專利名稱：包含納米管的流體流動(dòng)裝置及其用于細(xì)胞遷移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞分離的裝置及方法。特別地，本發(fā)明涉及從混有不同細(xì)胞類型的混合物中或從流體中分離選定的細(xì)胞類型，所述分離基于細(xì)胞在涂覆有支持細(xì)胞滾動(dòng)的細(xì)胞粘附分子的基底上的滾動(dòng)能力。
背景技術(shù)：
純化細(xì)胞群在生物醫(yī)學(xué)研究及臨床治療領(lǐng)域具有多種應(yīng)用。通常，可根據(jù)細(xì)胞間不同的尺寸、密度或電荷對(duì)其進(jìn)行分離。然而，對(duì)于具有相似物理性質(zhì)的細(xì)胞，經(jīng)常通過利用細(xì)胞表面上存在的分子的差異對(duì)其進(jìn)行分離。細(xì)胞親和層析法就是基于該途徑，主要利用針對(duì)細(xì)胞表面特定抗原的固定的抗體。該親和層析分離法需要若干不同的步驟，包括將細(xì)胞與抗體共同孵育、細(xì)胞洗脫、細(xì)胞收集及結(jié)合抗體的釋放，每個(gè)步驟都會(huì)降低細(xì)胞的總收率并增加工藝成本。還需要從富含所需生物學(xué)靶點(diǎn)的供體中獲得細(xì)胞樣品。因?yàn)楫愘|(zhì)樣品可能僅包含極少量的所需生物實(shí)體，經(jīng)常無法通過分離方法來提供研究、診斷或治療用途所需的具有足夠純度及數(shù)量的有活力及效力的生物學(xué)靶點(diǎn)。由于分離及純化后的收率較低，必須將一些細(xì)胞類型，如干細(xì)胞、祖細(xì)胞以及免疫細(xì)胞(特別是T-細(xì)胞)置于長期培養(yǎng)系統(tǒng)中，所述長期培養(yǎng)系統(tǒng)中的條件確保維持細(xì)胞活力及臨床效力，并且在所述條件下細(xì)胞可增殖(細(xì)胞擴(kuò)增)。這些條件不一定都是現(xiàn)有存在的。為獲得足夠量的生物學(xué)靶點(diǎn)，必須從供體中一次性獲取大量的樣本，如外周血；或從一個(gè)供體中多次提取樣本，然后進(jìn)行一次或多次冗長、昂貴及通常收率較低的分離步驟以實(shí)現(xiàn)生物學(xué)靶點(diǎn)的有效分離。綜上所述，這些問題給供體、分離方法、技術(shù)人員、臨床醫(yī)師及病人產(chǎn)生了顯著的負(fù)擔(dān)，這些負(fù)擔(dān)顯著增加了分離所需細(xì)胞的所需要的時(shí)間及費(fèi)用。因此，以連續(xù)、流動(dòng)方式分離/隔離細(xì)胞的方法及裝置的需求始終存在。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞遷移的裝置及方法，所述裝置及方法使細(xì)胞在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)已被納米管改變的流動(dòng)表面上進(jìn)行流動(dòng)，所述納米管的外表面附著有支持細(xì)胞滾動(dòng)的細(xì)胞粘附分子。利用不同細(xì)胞類型在該表面上滾動(dòng)速度的差異可分離不同的細(xì)胞群。本發(fā)明裝置具有用于細(xì)胞滾動(dòng)的表面。該表面可以是流體流動(dòng)腔的一部分。在表面上布置有納米管，以使納米管固定在所述表面上。該納米管又涂覆有支持細(xì)胞滾動(dòng)的細(xì)胞粘附分子。在一個(gè)實(shí)施例中，在已固定有納米管的表面上具有包含正電荷分子組合物(如聚賴氨酸)的涂層。本發(fā)明同時(shí)提供一種制備裝置的方法，所述裝置具有改變的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以支持細(xì)胞的差異性滾動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)所述細(xì)胞的分離、隔離和/或純化。該方法包括獲得具有流動(dòng)表面的流體流動(dòng)腔。在其外表面已附著有納米管，然后在流動(dòng)表面上直接布置細(xì)胞粘附分子，或用包含正電荷分子(如聚賴氨酸)的組合物進(jìn)行涂覆后，再布置細(xì)胞粘附分子。在一個(gè)實(shí)施例中，可將納米管布置在流動(dòng)表面上，然后用細(xì)胞粘附分子涂覆納米管。本發(fā)明的裝置也用于富集、分離、隔離和/或純化細(xì)胞。該方法包括讓包含細(xì)胞或細(xì)胞混合物的流體組合物沿所述表面流動(dòng)。由于特定細(xì)胞與涂覆的表面間發(fā)生粘附，導(dǎo)致不同細(xì)胞類型以不同速度滾動(dòng)，因此可從其他細(xì)胞中分離、富集或純化出特定細(xì)胞。附圖簡述圖I.在生理學(xué)剪切力范圍內(nèi)，KGla細(xì)胞在涂覆有多水高嶺土納米管的表面上的平均滾動(dòng)速度降低。P-選擇素以2. g/mL的濃度孵育(A)。