菌落,因而,此術(shù)語理解為從IO4到IO12CfVg的復(fù)制型細(xì)菌獲得的非復(fù)制型微生物的量。此包括失活的、非活的或死亡的或以片段例如DNA或細(xì)胞壁或細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物存在的微生物。換句話說,以微生物的在菌落形成能力(cfu)上的量表示組合物含有的微生物的量,如同全部微生物是活的而不考慮它們是否是活的,實(shí)際上,它們是非復(fù)制型的,例如失活的或死亡的、 片段的或任何或全部這些狀態(tài)的混合物。優(yōu)選地,非復(fù)制型微生物以等同于IO4和109CfU/g干組合物之間的量存在,更優(yōu)選地以等同于IO5和IO9CfVg干組合物之間的量存在。通過本領(lǐng)域已知的任何方法可使益生菌劑成為非復(fù)制型。當(dāng)今可用的使得益生菌株成為非復(fù)制型的技術(shù)通常為熱處理、伽馬輻射、UV線或使用化學(xué)試劑(福爾馬林,多聚甲醛)。優(yōu)選地使用使得益生菌劑非復(fù)制性的技術(shù),所述技術(shù)在食品工業(yè)中工業(yè)環(huán)境下相對(duì)簡(jiǎn)單地應(yīng)用。在它們的生產(chǎn)過程中,當(dāng)今市場(chǎng)上的多數(shù)含有益生菌劑的產(chǎn)品被熱處理。因此,在益生菌劑保持或提高它們的有益的性質(zhì)或甚至獲得對(duì)消費(fèi)者新的有益的性質(zhì)的同時(shí),能夠與生產(chǎn)的產(chǎn)品一起或至少以相似的方法熱處理益生菌劑將是方便的。然而,在文獻(xiàn)中通過熱處理的益生微生物失活與至少部分益生菌劑活性丟失普遍地相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明人現(xiàn)在驚異地發(fā)現(xiàn),例如,通過熱處理使得益生微生物成為非復(fù)制型不導(dǎo)致益生菌劑健康益處的丟失,相反地,可增強(qiáng)現(xiàn)存的健康益處并甚至生成新的健康益處。因此,本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是組合物,其中非復(fù)制型益生微生物通過熱處理成為非復(fù)制型。在至少71. 5°C達(dá)至少I秒可實(shí)施此熱處理??墒褂瞄L(zhǎng)時(shí)程熱處理或短時(shí)程熱處理。在當(dāng)今工業(yè)規(guī)模中通常優(yōu)選短時(shí)程熱處理,例如UHT-樣熱處理。這類熱處理減少細(xì)菌負(fù)荷,并且減少加工時(shí)間,從而減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞。發(fā)明人第一次展示了不論它們初始的性質(zhì),被高溫度短時(shí)間熱處理的益生微生物表現(xiàn)了抗炎的免疫譜。特別地通過此熱處理發(fā)展新的抗炎譜或加強(qiáng)現(xiàn)有的抗炎譜。因此通過使用特定的熱處理參數(shù),現(xiàn)在可能生成具有抗炎免疫譜的非復(fù)制型益生微生物,所述熱處理參數(shù)對(duì)應(yīng)于一般的工業(yè)可應(yīng)用的熱處理,即使活的對(duì)應(yīng)物是非抗炎菌株。因此,例如,熱處理可為在約71. 5_150°C達(dá)約1_120秒高溫度處理。高溫度處理可為高溫度/短時(shí)間(HTST)處理或超高溫度(UHT)處理。益生微生物可在約71. 5_150°C達(dá)約1_120秒的短時(shí)程高溫度處理。更為優(yōu)選地益生微生物可在約90_140°C,例如90_120°C,達(dá)約1-30秒的短時(shí)程高
      溫度處理。此高溫度處理使得微生物至少部分成為非復(fù)制型??稍谡4髿鈮毫Φ部稍诟邏毫ο聦?shí)施高溫度處理。一般的壓力在從I到50 巴范圍內(nèi),優(yōu)選地從I到10巴,更為優(yōu)選地從2到5巴。明顯地,加熱時(shí),優(yōu)選在培養(yǎng)基中熱處理益生菌劑,所述培養(yǎng)基為液體或固體。應(yīng)用的理想的壓力將因此取決于提供微生物的組合物的本性和使用的溫度。在約71. 5_150°C,優(yōu)選地約90_120°C,更為優(yōu)選地約120_140°C的溫度范圍內(nèi)可
      實(shí)施高溫度處理。可實(shí)施高溫度處理達(dá)約1-120秒,優(yōu)選地約1-30秒,更為優(yōu)選地約5_15秒的短時(shí)程。此給出的時(shí)間框架指益生微生物在給出的溫度的處理時(shí)間。需注意的是,取決于提供微生物的組合物的本性和量以及取決于使用的加熱裝置的構(gòu)造,熱應(yīng)用的時(shí)間可不同。然而一般地,通過高溫度短時(shí)間(HTST)處理、巴氏瞬間滅菌法或超高溫度處理 (UHT)來處理本發(fā)明的組合物和/或微生物。UHT處理是超高溫度加工或超熱處理(兩者都縮寫為UHT),涉及通過大約1_10 秒,溫度超過135°C (275F)短時(shí)間加熱組合物的至少部分滅菌,所述溫度是殺死奶中的細(xì)菌芽孢所必需的。例如,使用超過135°C溫度用這種方法加工奶使得在必要持續(xù)時(shí)間內(nèi)(至
