專利名稱：源自低等光合真核生物的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的基因修飾，特別是所關(guān)注多肽至植物質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所述質(zhì)體包含其自身的基因組。然而，許多質(zhì)體基因在進(jìn)化過(guò)程中被轉(zhuǎn)移至核基因組中。因此，形成了核編碼的質(zhì)體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)回該質(zhì)體的機(jī)制。在這種方式下，這些核編碼的質(zhì)體基因的蛋白產(chǎn)物在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)后被轉(zhuǎn)移回該質(zhì)體中。這些蛋白通過(guò)運(yùn)用定位于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白N-末端的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列而得以轉(zhuǎn)運(yùn)。這些肽能夠介導(dǎo)蛋白至質(zhì)體上，其后往往由特定的蛋白酶水解去除。細(xì)胞生物學(xué)的根本問(wèn)題是，由細(xì)胞質(zhì)核糖體合成的蛋白質(zhì)向其相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)定位的精確和高效的靶向作用。對(duì)于轉(zhuǎn)基因高等植物而言，這是特別真實(shí)的，其轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物需要在合適的細(xì)胞器或隔室內(nèi)產(chǎn)生。本發(fā)明提供了一種質(zhì)體靶向肽，它能夠有效地將外源性多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至轉(zhuǎn)基因高等植物的葉綠體中。發(fā)明概述本發(fā)明提供了葉綠體靶向肽的組成和方法。組成包括轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽(即質(zhì)體靶向肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽)及其變體的核苷酸序列。組成還包括由核苷酸序列所組成的DNA構(gòu)建體，該核苷酸序列可編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽，后者能夠有效地連接至編碼所關(guān)注多肽的核苷酸序列上。這些DNA構(gòu)建體證實(shí)了在外源多肽向質(zhì)體表達(dá)和定位方面的用途。組成還包括表達(dá)盒、載體、轉(zhuǎn)化植株、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物種子，其中所關(guān)注多肽經(jīng)本發(fā)明的質(zhì)體靶向肽被定位至葉綠體上。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明低等光合真核生物包括綠藻門(綠藻類，如衣藻和杜氏藻)、紅藻門(紅藻)、灰色藻門(如藍(lán)載藻)、裸藻門(如眼蟲(chóng))、褐藻門、不等鞭毛類、定鞭藻類、隱藻門和甲藻門的主要譜系。低等光合真核生物中不包括藍(lán)藻門。然而，細(xì)菌域的藍(lán)藻門(藍(lán)細(xì)菌，如聚球藻和集胞藻)具有光合作用的機(jī)制。因此，本文納入了這些光合細(xì)菌作為基本的光合機(jī)制來(lái)源。低等光合真核生物的特點(diǎn)是含有光合作用的細(xì)胞器，該細(xì)胞器是從藍(lán)細(xì)菌衍生發(fā)展而來(lái)的。環(huán)繞光合作用細(xì)胞器的膜的數(shù)目在低等光合真核生物的成員中各有不同。光合作用的細(xì)胞器可以是一級(jí)質(zhì)體或二級(jí)(或三級(jí))質(zhì)體。一級(jí)質(zhì)體或單一質(zhì)體，可在綠藻門、紅藻門和灰色藻門中發(fā)現(xiàn)，且經(jīng)鑒定具有雙層結(jié)合膜。這些包含一級(jí)質(zhì)體的生物被認(rèn)為是藍(lán)細(xì)菌原始內(nèi)共生伙伴關(guān)系的唯一后裔 (Harper和Keeling,分子生物學(xué)與進(jìn)化20 (10) 1730-1735 (2003)。含有有機(jī)體的一級(jí)質(zhì)體已被歸納為單一的超群，被稱為原始色素體生物(Maruyama等，BMC進(jìn)化生物學(xué)8 : 151(2008))。
二級(jí)(和三級(jí))或復(fù)合質(zhì)體是由三或四層膜圍繞的，它們被認(rèn)為是由二級(jí)內(nèi)共生所派生的，其中由生物體吞噬了藻類而生成。二級(jí)和三級(jí)質(zhì)體的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，這些質(zhì)體是由幾起不同的內(nèi)共生事件而衍生的，這幾起事件發(fā)生在進(jìn)化期間(Bhattacharya和 Medlin，植物生理學(xué)116 :9_15(1998))。裸藻和甲藻是有二級(jí)或復(fù)合質(zhì)體的生物體的實(shí)例。 參見(jiàn)Bhattacharya和Medlin的綜述，植物生理學(xué)116 :9_15(1998)。裸藻和褐藻有綠藻的二級(jí)質(zhì)體，而不等鞭毛類、定鞭藻類、隱藻和甲藻則全部擁有紅藻的二級(jí)內(nèi)共生體(Harper 和 Keeling,分子生物學(xué)與進(jìn)化 20 (10) :1730_1735 (2003))。本發(fā)明的質(zhì)體靶向肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽能夠有效地介導(dǎo)連接多肽向質(zhì)體的靶向、定位或轉(zhuǎn)運(yùn)。質(zhì)體是在植物和藻類中存在的細(xì)胞器。質(zhì)體負(fù)責(zé)進(jìn)行光合作用、儲(chǔ)存諸如淀粉類產(chǎn)物， 并負(fù)責(zé)完成諸如脂肪酸、萜類等許多種分子的合成及細(xì)胞構(gòu)成模塊所需的其他分子的合成。