在較低⑶或較高(C)剪切力下，KGla細(xì)胞的平均滾動(dòng)速度作為P-選擇素孵育濃度的函數(shù)。誤差以SEM表示(N = 3)，***P < 0. 001，**P < 0. 01，*P < 0. 05。圖2.在對(duì)照表面(A)及涂覆有納米管的表面(B)上，細(xì)胞滾動(dòng)的代表性顯微照片中可觀察到被捕獲的細(xì)胞數(shù)目顯著增加。單位面積表面中被捕獲的KGla細(xì)胞數(shù)目作為在較低(C)或較高⑶剪切力下選擇素孵育濃度的函數(shù)。誤差以SEM表示(N = 3)，***P< 0. 001。圖3.微型管內(nèi)表面上的多水高嶺土納米管涂覆層增強(qiáng)Colo205上皮癌細(xì)胞的捕獲，通過滾動(dòng)速度(A)及單位面積導(dǎo)管表面所捕獲的細(xì)胞數(shù)目(B)進(jìn)行定量。誤差以SEM表示(N= 3),***P < 0. OOl0圖4.與分散于培養(yǎng)基中的納米管孵育72h后，KGla (A)或Colo205(B)細(xì)胞的存活未受影響?！敖?jīng)處理”條代表在10%多水高嶺土納米管與90%培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的平均存活性，而“未處理”條代表在10%蒸餾水與90%培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的平均存活性。誤差以SEM表示(N = 3)。圖5.假設(shè)(hypothesized)的納米級(jí)表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖示,其中單個(gè)納米管豎立在表面外，并在細(xì)胞沉積于表面時(shí)促進(jìn)早期的細(xì)胞捕獲(A)。在破碎處理并除去大的聚集物處理之后(B)及之前(C)，固定在表面上的多水高嶺土納米管的代表性原子力顯微鏡圖像。需要通過該處理步驟，產(chǎn)生重現(xiàn)性更高的細(xì)胞粘附行為。圖6.在P-選擇素孵育溶液一定濃度范圍內(nèi)，比較涂覆有納米管的表面及對(duì)照表面的免疫熒光(A)。涂覆有多水高嶺土的導(dǎo)管(B)及對(duì)照導(dǎo)管(C)都與10 u g/mL的P-選擇素進(jìn)行孵育，獲得代表性的顯微圖像。誤差以SEM表示，***P < 0. 001。圖7.在50cm涂覆有納米管的導(dǎo)管及對(duì)照導(dǎo)管中保持恒定的壓差值，并計(jì)算通過每種類型導(dǎo)管的所得流速。通過改變流體容器相對(duì)于導(dǎo)管出口的高度，獲得不同的壓差，并將結(jié)果與不具有可調(diào)參數(shù)的理論值進(jìn)行比較(A)。將熒光微球灌注通過導(dǎo)管，并測定接近導(dǎo)管表面的微球速度作為流速的函數(shù)。從AFM數(shù)據(jù)中，確定最大表面粗糙度高度，發(fā)現(xiàn)納米管涂覆層上的平均最大值是505nm，而空白對(duì)照表面上的平均最大值是30nm。通過方程式1，計(jì)算表面-表面分離距離(5)為505nm及30nm時(shí)的微球理論速度，發(fā)現(xiàn)其與不具有可調(diào)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)觀察值相匹配(B)。AFM圖像中代表性的表面特征。為便于觀察，將納米管涂覆層的曲線上移IOOnm(C)。誤差以SEM表示，***P < 0. 001。圖8.采用與其他滾動(dòng)實(shí)驗(yàn)相同的方式制備導(dǎo)管，然后與用于封閉的抗P-選擇素抗體進(jìn)行孵育。在對(duì)照導(dǎo)管或納米管涂覆導(dǎo)管中均只出現(xiàn)極少量的細(xì)胞粘附。圖9.在另一組實(shí)驗(yàn)中，制備用于滾動(dòng)實(shí)驗(yàn)的涂覆有納米管的導(dǎo)管及對(duì)照導(dǎo)管，允許細(xì)胞發(fā)生粘附及滾動(dòng)。隨后引入EDTA，以螯合溶液中的所有二價(jià)離子，從而使P-選擇素失活。在輕柔洗滌導(dǎo)管以除去所有未結(jié)合細(xì)胞后，在導(dǎo)管中未觀察到保持粘附的細(xì)胞。