      2-5秒)降低細(xì)菌負(fù)荷,使能夠連續(xù)流操作。有兩種主要類型的UHT系統(tǒng)直接和間接系統(tǒng)。在直接系統(tǒng)中,通過蒸汽注射或蒸汽輸注處理產(chǎn)品,而在間接系統(tǒng)中,使用平板熱交換器、管狀熱交換器或刮面熱交換器熱處理產(chǎn)品。可在產(chǎn)品制備方法中的任一步驟或多個(gè)步驟中應(yīng)用UHT系統(tǒng)的組合。HTST處理如下定義(高溫度/短時(shí)間)巴氏滅菌法設(shè)計(jì)達(dá)到5-log減少,殺死在奶中活的微生物數(shù)量的99. 9999%。對(duì)于破壞幾乎全部酵母、霉菌和常見的腐敗細(xì)菌認(rèn)為這是足夠的,并且也保證常見病原性熱抗性生物的足夠的破壞。在HTST方法中加熱奶至 71.7。。(161。F)達(dá) 15-20 秒。巴氏瞬間滅菌法是易腐的飲料(像水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品)的熱巴氏滅菌法的方法。它先于裝入容器中完成,為的是殺死腐敗微生物,以使得產(chǎn)品更安全以及延長(zhǎng)它們的貯存期限。液體在71. 50C (160° F)到74°C (165° F)溫度達(dá)約15到30秒處理的同時(shí)以受控制的連續(xù)流移動(dòng)。為了本發(fā)明的目的,術(shù)語“短時(shí)間高溫度處理”應(yīng)包括例如高溫度短時(shí)間(HTST) 處理、UHT處理、和巴氏瞬間滅菌法。由于此類熱處理提供了具有提高的抗炎譜的非復(fù)制型益生菌劑,本發(fā)明的組合物可用于炎性疾病的預(yù)防或治療。不特別地限制能夠通過本發(fā)明的組合物治療或預(yù)防的炎性疾病。例如,它們可選自急性炎癥例如膿毒?。蛔苽?;和慢性炎癥,例如炎性腸病,例如,節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、隱窩炎(pouchitis);壞死性小腸結(jié)腸炎;皮膚炎癥,例如UV或化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚炎癥、 濕疹、反應(yīng)性皮膚;腸易激綜合征;眼炎癥;變態(tài)反應(yīng)、哮喘;和它們的組合。如果使用長(zhǎng)時(shí)程熱處理使得益生微生物成為非復(fù)制型,可在約70_150°C溫度范圍內(nèi)達(dá)約3分鐘-2小時(shí),優(yōu)選地在80-140°C范圍內(nèi)從5分鐘-40分鐘實(shí)施此類熱處理。盡管現(xiàn)有技術(shù)通常教導(dǎo)通過長(zhǎng)時(shí)程熱處理變成非復(fù)制型的細(xì)菌通常在它們益生特性上不如活細(xì)胞有效,本發(fā)明人能夠展示出與它們的活對(duì)應(yīng)物相比被熱處理的益生菌劑在刺激免疫系統(tǒng)中是優(yōu)越的。本發(fā)明也涉及包含益生微生物的組合物,所述微生物通過在至少約70 V達(dá)至少約 3分鐘的熱處理成為非復(fù)制型。通過體外免疫譜分析確認(rèn)非復(fù)制型益生菌劑的免疫加強(qiáng)作用。使用的體外模型使用來自人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞因子譜分析并且作為測(cè)試免疫調(diào)節(jié)化合物的標(biāo)準(zhǔn)模型在本領(lǐng)域中被廣為接受(Schultz等人,2003, Journal of Dairy Research
      70.165-173;Taylor 等人,2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235 ; Kekkonen 等人,2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203)。若干作者/研究隊(duì)伍已經(jīng)使用了體外PBMC測(cè)定法例如根據(jù)益生菌劑的免疫譜,即它們的抗或促炎特征對(duì)它們分類(Kekkonen等人,2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203)。例如,在結(jié)腸炎小鼠模型中已經(jīng)顯不出此測(cè)定法允許預(yù)測(cè)益生候選者的抗炎作用(Foligne, B.,等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 236-243)。此外,在臨床試驗(yàn)中此測(cè)定法被經(jīng)常地用作讀出(read-out)測(cè)定法并且顯示了此測(cè)定法導(dǎo)致與臨床結(jié)果一致的結(jié)果(Schultz等人,2003, Journal of Dairy Research
      70.165-173;Taylor 等人,2006, Clinical and Experimental Allergy, 36,1227-1235)。在過去的幾十年中變態(tài)反應(yīng)性疾病穩(wěn)定地上升并且當(dāng)前WHO認(rèn)為它們是流行病。 一般地,認(rèn)為變態(tài)反應(yīng)由免疫系統(tǒng)的Thl和Th2應(yīng)答的不平衡造成,所述不平衡導(dǎo)致強(qiáng)烈偏向于Th2介質(zhì)的生產(chǎn)。因此,通過恢復(fù)免疫系統(tǒng)的Thl分路和Th2分路之間的適當(dāng)?shù)钠胶饽軌蚓徍?、下調(diào)或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。這暗示了減少Th2應(yīng)答或至少瞬時(shí)增強(qiáng)Thl應(yīng)答的必要性。后者將是免疫加強(qiáng)應(yīng)答的特征,通常由例如較高水平的IFNy、TNF-α和IL-12伴隨。