質(zhì)體依據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)的作用而具有分化或再分化成幾種形式的能力。未分化的前質(zhì)體有可能發(fā)育成以下任何質(zhì)體，包括葉綠體、色質(zhì)體、白色體、淀粉形成體、耳石、油質(zhì)體和蛋白質(zhì)體。“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽”或“質(zhì)體運(yùn)輸肽”或“質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽”或“轉(zhuǎn)運(yùn)肽”是必要的，也是足以促進(jìn)蛋白質(zhì)輸入其原生宿主細(xì)胞的。這種質(zhì)體可以是一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)質(zhì)體。質(zhì)體可能就是葉綠體。轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位于輸入質(zhì)體的蛋白質(zhì)的N末端。轉(zhuǎn)運(yùn)肽能夠有效促進(jìn)使多肽連接至質(zhì)體內(nèi)的共翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)。這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽一般含有40至100個(gè)氨基酸。研究表明，轉(zhuǎn)運(yùn)肽包含共同的特點(diǎn)。這些特點(diǎn)包括它們幾乎沒(méi)有帶負(fù)電荷的氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸、 天門酰胺或谷氨酰胺；其N-末端區(qū)域?yàn)闆](méi)有帶電荷的氨基酸，也沒(méi)有諸如甘氨酸或脯氨酸之類的氨基酸；它們的中央?yún)^(qū)域包含非常高比例的堿性或羥基氨基酸，如絲氨酸或蘇氨酸； 并且其C-末端區(qū)域富含精氨酸，且具有形成兼性折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力。輸入后，可通過(guò)質(zhì)體內(nèi)的特異性蛋白酶將轉(zhuǎn)運(yùn)肽有效地從連接多肽上剪切去除。根據(jù)一本有權(quán)威性的著作(Cline和Henry，細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)年鑒12 1-26 (1996 年))，高等植物的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽共同享有以下幾個(gè)特點(diǎn)(1)它們表面上具有線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的類似特征，即它們富含羥化殘基且缺少酸性殘基；(2)它們具有30-120殘基的長(zhǎng)度； (3)其N-末端10-15氨基酸缺乏甘氨酸、脯氨酸和帶電荷的殘基；(4)可變的中央?yún)^(qū)域富含絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和精氨酸；(5)其C-末端區(qū)域包含進(jìn)行蛋白水解加工的松散保守序列(Ile/Val-X-Ala/CyS*Ala) ； (6)沒(méi)有延伸序列保守性或保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)基元，以及(7) 它們從理論上說(shuō)主要采用無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象。存在著幾種計(jì)算方法，其使用了上述功能以預(yù)測(cè)高等植物的葉綠體前導(dǎo)序列。計(jì)算工具包括 PSORT (Nakai 和 Kanehisa，蛋白質(zhì) 11 (2) :95_110 (1991 年)；Horton 等，第四屆亞太生物信息學(xué)大會(huì)APBC06(臺(tái)北，臺(tái)灣)的會(huì)議錄39-48頁(yè)(2006年)；http:// www. psort. org)、ChloroP (Emanuelsson 等，分子生物學(xué)雜志 300 1005-1016 (1999 年)； http//www. cbs. dtu. dk/services/ChloroP/)或 TargetP(Nielsen 等，蛋白質(zhì)工程 10 1-6 (1997 年)；Emanuelsson 等，分子生物學(xué)雜志 300 :1005-1016 (2000 年);http://www. cbs. dtu. dk/services/TargetP/)。與高等植物相反，比較諸如萊氏衣藻這樣的生物體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽形成了以下特性(1) 它們具有短的、不帶電荷的N-末端區(qū)域；(2)它們的中央?yún)^(qū)域富含精氨酸、丙氨酸、纈氨酸和絲氨酸，因而具有形成兼性α-螺旋的較高傾向，以及(3)它們具有可能形成兼性β-片層結(jié)構(gòu)的 C-末端區(qū)域(Franzen 等，F(xiàn)EBS 通訊 260 (2) 165-168 (1990 年))。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從低等光合真核生物中得到的，其能夠有效地連接至外源蛋白上并在轉(zhuǎn)基因高等植物中進(jìn)行表達(dá)，它能夠?qū)⒃撏庠吹鞍锥ㄎ恢寥~綠體上。低等光合真核生物是從類群中選擇得到的，該類群包括綠藻門(綠藻類，如衣藻和杜氏藻)、紅藻門(紅藻類)、灰色藻門(如藍(lán)載藻)、裸藻門(如眼蟲(chóng))、褐藻門、不等鞭毛類、定鞭藻類、隱藻門和甲藻門。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從衣藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從萊氏衣藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從杜氏藻中得到的。 在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從杜氏鹽藻中得到的。