圖10.當(dāng)P-選擇素濃度低于2. 5 u g/mL時(shí)觀察到細(xì)胞捕獲急劇下降。優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述本發(fā)明提供用于細(xì)胞遷移的裝置及方法，基于細(xì)胞滾動(dòng)速度的差異，從而分離細(xì)胞群。本發(fā)明源自這樣的發(fā)現(xiàn)，使細(xì)胞流動(dòng)通過流體腔可增強(qiáng)基于細(xì)胞滾動(dòng)的細(xì)胞遷移，所述流體腔表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)已被固定的納米管所改變，其中納米管采用支持細(xì)胞滾動(dòng)的細(xì)胞粘附分子進(jìn)行功能化。納米管的存在可顯著改變細(xì)胞的平均滾動(dòng)速度，從而使流過腔體的流體中的多種細(xì)胞得到分離。至少部分增強(qiáng)效應(yīng)被認(rèn)為歸因于那些伸出表面并伸進(jìn)流動(dòng)流體中的納米管。本發(fā)明中，通過使用原子力顯微鏡檢查及免疫熒光定量技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)支持該模型。因此，雖然所述納米管幾乎不影響宏觀流體動(dòng)力學(xué)，但卻改變了對(duì)流顆粒或細(xì)胞 的平衡流線?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供用于細(xì)胞遷移的裝置及方法。本發(fā)明裝置包含流體流動(dòng)腔(本發(fā)明中也被稱為微型管)，其中所述流動(dòng)腔的內(nèi)表面上固定有納米管。納米管的外表面上載有支持細(xì)胞滾動(dòng)的細(xì)胞粘附分子。細(xì)胞遷移時(shí)，使包含細(xì)胞的流體流動(dòng)通過流動(dòng)腔。與細(xì)胞表面未表達(dá)細(xì)胞滾動(dòng)分子的細(xì)胞相比，在其細(xì)胞表面表達(dá)與細(xì)胞粘附分子互補(bǔ)的配體的細(xì)胞以不同的速度沿腔壁滾動(dòng)，從而可被分離。細(xì)胞滾動(dòng)或細(xì)胞的滾動(dòng)在本申請(qǐng)中是指，當(dāng)受體介導(dǎo)的粘附作用導(dǎo)致細(xì)胞移動(dòng)速度降至低于自由流體動(dòng)力學(xué)速度的50%時(shí)，細(xì)胞在表面移動(dòng)至少一個(gè)細(xì)胞直徑(即，速度不為零)。例如，使白細(xì)胞在血管內(nèi)皮上進(jìn)行滾動(dòng)的粘附即稱為細(xì)胞滾動(dòng)。所述粘附涉及P-選擇素和E-選擇素(在血管內(nèi)皮細(xì)胞上)與選擇素結(jié)合性糖配體(在循環(huán)的造血干細(xì)胞和白細(xì)胞上表達(dá))之間的弱親和作用。認(rèn)為通過這樣的弱的相互作用使得細(xì)胞“被捕獲”，并且在“被捕獲”后，細(xì)胞在表面緩慢滾動(dòng)，與之相反，未被捕獲的細(xì)胞在總流體中快速流動(dòng)。因此，細(xì)胞滾動(dòng)涉及選定的細(xì)胞以短暫的方式發(fā)生粘附，從而當(dāng)暴露于流動(dòng)場中的切變速率時(shí)，細(xì)胞與粘附分子之間并未緊密結(jié)合，而是沿著涂覆表面發(fā)生滾動(dòng)，所述切變速率優(yōu)選50-1000^(0. 5至lOdynes/cm2及中間的所有整數(shù)，以及整數(shù)間十分之一距離的所有數(shù)值)的范圍及其中的所有整數(shù)。支持細(xì)胞滾動(dòng)的細(xì)胞粘附分子實(shí)例包括選擇素、鈣粘素、整合素以及GP-1，或這些分子的片段，或整合了這些支持細(xì)胞滾動(dòng)分子的融合分子的嵌合體。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞滾動(dòng)分子是選擇素。選擇素是造血干細(xì)胞(HSC)及白細(xì)胞可短暫性粘著的蛋白。例如，CD34+干細(xì)胞是未成熟的干細(xì)胞并具有最高的干細(xì)胞活性，與更定型或分化的CD34-干細(xì)胞相比，其顯示出更有效的(或更緩慢的)滾動(dòng)。紅細(xì)胞及血小板不在選擇素上發(fā)生滾動(dòng)，而白細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)滾動(dòng)。選擇素的實(shí)例有，P-選擇素、L-選擇素和E-選擇素以及重組選擇素分子，如P-選擇素-IgG嵌合體及E-選擇素-IgG嵌合體。整合素及鈣粘素是細(xì)胞粘附分子家族的成員。整合素介導(dǎo)免疫應(yīng)答中重要的粘附活動(dòng)。已知這些分子涉及細(xì)胞滾動(dòng)。例如，a 4整合素被認(rèn)為介導(dǎo)白細(xì)胞滾動(dòng)。I丐粘素包括E-鈣粘蛋白、P-鈣粘蛋白以及N-鈣粘蛋白。