(Kekkonen等人,2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203 ;Viljanen M.等人,2005,Allergy,60,494-500)。本發(fā)明的組合物因而允許其治療或預(yù)防與受損的免疫防御相關(guān)的疾病。因此,不特別地限制能夠通過本發(fā)明的組合物治療或預(yù)防的與受損的免疫防御相關(guān)的疾病。例如,它們可選自感染,特別地為細(xì)菌的、病毒的、真菌的和/或寄生蟲感染;吞噬細(xì)胞缺陷;低的到嚴(yán)重的免疫抑制水平例如由壓力或免疫抑制藥物、化學(xué)療法或放射療法誘導(dǎo)的那些免疫抑制水平;較少免疫活性的免疫系統(tǒng)的天然狀態(tài),例如新生兒的那些免疫系統(tǒng);變態(tài)反應(yīng);以及其組合。本發(fā)明描述的組合物也允許其增強(qiáng)兒童對(duì)疫苗的應(yīng)答,特別地為對(duì)口服疫苗的應(yīng)答。任何量的非復(fù)制型微生物將會(huì)是有效力的。然而,普遍地優(yōu)選,如果至少90%,優(yōu)選地,至少95 %,更優(yōu)選地至少98 %,最優(yōu)選地至少99 %,理想地至少99. 9 %,最理想地全部益生菌劑為非復(fù)制型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中全部微生物為非復(fù)制型。因此,在本發(fā)明的組合物中至少90%,優(yōu)選地,至少95%,更優(yōu)選地至少98%,最優(yōu)選地至少99%,理想地至少99. 9%,最理想地全部益生菌劑可為非復(fù)制型。全部益生微生物可用于本發(fā)明的目的。例如,益生微生物可選自雙歧桿菌屬(bifidobacteria)、乳桿菌屬 (Iactobacilli)、丙酸桿菌屬(propionibacteria),或其組合,例如長(zhǎng)雙歧桿菌 (Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、動(dòng)物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌 (Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)、類干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、約漢遜氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、雙乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌 (Lactobacillus delbrueckii)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和 / 或它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明組合物可包含例如選自長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 3001、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 2705、 短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、約漢遜氏乳桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、路氏乳桿菌DSM17983、路氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌 NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌 ACA-DC 6002 (NCC 1825)、大腸埃希氏菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC 15、乳酸乳球菌NCC2287,或它們的組合的益生微生物。全部這些菌株在布達(dá)佩斯條約下保藏和/或是可商購的。在布達(dá)佩斯條約下保藏的菌株如下長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 3001 ATCC BAA-999
      長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 2705 CNCM 1-2618
      短雙歧桿菌NCC 2950CNCM 1-3865
      乳雙歧桿菌NCC 2818 CNCM 1-3446
      類干酪乳桿菌NCC 2461 CNCM 1-2116
      鼠李糖乳桿菌NCC 4007 CGMCC I.3724
      嗜熱鏈球菌NCC2019 CNCM 1-1422
      嗜熱鏈球菌NCC2059 CNCM 1-4153
      乳酸乳球菌NCC2287 CNCM 1-4154
      干酪乳桿菌NCC4006 CNCM 1-1518
      干酪乳桿菌NCC1825 ACA-DC 6002
      嗜酸乳桿菌NCC3009 ATCC 700396
      保加利亞乳桿菌NCC 15 CNCM 1-1198
      約漢遜氏乳桿菌LalCNCM 1-1225
      路氏乳桿菌DSM17983DSM17983
      路氏乳桿菌ATCC55730ATCC55730
