專利名稱：制備經(jīng)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體的方法
制備經(jīng)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體的方法本發(fā)明涉及制備經(jīng)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體的方法，其中將含聚氨酯脲的溶液施加到細(xì)胞載體上并且干燥。本發(fā)明進(jìn)一步涉及能通過該方法得到的細(xì)胞培養(yǎng)載體和其用于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，特別是用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的用途。間充質(zhì)干細(xì)胞能夠繁殖或分化成不同的細(xì)胞類型例如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞(A. I. Caplan 和 J. E. Dennis, J. Cell Biochem. 98，2006，1076-1084)。 間充質(zhì)干細(xì)胞的多能性與從成人捐贈者的容易分離性結(jié)合使得這些干細(xì)胞成為用于組織工程的細(xì)胞的理想來源(D. P. Lennon 和 A. I. Caplan, Exp. Hematol. 34，2006， 1604-1605)。這些應(yīng)用的例子是軟骨或骨的再生，或者用于治療中風(fēng)或心肌梗塞的治療措施(A. I. Caplan 和 J. E. Dennis, J. Cell Biochem. 98，2006，1076-1084)。由于這些間充質(zhì)干細(xì)胞在人骨髓中的低濃度，因此必須在臨床應(yīng)用前體外培養(yǎng)和繁殖這些干細(xì)胞 (A. I. CaplanfPJ. E. Dennis, J. Cell Biochem. 98，2006， 1076-1084 ；D. L. Jones 和 A. J. Wagers, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9，2008，11-21)。然而在該情形下，迄今非常頻繁地出現(xiàn)分化潛能的損失并且因此頻繁出現(xiàn)減少的治療效果(S. J. Morrison和 A. C. Spradling, Cell 132，2008，598-611)。在相對長期的培養(yǎng)期間，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)常表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的性能并且因此已經(jīng)損失了分化潛能(Banfi等人，Exp Hematol 28， 2000，707 ;Baxter 等人，Stem Cells 22，2004 675 ;Wagner 等人，PLoS ONE 3，2008， e2218)。十分通常地希望一些策略以能夠體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。所述培養(yǎng)應(yīng)在無細(xì)胞過早分化并且因此不會損失干細(xì)胞的潛能情況下進(jìn)行。實現(xiàn)該目的的已確立的方法是使用細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)。該方法描述于例如出版物 X.-D. Chen 等人，Journal of Bone and Mineral Research 22 (12)， 2007, 1943-1956,禾口 Τ· Matsubara 等人,Biochemical and Biophysical Research Communications 313 (2004), 503-508中。這里使用的蛋白質(zhì)混合物施加到由塑料制成的細(xì)胞培養(yǎng)載體上。在經(jīng)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體上，可以以與未涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體相比更低的分化潛能損失而繁殖間充質(zhì)干細(xì)胞。在現(xiàn)有技術(shù)中還通過有目的地加入生物因子實現(xiàn)干細(xì)胞繁殖同時防止這些干細(xì)胞過早分化。例如，Ansellem 等人，Nature Medicine 9 (11)，2003，1423 描述了使用調(diào)節(jié)劑例如“聲波刺猬(sonic hedgehog)”或Wnt蛋白質(zhì)用于防止干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中分化。專利申請 WO 2006/006171 和 WO 2006/030442 以及出版物 PNAS 103 (2006), 11707 描述了類似的構(gòu)思。上述構(gòu)思需要另外的材料作為調(diào)節(jié)劑或作為表面層。然而，這些材料難以分離，因為它們是天然蛋白質(zhì)。因此，希望還能夠在同時防止分化的情況下繁殖的替代性策略。用于組織工程操作領(lǐng)域的相對新的措施是特殊設(shè)計細(xì)胞培養(yǎng)載體本身用于干細(xì)胞現(xiàn)場分化(S. Neuss 等人，Biomaterials 29，2008，302-313)。Neuss 等人研究了用于該目的的不同天然或人造聚合物庫，其中這里不使用蛋白質(zhì)用于輔助干細(xì)胞培養(yǎng)。在J. M. Curran 等人，Biomaterials 27，2006，4783-4793 中，描述了基材的表面質(zhì)量可能影響間充質(zhì)干細(xì)胞分化的原理?？梢哉f明在改性的玻璃表面，不同的表面改性不同地影響了間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。含氨基和硫醇基的玻璃表面促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞分化，而對照玻璃和甲基改性的玻璃保持表型。然而，通過化學(xué)試劑改性玻璃表面的過程復(fù)雜。此外，盡管如此，但當(dāng)加入誘導(dǎo)劑時在改性表面出現(xiàn)細(xì)胞過早分化。用于醫(yī)學(xué)技術(shù)應(yīng)用和用于組織工程的感興趣的聚合物類型是聚氨酯類型。這些具有改變結(jié)構(gòu)和因此調(diào)節(jié)一定的性能的大的潛能。在組織工程中通常使用聚氨酯作為干細(xì)胞的基質(zhì)。其的例子描述于多個出版物中。H. L. Pritchard等人，Biomaterials 28 (2007)，936 - 946描述了來自脂肪細(xì)胞的干細(xì)胞在各種基材，尤其是還在聚氨酯上的定殖研究。在使用的聚氨酯Pellethan 的情形下，純的材料上的定殖密度非常差(<1096)。