GPlb是一種肽，涉及血小板沿血管壁的滾動(dòng)。流動(dòng)的血小板與血管壁之間的最初粘附相互作用被認(rèn)為由血小板GPlb短暫性地結(jié)合于固定的血管假性血友病因子的Al結(jié)構(gòu)域所介導(dǎo)，并且認(rèn)為需達(dá)到 ldyn/cm2剪切力的閾水平以實(shí)現(xiàn)短暫的粘附，這類似于中性白細(xì)胞粘附于L-選擇素及P-選擇素的動(dòng)力學(xué)特征。一般而言，GPlb: vWF(血管假性血友病因子)的結(jié)合時(shí)間隨著施加的作用力而急劇降低?？赏ㄟ^在表面上直接進(jìn)行物理吸收(吸收)，將細(xì)胞粘附分子附著或涂覆在納米管的外表面上。另一個(gè)附著細(xì)胞粘附分子的方法是，首先將親合素蛋白(包含例如"Neutravidin"或"Superavidin"的變體)吸收或附著在表面上，隨后將該涂覆有親合素的表面與包含生物素基團(tuán)的細(xì)胞粘附分子發(fā)生反應(yīng)。可使用靜電荷或疏水作用在表面上附著細(xì)胞粘附分子。其他將分子附著到表面上的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的，并且取決于表面及所涉及的細(xì)胞粘附分子的類型。細(xì)胞粘附分子可直接附著于納米管的外表面。然后可將納米管固定在表面上?！肮潭ā笔侵冈谟闪黧w流經(jīng)所產(chǎn)生的剪切力作用下，例如生理剪切力(通常介于0. 5至IOdynes/cm2)，納米顆粒仍然保持附著在內(nèi)表面上。 納米管可由任何材料制成，所述材料通常為惰性的、在流體流動(dòng)過程中可保持固定在表面上，并可提供適宜于粘附分子附著的表面。在一個(gè)實(shí)施例中，納米管具有500nm至1.5um的平均長度、通常為中空且具有40至200nm的平均直徑。適宜的納米管材料包括多水高嶺土、二氧化硅及氧化鈦。多水高嶺土納米管是自然形成的，因此容易獲得。例如，自然形成的納米管可從如NaturalNano公司(Rochester, NY)購得。源自多水高嶺土或其他材料的納米管也可通過合成獲得。自然形成的納米管通常具有500nm至I. 2iim的長度。在一個(gè)實(shí)施例中，用于涂覆的至少50%的導(dǎo)管長為500nm至I. 2iim。在其他實(shí)施例中，至少50、60、70、80、90 %或100% (以及50至100之間的所有百分?jǐn)?shù))的導(dǎo)管長為500nm至1.2iim。納米管通常具有40至200nm的直徑。在不同的實(shí)施例中，50、60、70、80、90%或100% (以及50至100之間的所有百分?jǐn)?shù))的導(dǎo)管具有40至200nm的直徑。納米管通常是中空的。對(duì)于制備流體流動(dòng)腔而言，優(yōu)選采用包含荷電分子的組合物先涂覆流動(dòng)表面。例如，可使用包含正電荷分子的組合物，如聚賴氨酸或鈦酸丁酯。隨后將納米管置于流動(dòng)表面。為避免納米管成團(tuán)分布，可對(duì)包含納米管的組合物進(jìn)行過濾或采用其他適宜的方法除去團(tuán)塊。例如,可對(duì)包含多水高嶺土導(dǎo)管的溶液進(jìn)行超聲處理(如Imin)后進(jìn)行過濾(如使用0. 45 y m濾器)。如果允許納米管形成多層涂覆，則細(xì)胞行為及捕獲將會(huì)變得不可預(yù)測。因此，優(yōu)選為單層納米管，且一些納米管可插入內(nèi)腔。當(dāng)在涂覆前稀釋納米管的濃度時(shí)，會(huì)觀察到細(xì)胞捕獲減少，表明形成了單層結(jié)構(gòu)。在納米管的外表面附著所需的細(xì)胞粘附分子(如選擇素)?？稍诔F(tuán)塊之前或之后附著選擇素，但是在優(yōu)選的實(shí)施例中，在除去團(tuán)塊后進(jìn)行選擇素的附著。納米管可覆蓋或可不覆蓋整個(gè)流動(dòng)表面。一些納米管可伸出流動(dòng)表面。在一個(gè)實(shí)施例中，納米管在流動(dòng)表面上伸出至多一個(gè)納米管的長度。在另一個(gè)實(shí)施例中，納米管伸出至少50nm。因此,納米管可以向流體腔的腔內(nèi)伸進(jìn)50nm至I. 2 y m。在不同的實(shí)施例中，納米管在流動(dòng)表面上向腔內(nèi)最多伸進(jìn)50nm至低于I. I u m>I. 0 u m、900nm、800nm、700nm、600nm及所述范圍間的所有整數(shù)。在一個(gè)實(shí)施例中，納米管伸出40nm至I. 2iim，以及在此之間的所有整數(shù)和范圍。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明利用細(xì)胞的滾動(dòng)性質(zhì)，將細(xì)胞與其他細(xì)胞類型或從流體組分中分離。因此，呈現(xiàn)滾動(dòng)行為的細(xì)胞類型可與那些不呈現(xiàn)滾動(dòng)行為，而是隨著流體進(jìn)行流動(dòng)的細(xì)胞類型得到分離。此外，也可基于滾動(dòng)速度的差異對(duì)不同細(xì)胞類型進(jìn)行分離，該差異可能是細(xì)胞上的細(xì)胞粘附分子配體的數(shù)目或類型不同所導(dǎo)致。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明利用造血干細(xì)胞(HSC)的天然滾動(dòng)性質(zhì)將其與其他血細(xì)胞進(jìn)行分離。