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種將外源蛋白定位至轉(zhuǎn)基因高等植物的葉綠體上的方法，其中由幾個(gè)步驟組成，即有效地將轉(zhuǎn)運(yùn)肽從低等光合真核生物連接至外源蛋白上，從而產(chǎn)生含有外源蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，其中外源蛋白可在轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體中檢測(cè)得到。 轉(zhuǎn)基因植物可能是一種高等轉(zhuǎn)基因植物。低等光合真核生物是從類群中選擇得到的，該類群包括綠藻門(綠藻類，如衣藻和杜氏藻)、紅藻門(紅藻類)、灰色藻門(如藍(lán)載藻)、裸藻門(如眼蟲(chóng))、褐藻門、不等鞭毛類、定鞭藻類、隱藻門和甲藻門。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從衣藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從萊氏衣藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從杜氏藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從杜氏鹽藻中得到的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從低等光合原核生物中得到的，其能夠有效地連接至外源蛋白上并在轉(zhuǎn)基因高等植物中進(jìn)行表達(dá)，它能夠?qū)⒃撏庠吹鞍锥ㄎ恢寥~綠體上。低等光合原核生物是從藍(lán)藻(前身為“藍(lán)綠藻”之稱的藍(lán)綠細(xì)菌)所組成的類群中選擇得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從聚球藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從聚球藻屬PCC 7002中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從集胞藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從集胞藻屬PCC 6803中得到的。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是一種將外源蛋白定位至轉(zhuǎn)基因高等植物的葉綠體上的方法，其中由幾個(gè)步驟組成，即有效地將轉(zhuǎn)運(yùn)肽從低等光合原核生物連接至外源蛋白上，從而產(chǎn)生含有外源蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，其中外源蛋白可在轉(zhuǎn)基因植物的葉綠體中檢測(cè)得到。 轉(zhuǎn)基因植物可能是一種高等轉(zhuǎn)基因植物。低等光合原核生物是從藍(lán)藻(前身為“藍(lán)綠藻”之稱的藍(lán)綠細(xì)菌)所組成的類群中選擇得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從聚球藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從聚球藻屬PCC 7002中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從集胞藻中得到的。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從集胞藻屬PCC 6803中得到的。這些組成包括編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽及其變體的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽包括 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所述的氨基酸序列或片段及其變體，以及SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17和19所述的核苷酸序列或片段及其變體。組成還包括由核苷酸序列所組成的DNA構(gòu)建體，該核苷酸序列可編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽，后者能夠有效地連接至編碼外源多肽的核苷酸序列上。這些DNA構(gòu)建體證實(shí)了在外源多肽向質(zhì)體表達(dá)和定位方面的用途。組成還包括表達(dá)盒、載體、轉(zhuǎn)化植株、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物種子，其中外源多肽經(jīng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)肽被定位至葉綠體上。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從低等光合真核生物中得到的，其能夠有效地連接至外源蛋白上并在轉(zhuǎn)基因高等植物中進(jìn)行表達(dá)，它能夠?qū)⒃撏庠吹鞍锥ㄎ恢寥~綠體上。轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)自編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其能夠被定位至有光合作用的細(xì)胞器上。