      大腸埃希氏菌Nissle 1917DSM 6601本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解他們能夠自由地組合本發(fā)明此處描述的全部特征而不偏離本發(fā)明公開的范圍。本發(fā)明另外的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)從下述實(shí)施例和圖中顯而易見。圖IA和B顯示了受“短時(shí)間高溫度”處理的益生菌劑的抗炎免疫譜的增強(qiáng)。圖2顯示了非抗炎益生菌株變?yōu)榭寡椎?,即非抗炎益生菌株在受“短時(shí)間高溫度” 處理后表現(xiàn)了顯著的體外抗炎免疫譜。圖3A和B顯示了在可商購的產(chǎn)品中使用的益生菌株,在被“短時(shí)間高溫度”處理之后所述益生菌株表現(xiàn)了增強(qiáng)的或新的體外抗炎免疫譜。圖4A和B顯示了乳品起子菌株(即Lcl起子菌株),在高溫度熱處理時(shí)所述起子菌株表現(xiàn)了增強(qiáng)的或新的體外抗炎免疫譜。圖5顯示了非抗炎益生菌株,在被HTST處理之后所述益生菌株表現(xiàn)了體外抗炎免疫譜。圖6 :用以它們活的和熱處理(140°C達(dá)15秒)形式的益生和乳品起子菌株生成的 PBMC數(shù)據(jù)的主成分分析(IL-12p40、IFN- y、TNF- a、IL-10)。每一個(gè)點(diǎn)代表用NCC數(shù)字或名稱標(biāo)識(shí)的活的或熱處理的一株菌株。圖7顯示了活的和熱處理的(85°C,20分鐘)菌株的IL-12p40/IL_10比率??傮w地,在85°C達(dá)20分鐘的熱處理導(dǎo)致IL-12p40/IL-10比率上升,與本發(fā)明的“短時(shí)間高溫度” 處理相反(

      圖1、2、3、4、和5)。圖8顯示了來自用熱處理的細(xì)菌刺激的人PBMCs的體外細(xì)胞因子分泌的增強(qiáng)。
      圖9顯示了在受鹽水攻擊的OVA致敏的小鼠中(陰性對(duì)照)、在受OVA攻擊的OVA 致敏的小鼠中(陽性對(duì)照)和在受OVA攻擊以及用熱處理的或活的短雙歧桿菌NCC2950處理的OVA致敏的小鼠中觀測(cè)到的腹瀉強(qiáng)度百分?jǐn)?shù)。以腹瀉強(qiáng)度百分?jǐn)?shù)展示結(jié)果(從4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中計(jì)算平均值土SEM),100%腹瀉強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于在陽性對(duì)照(由變態(tài)反應(yīng)原致敏和攻擊)組中發(fā)展的癥狀。實(shí)施例I :方法學(xué)細(xì)菌制備物通常認(rèn)為活的益生菌制劑對(duì)宿主免疫系統(tǒng)遞送的健康益處是菌株特異性的。已經(jīng)顯示了誘導(dǎo)高水平的IL-10和/或體外誘導(dǎo)低水平的促炎細(xì)胞因子(PBMC測(cè)定法)的益生菌劑是強(qiáng)烈的體內(nèi)抗炎菌株(Foligne, B.等人,2007, World J. Gastroenterol. 13 236-243)。使用若干益生菌株以研究熱處理的益生菌劑的抗炎性質(zhì)。這些菌株為長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 3001、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、類干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、和大腸埃希氏菌Nissle。也測(cè)試了包括商業(yè)用于生產(chǎn) NestleLcl發(fā)酵產(chǎn)物的一些菌株在內(nèi)的若干起子培養(yǎng)物菌株嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、保加利亞乳桿菌NCC 15和乳酸乳球菌NCC 2287。在對(duì)每一菌株優(yōu)化的條件中在5-15L的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞。全部的典型細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基為可用的。此類培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。當(dāng)調(diào)整pH至5.5時(shí),連續(xù)地加入30%堿溶液(NaOH或Ca(OH)2)。當(dāng)足夠時(shí),通過用CO2充氣液面上空間維持厭氧的條件。在標(biāo)準(zhǔn)需氧條件下培養(yǎng)大腸埃希氏菌。通過離心(5000xg,4°C)收集細(xì)菌細(xì)胞并且重懸于足夠體積的磷酸緩沖鹽水 (PBS)中以達(dá)到約109-101(lCfu/ml的最終濃度。一部分制備物以15%甘油冷凍在-80°C。 通過以下方法熱處理另一部分細(xì)胞-超高溫度140°C達(dá)15秒;通過間接蒸汽注射。-高溫度短時(shí)間(HTST):通過間接蒸汽注射74°C、90°C和120°C達(dá)15秒。-在水浴中長(zhǎng)時(shí)間低溫度(85°C,20分鐘)熱處理后,在_80°C凍存樣品直到使用。細(xì)菌制備物的體外免疫譜分析評(píng)價(jià)活的和熱處理的細(xì)菌制備物的免疫譜(即從體外人血細(xì)胞誘導(dǎo)特定細(xì)胞因子分泌的能力)。