在該實(shí)施例中，血細(xì)胞沿著表面滾動(dòng)，該表明涂覆有選擇素修飾的納米管。選擇素與HSC間的粘附減緩了 HSC沿表面滾動(dòng)的速度，而其他細(xì)胞以其正常的速度進(jìn)行滾動(dòng)或流動(dòng)。滾動(dòng)速度的差異可將HSC從其他細(xì)胞中分離及富集。HSC的分離可用于治療多種癌癥、血液及免疫缺陷疾病。癌癥及免疫疾病的治療通常需要激進(jìn)的放射治療及化學(xué)治療，這些療法會(huì)殺死造血所需的健康骨髓。通過骨髓及外周HSC移植，醫(yī)生能夠?qū)⒉B(tài)的或受損的骨髓替換為能產(chǎn)生正常血細(xì)胞的健康骨髓。本發(fā) 明裝置可實(shí)現(xiàn)從外周供血中分離HSC，用于隨后重新給回人體。本發(fā)明也可用于捕獲循環(huán)的腫瘤細(xì)胞(CTCs)，即從原發(fā)性腫瘤中脫離并在血液中進(jìn)行循環(huán)的細(xì)胞。一些CTCs有可能最終會(huì)在不同位點(diǎn)及不同組織中形成額外的腫瘤。此夕卜，這些細(xì)胞也可在切除腫瘤時(shí)被釋放，且一些CTCs在外科手術(shù)過程中被釋放。因此，本發(fā)明的裝置及方法可用于捕獲CTCs。此外，本發(fā)明也可用于凈化血液、用作檢測CTCs是否存在的診斷工具、或者甚至捕獲這些CTCs并重新改造/重新引入宿主以用作/對(duì)抗腫瘤。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的裝置可用作植入性裝置，用于在體內(nèi)分離、富集和/或純化體液中的細(xì)胞。植入性裝置是指，可用在本發(fā)明描述的方法中，用于改變體內(nèi)目標(biāo)細(xì)胞濃度的任何器件。植入性裝置可以是支架、導(dǎo)管、插管、膠囊、貼劑、線、輸液套、纖維、分流器、接枝等等。只要可以根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行使用，植入性裝置及其各組件部分可以是任何生物相容性材料、幾何學(xué)形式或構(gòu)造。裝置可包含循環(huán)流，其中裝置中的部分輸出流循環(huán)至輸入流。這可有效增加所需細(xì)胞的輸入濃度，從而改善輸出流的濃度。在另一個(gè)實(shí)施例中，裝置可包含多級(jí)串聯(lián)流動(dòng)腔。在此種情況下，至少兩個(gè)裝置串聯(lián)連接，其中一個(gè)裝置的輸出流進(jìn)入另一個(gè)裝置的輸入流。后續(xù)的每個(gè)裝置可進(jìn)一步富集、分離和/或純化所需細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)流動(dòng)腔進(jìn)行構(gòu)造，使得流體呈現(xiàn)出骨髓中的復(fù)雜的正弦曲線流動(dòng)，而不是產(chǎn)生明確的拋物線速度曲線。在一個(gè)實(shí)施例中，可在納米管內(nèi)腔中提供遞送分子，用于在滾動(dòng)過程中遞送至細(xì)胞。因?yàn)樵诙嗨邘X土納米管的內(nèi)表面和外表面帶有凈負(fù)電荷，而邊緣部分是兩性的，所以可使用納米管包封及持續(xù)釋放藥物，尤其是陽離子藥物。因此，可在納米管內(nèi)裝載陽離子藥物，然后將納米管涂覆在微型管的內(nèi)表面，隨后進(jìn)行功能化步驟，將細(xì)胞粘附分子(如選擇素)附著在納米管的外表面。在一個(gè)實(shí)施例中，可將納米管進(jìn)行功能化后將其附著至微型管內(nèi)表面。在納米管涂覆上能夠進(jìn)行滾動(dòng)的靶細(xì)胞將處于具有相對(duì)高濃度藥物的微環(huán)境中，所述藥物從納米管中穩(wěn)定地釋放。在另一可選的方式中，治療藥物可裝載在納米管中，該納米管隨后松散地結(jié)合于流動(dòng)表面。在流動(dòng)表面進(jìn)行滾動(dòng)的靶細(xì)胞將與納米管結(jié)合并將攝入納米管，從而內(nèi)化所裝載的治療劑。由于納米管上存在的凈電荷，因此陽離子藥物是最優(yōu)的候選，適宜的治療劑包括鹽酸多柔比星、鹽酸依立替康、以及陽離子抗微生物肽(CAPs)
坐坐寸寸O下列實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于下述實(shí)施例所詳細(xì)描述的特定條件或細(xì)節(jié)。實(shí)施例I材料及方法試劑及抗體RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS)、Hank’ s 平衡鹽溶液GffiSS)、及IX胰酶購自Invitrogen (Grand Island,NY)。重組P-選擇素-IgG嵌合體及重組E-選擇素-IgG嵌合體從R&D system(Minneapolis, MN)獲得。多水高嶺土納米管水溶液(6. 6%,按重量計(jì))由NaturalNano (Rochester, NY)提供。