轉(zhuǎn)運(yùn)肽已證實(shí)位于在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)編碼、但翻譯后定位于宿主細(xì)胞光合細(xì)胞器的基因上，并可從以下類群選擇得到，包括鐵氧還蛋白-NADP+-氧化還原酶、核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶、5烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶、乙酰乳酸合成酶、葉綠體核糖體蛋白 CS17、CS蛋白、鐵氧還蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、二磷酸核酮糖羧化酶激活酶、色氨酸合成酶、酰基載體蛋白、質(zhì)體監(jiān)控蛋白-60、細(xì)胞色素C552、22-kDa熱休克蛋白、33-kDa氧進(jìn)化增強(qiáng)子蛋白 1、ATP合酶γ亞基(ATP酶Υ)、ΑΤΡ合酶ω亞基、葉綠素-a/b_結(jié)合蛋白11_1、氧進(jìn)化增強(qiáng)子蛋白2、氧進(jìn)化增強(qiáng)子蛋白3、光系統(tǒng)I P21、光系統(tǒng)I P28、光系統(tǒng)I P30、光系統(tǒng)I P35、 光系統(tǒng)I P37、甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、CAB2蛋白、羥甲基膽色烷合酶，丙酮酸磷酸鹽二激酶、CAB3蛋白、質(zhì)體鐵蛋白、鐵蛋白、早期光誘導(dǎo)蛋白，谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶、原葉綠素酸酯還原酶、淀粉粒結(jié)合淀粉合成酶、光系統(tǒng)Π捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白、主要花粉變應(yīng)原Lol ρ 5a、質(zhì)體ClpB ATP依賴性蛋白酶、超氧化物歧化酶、鐵氧還蛋白 NADP氧化還原酶、28-kDa核糖核蛋白、31_kDa核糖核蛋白、33_kDa核糖核蛋白、乙酰乳酸合成酶、ATP合酶CFO亞基1、2、3或4 ；細(xì)胞色素f、細(xì)胞色素c、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺合成酶2、碳酸酐酶、GapA蛋白、熱休克蛋白hsp 21、磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、 質(zhì)體CIpA ATP依賴性蛋白酶、質(zhì)體核糖體蛋白CL24、質(zhì)體核糖體蛋白CL9、質(zhì)體核糖體蛋白 PsCL18、質(zhì)體核糖體蛋白PsCL25、DAHP合成酶、淀粉磷酸化酶、根?；d體蛋白11、甜菜醛脫氫酶、GapB蛋白、谷氨酰胺合成酶2、磷酸核酮糖激酶、亞硝酸鹽還原酶、核糖體蛋白L12、 核糖體蛋白L13、核糖體蛋白L21、核糖體蛋白L35、核糖體蛋白L40、丙糖磷酸-3-磷酸甘油酸磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵氧還蛋白依賴性谷氨酸合酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、NADP依賴性蘋果酸酶和NADP蘋果酸脫氫酶。表1列出了額外的含有質(zhì)體靶向序列的核編碼基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從萊氏衣藻中得到的，特別是從萊氏衣藻光系統(tǒng)I P28中得到的，并構(gòu)成了 SEQ ID NO :2中所述的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從萊氏衣藻中得到的，特別是從萊氏衣藻光系統(tǒng)I P30中得到的，并構(gòu)成了 SEQ ID N0:4中所述的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從萊氏衣藻中得到的，特別是從萊氏衣藻光系統(tǒng)I P35中得到的，并構(gòu)成了 SEQ ID NO :6中所述的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從萊氏衣藻(中得到的，特別是從萊氏衣藻光系統(tǒng)I P37中得到的， 并構(gòu)成了 SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從萊氏衣藻中得到的，特別是從萊氏衣藻ssRubisco中得到的，并構(gòu)成了 SEQ ID NO 10中所述的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從萊氏衣藻中得到的，特別是從萊氏衣藻 Y-ATP酶中得到的，并構(gòu)成了 SEQ ID NO :12中所述的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從藍(lán)細(xì)菌中得到的，特別是從聚球藻屬PCC 7002細(xì)胞色素c550中得到的，并包含 SEQ ID NO: 14中所述的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從藍(lán)細(xì)菌中得到的，特別是從聚球藻屬PCC 6803細(xì)胞色素c553中得到的，并包含SEQ ID NO 16中所述的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從藍(lán)細(xì)菌中得到的，特別是從聚球藻屬PCC 6803 psaF 中得到的，并包含SEQ ID NO: 18中所述的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽是從杜氏衣藻中得到的，特別是從杜氏鹽藻EPSPS中得到的，并構(gòu)成了 SEQ ID NO :20中所述的氨基酸序列。 表1 編碼定位至質(zhì)體的蛋白的核編碼基因。參考文獻(xiàn)以其整體通過(guò)引用而成為本文中的部分。
權(quán)利要求
1.一種植物，其基因組中已穩(wěn)定地整合入了一種DNA構(gòu)建體，所述組成編碼質(zhì)體靶向肽的核苷酸序列的構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列能夠有效連接至編碼所關(guān)注多肽的核苷酸序列上，其中所述編碼質(zhì)體靶向肽的核苷酸序列是從以下類群中篩選得到的，包括a)一種 SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17 和 19 所述的核苷酸序列；b)一種至少與SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19有90%同源序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠編碼具有運(yùn)輸有效連接的多肽至質(zhì)體上的能力的肽；c)一種編碼SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所述的氨基酸序列的核苷酸序列；以及d)一種編碼至少與SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20有90%同源序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列能夠運(yùn)輸有效連接的多肽至質(zhì)體上。