從血液過濾器分離人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。在通過細(xì)胞密度梯度分離之后,收集并用Hank平衡鹽溶液洗滌兩次單核細(xì)胞。隨后在用10%胎牛血清(Bioconcept, Paris,法國)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/鏈霉素(Sigma)和0. I %慶大霉素補(bǔ)充的Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(MDM,Sigma)中重懸細(xì)胞。隨后在48孔板中用活的和熱處理的細(xì)菌(等同于7xl06cfu/孔)溫育PBMC(7xl05個(gè)細(xì)胞/孔)達(dá)36小時(shí)。在來自8個(gè)個(gè)體供體的PBMC上測(cè)試活的和熱處理的細(xì)菌的作用,所述個(gè)體供體被分為兩個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)。在溫育36小時(shí)之后,冷凍并在-20°C保存培養(yǎng)板直到細(xì)胞因子測(cè)量。對(duì)活細(xì)菌和它們熱處理的對(duì)應(yīng)物平行地實(shí)施(即,在同一實(shí)驗(yàn)中對(duì)同一批PBMC實(shí)施)細(xì)胞因子譜分析。在36小時(shí)溫育后依照制造者的說明書通過ELISA(R&D DuoSet Human IL-10、BD OptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNF a、BD OptEIA人IFN- Y )確定在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40、和 TNF-a 是促炎細(xì)胞因子,而IL-IO是強(qiáng)烈的抗炎介質(zhì)。用4個(gè)個(gè)體供體的平均值(pg/ml)+/-SEM表示結(jié)果,并且結(jié)果代表了兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn),每一個(gè)所述單獨(dú)實(shí)驗(yàn)用4個(gè)供體實(shí)施。對(duì)每一菌株計(jì)算IL-12p40/IL-10的比率作為體內(nèi)抗炎作用的預(yù)測(cè)值(FoIigne, B.,等人,2007,World J. Gastroenterol. 13 :236-243)。把對(duì)每一菌株通過ELISA(Mi)確定的許多細(xì)胞因子數(shù)值(pg/ml)轉(zhuǎn)移入 BioNumerics v5. 10 軟件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利時(shí))。在此數(shù)據(jù)集上實(shí)施主成分分析(PCA,量度技術(shù))。此分析包括從數(shù)值減去平均值和數(shù)值除以方差。結(jié)果通過超高溫度(UHT)/高溫度短時(shí)間(HTST)樣處理生成的抗炎譜研究中的益生菌株受到一系列熱處理(超高溫度(UHT)、高溫度短時(shí)間(HTST)和 85°C達(dá)20分鐘)并且把它們的免疫譜和活細(xì)胞的那些免疫譜體外作比較。當(dāng)與人PBMC — 起溫育時(shí)(圖1、2、3、4和5)活微生物(益生菌劑和/或乳品起子培養(yǎng)物)誘導(dǎo)了細(xì)胞因子產(chǎn)生的不同水平。這些微生物的熱處理以溫度依賴性的方式改變了由PBMC生產(chǎn)的細(xì)胞因子的水平?!岸虝r(shí)間高溫度”處理(120°C或140°C達(dá)15秒)生成了具有抗炎免疫譜的非復(fù)制型細(xì)菌(圖1、2、3和4)。實(shí)際上,在維持或誘導(dǎo)額外的IL-IO產(chǎn)生的同時(shí)(與活的對(duì)應(yīng)物對(duì)比),UHT-樣處理的菌株(140°C,15秒)誘導(dǎo)了更少的促炎細(xì)胞因子(TNF-a,IFN-Y, IL-12p40)。對(duì)于任何UHT-樣處理的菌株獲得的IL-12p40/IL_10比率與活細(xì)胞相比更低 (圖1、2、3和4)。對(duì)于由HTST-樣處理,即受到120。。達(dá)15秒(圖I、2、3和4)、或74°C和 90°C達(dá)15秒(圖5)處理的細(xì)菌此現(xiàn)象也是有效的。熱處理(UHT-樣或HTST-樣處理)在益生菌株體外免疫譜(圖1、2、3和5)和乳品起子培養(yǎng)物上(圖4)具有相似的效果。對(duì)用活的和熱處理的(140°C,15秒)益生菌劑和乳品起子菌株生成的PBMC數(shù)據(jù)的主成分分析揭示了活的菌株全部沿X軸分散,表明菌株表現(xiàn)了非常不同的體外免疫譜,為促炎細(xì)胞因子的從低(左側(cè))到高(右側(cè))的誘導(dǎo)物。熱處理的菌株聚集在圖表左側(cè),顯示了熱處理菌株更少誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(圖6)。與之相反,在85°C達(dá)20分鐘的熱處理的細(xì)菌比活細(xì)胞誘導(dǎo)較多的促炎細(xì)胞因子和較少的IL-10,導(dǎo)致更高的IL-12p40/IL-10比率(圖7)。由UHT-樣和HTST-樣處理增強(qiáng)或生成抗炎譜。無論它們各自初始的免疫譜(活細(xì)胞),UHT和HTST處理的菌株表現(xiàn)了抗炎譜。