只有進(jìn)一步的措施例如用粘連蛋白覆蓋和等離子體活化得到足夠的定殖密度。然而，這些措施意味著另外的工作步驟和成本。C. Alperin等人，Biomaterials 26 (2005), 7377-7386 描述了通過用來自小鼠的胚胎干細(xì)胞定殖在聚氨酯上培養(yǎng)心肌細(xì)胞。干細(xì)胞在9天內(nèi)有針對性地分化形成心肌細(xì)胞。與此不同，防止干細(xì)胞分化不是該出版物的主題。Ni印onice 等人，Biomaterials 29 (2008)，825-833 描述了來自肌肉的干細(xì)胞定殖在可生物降解的聚氨酯上用于制備心血管應(yīng)用的移植物。不需要另外的添加劑在純的聚氨酯上進(jìn)行定殖。使用所述方法，細(xì)胞可以在載體上培養(yǎng)7天，沒有過早分化。然而，需要使用復(fù)雜的真空定殖技術(shù)以獲得足夠的定殖密度。在現(xiàn)有技術(shù)中，可以簡單進(jìn)行的用于制備可以容易地以足夠的干細(xì)胞高密度定殖的經(jīng)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體，使得干細(xì)胞可以快速繁殖并且防止在其繁殖期間干細(xì)胞過早分化的方法是未知的。因此，本發(fā)明的目的是提供在開頭所述類型的方法，通過該方法可以獲得同樣符合上述要求的細(xì)胞培養(yǎng)載體。根據(jù)本發(fā)明通過如下方式實現(xiàn)了該目的，其中通過使至少一種聚碳酸酯多元醇組分、至少一種多異氰酸酯組分和至少一種二胺組分反應(yīng)制備含于溶液中的聚氨酯脲。通過根據(jù)本發(fā)明的方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)載體可以快速并且簡單地，即特別是不需要使用復(fù)雜技術(shù)，以足夠的干細(xì)胞密度定殖。在干細(xì)胞隨后在細(xì)胞培養(yǎng)載體上快速繁殖期間，不會出現(xiàn)干細(xì)胞過早的不合意的分化。該效果僅通過聚氨酯涂料實現(xiàn)，即不需要在細(xì)胞培養(yǎng)載體的涂料中另外使用蛋白質(zhì)或者另外的天然物質(zhì)。繁殖在細(xì)胞培養(yǎng)載體上的干細(xì)胞在從載體上取下后仍然表現(xiàn)出必要的分化潛能并且可以適宜地用于例如組織工程。在本發(fā)明的上下文中，聚氨酯脲特別為具有以下的聚合化合物
(a)至少兩個具有以下通式結(jié)構(gòu)的含氨基甲酸酯基團(tuán)的重復(fù)單元
(b)至少一個含脲基的重復(fù)單元
權(quán)利要求
1.制備經(jīng)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體的方法，其中將含聚氨酯脲的溶液施加到細(xì)胞載體上并且干燥，特征在于所述聚氨酯脲通過使至少一種聚碳酸酯多元醇組分、至少一種多異氰酸酯組分和至少一種二胺組分反應(yīng)而制備。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，特征在于所述二胺組分具有至少一個羥基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，特征在于聚碳酸酯多元醇組分具有1.7 — 2. 3，優(yōu)選 1.8-2. 2，并且特別優(yōu)選1. 9 一 2. 1的數(shù)均羥基官能度。
4.如權(quán)利要求1一 3任一項所述的方法，特征在于所述聚碳酸酯多元醇組分具有 400 - 6000 g/mol，優(yōu)選 500 一 5000 g/mol，特別為 600 — 3000 g/mol 的數(shù)均分子量。
5.如權(quán)利要求1一 4任一項所述的方法，特征在于所述聚氨酯脲具有1000 - 200 000 g/mol，優(yōu)選5000 — 100 000 g/mol的數(shù)均分子量。
6.如權(quán)利要求1一 5任一項所述的方法，特征在于在所述聚氨酯脲的制備中另外使多元醇組分一起反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，特征在于基于Imol聚碳酸酯組分，使0.05 - 2. 0 mol, 優(yōu)選0. 05-1.5 mol，并且特別優(yōu)選0. 1 — 1. 0 mol的多元醇組分反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，特征在于所述多元醇組分具有62— 500 g/mol，優(yōu)選 62 - 400 g/mol，并且特別優(yōu)選62 — 200 g/mol的數(shù)均分子量。
9.如權(quán)利要求1一 8任一項所述的方法，特征在于在所述聚氨酯脲組分的制備中，基于 Imol聚碳酸酯組分，使0. 1 — 3. 0 mol，優(yōu)選0. 2 — 2. 8 mol并且特別優(yōu)選0. 3 — 2. 5 mol 的二胺組分反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求1一 9任一項所述的方法，特征在于在所述聚氨酯脲組分的制備中，基于Imol聚碳酸酯組分，使1. 0 — 5. 0 mol，優(yōu)選1. 0 — 4. 5 mol并且特別優(yōu)選1. 0 — 4. 0 mol的多異氰酸酯組分反應(yīng)。
11.如權(quán)利要求1一 10任一項所述的方法，特征在于所述溶液另外包含蛋白質(zhì)，特別是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。
12.能通過根據(jù)權(quán)利要求1一 11任一項的方法得到的經(jīng)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體。
13.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞培養(yǎng)載體用于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，特別是用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備經(jīng)涂覆的細(xì)胞培養(yǎng)載體的方法，其中將含聚氨酯脲的溶液施加到細(xì)胞載體上并且干燥。聚氨酯脲預(yù)先通過使至少一種聚碳酸酯多元醇組分、至少一種多異氰酸酯組分，和至少一種二氨基組分反應(yīng)而制備。本發(fā)明進(jìn)一步涉及能根據(jù)該方法得到的細(xì)胞培養(yǎng)載體和其用于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，特別是用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的用途。
文檔編號C12N5/00GK102449138SQ201080023070
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者維爾納 C., 克歇爾 J., 賽布 P., 克洛澤 T., 蓬佩 T. 申請人:拜爾材料科學(xué)股份公司