2.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物是單子葉植物。
3.權(quán)利要求2的植物，其中所述單子葉植物為玉米、水稻或甘蔗植物。
4.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
5.權(quán)利要求4的植物，其中所述雙子葉植物是大豆植物。
6.一種在植物中表達(dá)所關(guān)注多肽的方法，所述方法包括向所述植物中導(dǎo)入DNA構(gòu)建體，包括編碼質(zhì)體靶向肽的核苷酸序列，其中所述質(zhì)體靶向肽的核苷酸序列能夠有效連接至編碼上述所關(guān)注多肽的核苷酸序列上，所述編碼質(zhì)體靶向肽的核苷酸序列是從以下類群中篩選得到的，包括a)一種 SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17 和 19 所述的核苷酸序列;b)一種至少與SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19有90%同源序列的核苷酸序列，其中上述核苷酸序列能夠編碼具有運(yùn)輸有效連接的多肽至質(zhì)體上的能力的肽；c)一種編碼SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所述的氨基酸序列的核苷酸序列；以及d)一種編碼至少與SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20有90%同源序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列能夠運(yùn)輸有效連接的多肽至質(zhì)體上。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述植物是單子葉植物。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述感興趣的多肽是生物加工酶。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述編碼所述感興趣多肽的核苷酸序列為一種抗除草劑基因。
11.大幅純化的能夠?qū)⒍嚯倪\(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)的肽，其中所述肽包括SEQID N0S:1、3、 5、7、9、11、13、15、17和19的類群中所述的氨基酸序列及其變體，其中所述變體保留著對(duì)多肽的運(yùn)輸能力。
12.權(quán)利要求11的肽，其中所述肽能夠有效連接至所關(guān)注的多肽上。
13.—種編碼權(quán)利要求11-12任意之一的肽的核苷酸序列。
14.一種與權(quán)利要求13的核苷酸序列有90%同源性的核苷酸序列。
15.一種包括權(quán)利要求13或14的核苷酸序列的DNA構(gòu)建體。
16.一種植物細(xì)胞，其基因組中已穩(wěn)定地整合入了一種DNA構(gòu)建體，所述組成編碼質(zhì)體靶向肽的核苷酸序列的構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列能夠有效連接至編碼所關(guān)注多肽的核苷酸序列上，其中所述編碼質(zhì)體靶向肽的核苷酸序列是從以下類群中篩選得到的，包括a)一種 SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18 和 20 所述的核苷酸序列；b)一種至少與SEQ ID NOS :1、3、5、7、9、11、13、15、17和19有90%同源序列的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠編碼具有運(yùn)輸有效連接的多肽至質(zhì)體上的能力的肽；c)一種編碼SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所述的氨基酸序列的核苷酸序列；以及d)一種編碼至少與SEQ ID NOS :2、4、6、8、10、12、14、16、18和20有90%同源序列的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列能夠運(yùn)輸有效連接的多肽至質(zhì)體上。
17.權(quán)利要求16的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自雙子葉植物。
18.權(quán)利要求16的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自單子葉植物。
19.一種包含權(quán)利要求18的植物細(xì)胞的植物。
20.權(quán)利要求19的植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的種子。
全文摘要
本發(fā)明提供了質(zhì)體靶向肽的組成和方法。組成包括質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及編碼這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽及其變體的核苷酸序列。組成還包括由核苷酸序列所組成的DNA構(gòu)建體，該核苷酸序列可編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，后者能夠有效連接至編碼所關(guān)注多肽的核苷酸序列上。這些DNA構(gòu)建體證實(shí)了在所關(guān)注多肽向質(zhì)體表達(dá)和定位方面的用途。組成還包括表達(dá)盒、載體、轉(zhuǎn)化植株、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物種子，其中所關(guān)注多肽經(jīng)本發(fā)明的質(zhì)體靶向肽被定位至質(zhì)體上。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102471778SQ201080032079
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日
發(fā)明者A.T.里士滿, K.鄧肯, M.努西奧 申請(qǐng)人:先正達(dá)參股股份有限公司