在 “短時(shí)間高溫度”處理以后,顯示了已知為體內(nèi)抗炎和體外表現(xiàn)抗炎譜的益生菌株(長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 3001、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950,乳雙歧桿菌NCC 2818)表現(xiàn)出增強(qiáng)的體外抗炎譜。如圖I中所示,UHT-樣處理的雙歧桿菌屬菌株的IL-12p40/IL-10比率比低于來自活的對(duì)應(yīng)物的那些比率,因此顯示了 UHT-樣處理的樣品的提高的抗炎譜。更突出地,對(duì)于非抗炎活菌株也確認(rèn)了由HUT-樣和HTST-樣處理生成抗炎譜。活鼠李糖乳桿菌 NCC 4007和類干酪乳桿菌NCC2461都表現(xiàn)了體外高IL_12p40/IL_10比率(圖2和5)。顯示了兩個(gè)活菌株對(duì)小鼠中TNBS-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎是非保護(hù)性的。在“短時(shí)間高溫度”處理以后 (UHT或HTST)由鼠李糖乳桿菌NCC 4007和類干酪乳桿菌NCC2461誘導(dǎo)的IL-12p40/IL_10比率劇烈下降,低至用雙歧桿菌屬菌株獲得的水平。這些低IL-12p40/IL-10比率由于與沒有變化(鼠李糖乳桿菌NCC4007)或IL-10分泌的劇烈誘導(dǎo)(類干酪乳桿菌NCC2461)(圖 2)相結(jié)合的低水平IL-12p40產(chǎn)生所致。因此-通過UHT-樣和HTST-樣熱處理能夠增強(qiáng)活微生物的抗炎譜(例如長(zhǎng)雙歧桿菌 NCC 2705、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 3001、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818)。-通過UHT-樣和HTST-樣熱處理能夠從非抗炎活微生物生成抗炎譜(例如鼠李糖乳桿菌NCC 4007、類干酪乳桿菌NCC2461、乳品起子嗜熱鏈球菌NCC 2019)。-對(duì)于從可商購的產(chǎn)品(圖3A&B)(包括益生大腸埃希氏菌菌株)分離的菌株也顯示了抗炎譜。對(duì)于全部測(cè)試的益生菌劑和乳品起子例如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和鏈球菌屬, UHT/HTST-樣處理的影響是相似的。對(duì)若干乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌施用UHT/HTST-樣處理表現(xiàn)了不同的體外免疫譜。在UHT/HTST-樣處理以后全部的菌株誘導(dǎo)了比它們活的對(duì)應(yīng)物較少的促炎細(xì)胞因子 (圖1、2、3、4、5和6),這展示了 UHT/HTST-樣處理在獲得的非復(fù)制型細(xì)菌的免疫性質(zhì)上的作用能夠概括到全部益生菌劑,特別地到乳桿菌屬和雙歧桿菌屬和特定的大腸埃希氏菌株以及到全部乳品起子培養(yǎng)物,特別地到鏈球菌屬、乳球菌屬和乳桿菌屬。實(shí)施例2:方法學(xué)細(xì)菌制備物使用5株益生菌株以研究非復(fù)制型益生菌劑的免疫加強(qiáng)性質(zhì)3株雙歧桿菌(長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950)和2株乳桿菌(類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007)。在37°C達(dá)16-18小時(shí)無pH控制下分批發(fā)酵在MRS上生長(zhǎng)細(xì)菌細(xì)胞。把細(xì)菌細(xì)胞離心下來(5,000xg,4°C )并在鹽水中稀釋以前重懸于磷酸緩沖鹽水中,以達(dá)到約IOElOcfu/ ml的最終濃度。在水浴中在85°C達(dá)20分鐘熱處理長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌 NCC2818、類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007。在水浴中在90°C達(dá)30分鐘熱處理短雙歧桿菌NCC2950。分裝熱處理的細(xì)菌懸液并凍存于_80°C直到使用。活細(xì)菌儲(chǔ)存在-80°C 15% PBS-甘油中直到使用。細(xì)菌制備物的體外免疫譜分析評(píng)價(jià)活的和熱處理的細(xì)菌制備物的免疫譜(即體外誘導(dǎo)人血細(xì)胞特定細(xì)胞因子分泌的能力)。從血液過濾器分離人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。在通過細(xì)胞密度梯度分離之后,收集并用Hank平衡鹽溶液洗滌兩次單核細(xì)胞。隨后在用10%胎牛血清(Bioconcept, Paris,法國)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/鏈霉素(Sigma)和O. I %慶大霉素補(bǔ)充的Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(MDM,Sigma)中重懸細(xì)胞。隨后在48孔板中用活的和熱處理的細(xì)菌(等同于7xl06cfu/孔)溫育PBMC(7xl05個(gè)細(xì)胞/孔)達(dá)36小時(shí)。在來自8個(gè)個(gè)體供體的PBMC上測(cè)試活的和熱處理的細(xì)菌的作用,所述個(gè)體供體被分為兩個(gè)分離的實(shí)驗(yàn)。