臺(tái)盼藍(lán)染料(0.4%)從 Lonza(Wilkersville，MD)獲得。聚-L-賴氨酸(0. I % w/v 的水溶液)從Sigma-Aldrich(St. Louis,MO)獲得。印跡級(jí)封閉劑脫脂奶粉從Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室(Hercules,CA)獲得。小鼠抗人CD62P(P_選擇素)單克隆IgG從eBioscience(San Diego, CA)獲得。Alexa Fluor 546 驢抗小鼠 IgG(H+L)抗體從 Invitrogen(Carlsbad, CA)獲得。細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)急性骨髓白血病KGla細(xì)胞系(ATCC號(hào)CCL-264. I)及結(jié)腸癌Colo205細(xì)胞系(ATCC號(hào)CCL-222)從ATCC(Manassas，VA)獲得。這些細(xì)胞系在37°C及5% CO2的濕潤條件下培養(yǎng)于添加有2mM I-谷氨酰胺、25mM HEPES,10% (v/v)胎牛血清及100U/mL青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(通用培養(yǎng)基)中。制備用于滾動(dòng)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞Colo205細(xì)胞，一種粘附細(xì)胞系，經(jīng)胰酶消化5min，然后在使用前對(duì)其培養(yǎng)至多5h以確保正常的表面受體的表達(dá)。KGla細(xì)胞及Colo205細(xì)胞均在4°C的Allegra X-22冷凍離心機(jī)中采用IXPBS以I IOOrpm洗滌兩次，并以IO6細(xì)胞/mL的濃度重懸于流動(dòng)緩沖液中。流動(dòng)緩沖液由含有Mg2+及飽和Ca2+的PBS組成。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，證實(shí)至少90%的細(xì)胞存活。制備多水高嶺土納米管溶液處理多水高嶺土儲(chǔ)備溶液，以破碎并除去大的聚集物。劇烈攪拌儲(chǔ)備溶液并將其用超聲波破碎儀進(jìn)行處理，超聲波破碎儀從Fisher Scientif ic (Pittsburgh, PA)獲得。隨后米用 0. 45 ii m孔徑的 PVDF膜注射器式濾器(Pall Life Sciences,Port Washington,NY)對(duì)所得溶液進(jìn)行過濾。制備表面將重組人P-或E-選擇素-IgG嵌合蛋白溶于PBS，以得到20 U g/mL的濃度。先用75%乙醇、然后用蒸餾水洗滌表面。對(duì)照表面與稀釋至2. 5-10 u g/mL濃度的P-或E-選擇素-IgG孵育2h，然后與溶于PBS的5%乳蛋白孵育lh。最后，將固定的選擇素分子與含鈣流動(dòng)緩沖液孵育lOmin，使其活化。涂覆有納米管的表面與2:8聚-L-賴氨酸溶液(0. 02%w/v)孵育5min，然后與經(jīng)處理的納米管溶液孵育3min。隨后采用與對(duì)照表面相同的方式在涂覆有納米管的表面上涂覆P-或E-選擇素-IgG及乳蛋白。所有孵育都在室溫下進(jìn)行。滾動(dòng)實(shí)驗(yàn)Micro-Renathane 微型管(3OOlim 內(nèi)徑)從 Braintree Scientific (Braintree,MA)獲得，切割成50cm的長度，并在如上所述的表面功能化后，將其固定在Olympus 1X81電動(dòng)倒置研究用顯微鏡(Olympus America, Melville, NY)的載物臺(tái)上。使用CCD照相機(jī)(Hitachi, Tokyo, Japan)及DVD記錄儀(Sony Electronics),記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于離線分析。通過一臺(tái)注射器泵(KDS 230, IITC Life Science, Woodland Hills, CA),控制細(xì)胞懸浮液流過微型管，所述細(xì)胞懸浮液以IO6細(xì)胞/mL的濃度懸浮于流動(dòng)緩沖液中。在進(jìn)行流動(dòng)實(shí)驗(yàn)前，以2. 5dyn/cm2的剪切力將細(xì)胞載入微型管中且持續(xù)5min。隨后啟用2. 5-6. 67dyn/cm2的剪切力值，并持續(xù)Imin以允許建立流動(dòng)，然后收集數(shù)據(jù)。存活實(shí)驗(yàn)用KGla及Colo205細(xì)胞進(jìn)行存活實(shí)驗(yàn)，做三個(gè)重復(fù)，其中經(jīng)處理的細(xì)胞在含有10%的經(jīng)處理的多水高嶺納米管溶液的培養(yǎng)基中孵育72h。