在溫育36小時(shí)之后,冷凍并在-20°C保存培養(yǎng)板直到細(xì)胞因子測(cè)量。對(duì)活細(xì)菌和它們熱處理的對(duì)應(yīng)物平行地實(shí)施(即,在同一實(shí)驗(yàn)中對(duì)同一批PBMC實(shí)施)細(xì)胞因子譜分析。在36小時(shí)溫育后依照制造者的說明書通過ELISA(R&D DuoSet Human IL-10、BD OptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNF a、BD OptEIA人IFN- y )確定在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40、TNF-a 是促炎細(xì)胞因子,而IL-IO是強(qiáng)烈的抗炎介質(zhì)。用4個(gè)個(gè)體供體的平均值(pg/ml)+/-SEM表示結(jié)果,并且結(jié)果代表了兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn),每一個(gè)所述單獨(dú)實(shí)驗(yàn)用4個(gè)供體實(shí)施?;畹暮蜔崽幚淼亩屉p歧桿菌NCC2950在預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性腹瀉中的體內(nèi)作用使用變態(tài)反應(yīng)性腹瀉的小鼠模型以測(cè)試短雙歧桿菌NCC2950的Thl促進(jìn)作用 (Brandt E. B 等人.JCI 2003; 112 (II) :1666-1667)。在致敏(間隔 14 天;第 0 和第 14 天的卵清蛋白(OVA)和硫酸鋁鉀2次腹膜內(nèi)注射)之后用OVA 口服攻擊雄性Balb/c小鼠6 次(第27、29、32、34、36、39天)導(dǎo)致瞬時(shí)的臨床癥狀(腹瀉)和免疫參數(shù)的改變(總IgE、 OVA特異性的IgE、小鼠肥大細(xì)胞蛋白質(zhì)酶I即MMCP-I的血漿濃度)。通過管飼法在OVA致敏之前四天(第-3、-2、_1、0天和第11、12、13和14天)和在攻擊時(shí)期期間(第23至39 天)施用活的或在90°C達(dá)30分鐘熱處理的短雙歧桿菌NCC2950。使用約IO9菌落形成單位(cfu)或等同的cfu/小鼠的日細(xì)菌劑量。結(jié)果在熱處理以后‘促炎’細(xì)胞因子分泌的誘導(dǎo)體外評(píng)估熱處理的細(xì)菌菌株刺激人外周血單核細(xì)胞(PMBC)分泌細(xì)胞因子的能力。在相同的體外測(cè)定法中比較經(jīng)熱處理的細(xì)菌刺激PBMC與活細(xì)菌細(xì)胞誘導(dǎo)的基于4種細(xì)胞因子的免疫譜。鋪平板并評(píng)估熱處理的制備物無任何活細(xì)胞的計(jì)數(shù)。熱處理的細(xì)菌制備物在鋪平板后不產(chǎn)生菌落。當(dāng)與人PMBC—起溫育時(shí)活的益生菌劑誘導(dǎo)不同的和菌株依賴性水平的細(xì)胞因子產(chǎn)生(圖8)。與它們的活的對(duì)應(yīng)物相比,益生菌劑的熱處理改變了 PMBC產(chǎn)生的細(xì)胞因子的水平。熱處理的細(xì)菌比它們的活的對(duì)應(yīng)物誘導(dǎo)了更多的促炎細(xì)胞因子(TNF-a、IFN-Y和 IL-12p40)。相反,與活細(xì)胞對(duì)比,熱處理的細(xì)菌誘導(dǎo)了相似或較低量的IL-10 (圖8)。這些數(shù)據(jù)顯示了熱處理的細(xì)菌比它們的活的對(duì)應(yīng)物更能夠刺激免疫系統(tǒng)且因此更能夠加強(qiáng)弱化的免疫防御。換言之,體外數(shù)據(jù)說明了在熱處理之后細(xì)菌菌株的增強(qiáng)的免疫加強(qiáng)效果。為了說明熱處理的短雙歧桿菌NCC2950在免疫系統(tǒng)上的增強(qiáng)的作用(與活細(xì)胞相比),在變態(tài)反應(yīng)性腹瀉的動(dòng)物模型中測(cè)試活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950 (菌株A)。與陽性對(duì)照組相比,在用熱處理的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉的強(qiáng)度顯著地和持續(xù)地下降(41. 1% ±4. 8)而在用活的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉的強(qiáng)度僅降低了 20±28. 3%。這些結(jié)果顯示了熱處理的短雙歧桿菌NCC2950表現(xiàn)了比它的活的對(duì)應(yīng)物增強(qiáng)的對(duì)變態(tài)反應(yīng)性腹瀉的保護(hù)作用(圖9)因此,顯示了在熱處理以后益生菌劑增強(qiáng)免疫防御的能力被提高了。額外的實(shí)施例可以制備以下成長(zhǎng)乳組合物
      權(quán)利要求
      1.成長(zhǎng)乳組合物,其包含待施用于從10個(gè)月年齡起的嬰兒或幼兒的益生微生物。
      2.根據(jù)權(quán)利要求I的組合物,其具有在70-80kcal/100ml范圍內(nèi)的熱密度,并且包含 2-3g/100kcal的量的蛋白質(zhì)源,12-15g/100kcal的量的糖源,和3-4. 6g/100kcal的量的脂類源。
      3.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物,其包含O.15-0. 25gLC-PUFA/100g脂肪酸,其中 LC-PUFA可選自ARA、DHA或它們的組合。
      4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物,其包含I.5-2. 5mg核苷酸每IOOmL配方乳。
      5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物,其中益生微生物包含非復(fù)制型益生微生物。
      6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物,其包含對(duì)應(yīng)于約IO6到IO12Cfu的益生微生物。
      7.根據(jù)權(quán)利要求5-6之一的組合物,其中非復(fù)制型益生微生物是通過熱處理成為非復(fù)制型的,優(yōu)選地通過在至少71. 5°C實(shí)施至少I秒的高溫度處理。
      8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物,其中熱處理為在約71.5-150°C實(shí)施約1-120秒的高溫度處理,并且優(yōu)選地為高溫度/短時(shí)間(HTST)處理或超高溫度(UHT)處理。
      9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物,用于炎性疾病的預(yù)防或治療。
      10.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物,其中在約70-150°C溫度范圍內(nèi)約3分鐘-2小時(shí)實(shí)施熱處理,優(yōu)選地在80-140°C范圍內(nèi)從5分鐘-40分鐘實(shí)施熱處理。
      11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物,用于預(yù)防或治療與受損的免疫防御相關(guān)的疾病。
      12.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物,其中至少90%,優(yōu)選地至少95%,更優(yōu)選地至少 98%,最優(yōu)選地至少99%,理想地至少99. 9%,最理想地全部益生菌劑為非復(fù)制型的。
      13.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物,其中益生微生物選自雙歧桿菌屬 (bifidobacteria)、乳桿菌屬(Iactobacilli)、丙酸桿菌屬(propionibacteria),或它們的組合,例如長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、類干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、約漢遜氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus PI ant arum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、雙乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)和/或它們的混合物。
      14.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物,其中益生微生物選自長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001、長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、約漢遜氏乳桿菌LaU 類干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、路氏乳桿菌DSM17983、路氏乳桿菌 ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)、大腸埃希氏菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC 15、乳酸乳球菌NCC 2287,或它們的組合。
      15.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的組合物,其每天劑量含有約0. 005mg-1000mg非復(fù)制型微生物。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及嬰兒和幼兒的營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域。特別地,本發(fā)明涉及包含待施用于大于10個(gè)月年齡的嬰兒和幼兒的益生微生物的成長(zhǎng)乳。這些益生微生物可為非復(fù)制型益生微生物,例如生物活性的經(jīng)熱處理的益生微生物。
      文檔編號(hào)A23C9/152GK102595916SQ201080020814
      公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
      發(fā)明者A·梅賽尼爾, G·普里烏特, S·努特恩 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司
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