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(HausserScientific, Horsham, PA)上使用臺(tái)盼藍(lán)染料在72h周期的起始和結(jié)束時(shí)進(jìn)行活力計(jì)數(shù)。細(xì)胞初始被稀釋至2. 5X IO5細(xì)胞/mL的濃度。原子力顯微鏡檢杳 使用與涂覆微型管相同的方法，涂覆玻璃蓋玻片，由此制備涂覆有多水高嶺土納米管的表面的平坦樣本，用于進(jìn)行原子力顯微鏡檢查。采用如上所述方法，使用處理前或處理后的納米管溶液制備表面。將新導(dǎo)管切成平面底物，以對(duì)內(nèi)表面進(jìn)行成像。隨后使用Veeco DI-3000原子力顯微鏡對(duì)樣本進(jìn)行成像。在每個(gè)樣本的五個(gè)隨機(jī)位點(diǎn)記錄10 ii mX 10 ii m的圖像,使用Mac OS中的Image SXM 189軟件記錄表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及相移數(shù)據(jù)，并進(jìn)行離線分析。在Image SXM中分析每個(gè)平坦的涂覆有納米管的樣本及未處理的管樣本的三個(gè)圖像，以核查表面高度數(shù)據(jù)。對(duì)于每個(gè)圖像，在貫穿全部圖像的20個(gè)隨機(jī)位點(diǎn)上完成該工作?？贵w封閉實(shí)驗(yàn)如上所述，制備涂覆有納米管的表面及對(duì)照表面。在PBS_中將P-選擇素-IgG稀釋至2.5i!g/mL，并在室溫(RT)下在微型管內(nèi)孵育2h。隨后在室溫下采用溶于PBS_的5%乳蛋白封閉微型管lh。通過與Ca2+飽和的PBS+孵育15min，活化微型管中的P-選擇素。在PBS+中將小鼠抗人⑶62P (P-選擇素)AK-4單克隆抗體稀釋至100 u g/mL,并在室溫下在微型管內(nèi)孵育2h。隨后以低剪切力(2. 5dyn/cm2)將流動(dòng)緩沖液中的細(xì)胞懸浮液灌注通過微型管，所述細(xì)胞懸浮液包含濃度為106細(xì)胞/mL的KGla細(xì)胞，并采用影像顯微鏡觀察流動(dòng)下的細(xì)胞行為。Ca-螯合實(shí)驗(yàn)以滾動(dòng)試驗(yàn)中相同的制備方法，制備涂覆有納米管的表面及對(duì)照表面，PBS_中的P-選擇素-IgG蛋白以2. 5 ii g/mL的濃度進(jìn)行孵育(2h)并用5%乳蛋白進(jìn)行封閉(Ih)。在用Ca2+飽和的PBS+活化P-選擇素后，以2. 5dyn/cm2的剪切力將濃度為106細(xì)胞/mL的KGla細(xì)胞懸浮液灌注通過導(dǎo)管5min。隨后停止流動(dòng)，并用包含5mM EDTA (VffR Inc.，WestChester,PA)的PBS_的注射器替代注射器泵中的注射器，所述注射器泵中的注射器用于從通過導(dǎo)管的細(xì)胞來源中抽取細(xì)胞懸浮液。將注射器泵從抽取模式轉(zhuǎn)為灌注模式，并經(jīng)每個(gè)導(dǎo)管緩慢泵入一個(gè)導(dǎo)管的體積。將EDTA溶液在導(dǎo)管中靜置lOmin，然后經(jīng)導(dǎo)管緩慢泵入另一個(gè)導(dǎo)管體積的EDTA溶液以清除未結(jié)合細(xì)胞。隨后使用影像顯微鏡檢查掃描導(dǎo)管中存在的粘附細(xì)胞。
測定P-選擇素的表面密度將八個(gè)導(dǎo)管切至20cm的長度。其中四個(gè)導(dǎo)管采用多水高嶺土納米管進(jìn)行涂覆，剩余的四個(gè)導(dǎo)管不經(jīng)涂覆，用作對(duì)照導(dǎo)管。使用溶于PBS_的不同濃度的P-選擇素-IgG對(duì)三個(gè)涂覆有納米管的導(dǎo)管及三個(gè)對(duì)照導(dǎo)管進(jìn)行涂覆，然后使用5%乳蛋白進(jìn)行封閉。用PBS_孵育剩余的涂覆有納米管的導(dǎo)管及對(duì)照導(dǎo)管2h，然后使用5%乳蛋白封閉lh。隨后采用Ca2+飽和的PBS+孵育所有導(dǎo)管，以活化被吸收的P-選擇素，然后用含IOOii g/mL的小鼠抗人⑶62P (P-選擇素)IgG的PBS+孵育2h。采用PBS+充分洗滌導(dǎo)管，并在避光下，在所有導(dǎo)管中用含200 ii g/mL驢抗小鼠IgG的PBS+孵育2h。隨后采用PBS+充分洗滌導(dǎo)管。每次將一個(gè)導(dǎo)管置于顯微鏡載物臺(tái)上，以避免不等的光漂白作用，且在置于顯微鏡前，使用手術(shù)鉗密封導(dǎo)管的兩端。使用4X物鏡拍攝熒光顯微圖像，以觀察到大面積的背景和導(dǎo)管的大部分。在沿著每個(gè)導(dǎo)管長度的隨機(jī)位點(diǎn)收集十五張顯微圖像。每個(gè)圖像的曝光時(shí)間被設(shè)為300ms。在ImageJ中離線分析顯微圖像，標(biāo)出關(guān)注區(qū)的輪廓，并定量在關(guān)注區(qū)內(nèi)的光亮強(qiáng)度柱狀圖。從柱狀圖中測定平均強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)差。通過扣除導(dǎo)管外區(qū)域的強(qiáng)度，分析個(gè)體顯微圖像。隨后通過在未涂覆P-選擇素的導(dǎo)管中所觀察到的平均亮度值，校正相對(duì)熒光強(qiáng)度值。壓差實(shí)駘如上所述，采用多水高嶺土納米管涂覆50cm導(dǎo)管，并將其與50cm未涂覆的對(duì)照導(dǎo)管進(jìn)行比較。將一個(gè)75mL容器與導(dǎo)管相連，并在開始時(shí)使用環(huán)架將所述容器懸掛，使導(dǎo)管出口達(dá)到工作臺(tái)。工作臺(tái)上的導(dǎo)管出口與容器上75mL標(biāo)記處的垂直距離初始設(shè)為84cm。隨后用水填充容器至75mL標(biāo)記處，并在整個(gè)試驗(yàn)中手動(dòng)維持該水位。將導(dǎo)管出口置入干燥的稱量皿中，同時(shí)啟動(dòng)秒表并收集5min的流出液，然后立即將導(dǎo)管出口移除稱量皿，并將稱量皿稱重，以確定流經(jīng)導(dǎo)管的水體積。將每個(gè)導(dǎo)管在四個(gè)高度84、74、64及49cm時(shí)都重復(fù)上述過程三次。微球灌灃實(shí)驗(yàn)如上所述，制備涂覆有納米管的導(dǎo)管及對(duì)照導(dǎo)管，以2. 5 y g/mL涂覆2h并封閉lh。將熒光微球以5X 105微球/mL的濃度懸浮于流動(dòng)緩沖液中，并以不同流速灌注通過導(dǎo)管，所述熒光微球具有I. 9 ii m的平均直徑及520nm的(Bangs Inc.，F(xiàn)ishers, IN)發(fā)射波長。對(duì)于各個(gè)流速，沿著每個(gè)導(dǎo)管選擇隨機(jī)位點(diǎn)，并使用裝載I. 6X倍數(shù)器的20X物鏡啟動(dòng)聚焦。使用熒光模式拍攝100張時(shí)間分布為10至75ms的經(jīng)時(shí)顯微照片，使用TRITC過濾器設(shè)定，使得每張顯微照片間的間隔為500ms。重復(fù)上述工作，使得在四個(gè)中的每一個(gè)測定的流速下0. 03,0. 06,0. 095及0. 13mL/min，沿著每個(gè)導(dǎo)管長度的三個(gè)隨機(jī)位點(diǎn)記錄100張顯微照片。通過由靠近導(dǎo)管表面的微球移動(dòng)所產(chǎn)生的焦距內(nèi)條紋長度，測定微球速度。使用ImageJ進(jìn)行測定,且使用載玻片測微尺(Olympus, Tokyo, Japan)確定刻度。數(shù)據(jù)分析通過測量滾動(dòng)細(xì)胞在30s的時(shí)間間隔內(nèi)移動(dòng)的距離計(jì)算滾動(dòng)速度。滾動(dòng)細(xì)胞被定義為，以小于流體自由流動(dòng)速度50%的平均速度，沿著流動(dòng)方向移動(dòng)的細(xì)胞。在沿著微型管的三個(gè)隨機(jī)位點(diǎn)拍攝滾動(dòng)細(xì)胞的影像。通過記錄沿微型管的30個(gè)隨機(jī)位點(diǎn)的顯微 圖像，確定粘附于表面的細(xì)胞數(shù)量。所有誤差表示為平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，通過GraphPadPrism(GraphPad Software, San Diego, CA)的非配對(duì)t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
結(jié)果多水高嶺土納米管涂覆層降低癌細(xì)胞的滾動(dòng)速度將流動(dòng)緩沖液中包含KGla細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液灌注通過毛細(xì)管，流速的范圍可傳遞已知剪切力至導(dǎo)管的內(nèi)表面上。將涂覆有以P-選擇素涂覆的多水高嶺土納米管的導(dǎo)管，與單獨(dú)涂覆P-選擇素的導(dǎo)管進(jìn)行比較，其中P-選擇素溶液孵育濃度為2. g/mLo在剪切力范圍內(nèi)，與對(duì)照導(dǎo)管相比，涂覆有納米管的導(dǎo)管中的KGla細(xì)胞平均滾動(dòng)速度出現(xiàn)顯著降低(圖1A)。由納米管涂覆層導(dǎo)致的滾動(dòng)速度降低隨著P-選擇素表面密度的增加而減弱在P-選擇素的表面密度范圍內(nèi)，比較KGla細(xì)胞在涂覆有納米管的表面上與在對(duì)照表面上的平均滾動(dòng)速度。發(fā)現(xiàn)在涂覆有納米管的表面上，細(xì)胞的平均滾動(dòng)速度顯著低于在對(duì)照表面上的平均速度；然而，平均滾動(dòng)速度減少的程度隨著P-選擇素表面密度的增加 而降低。在較低及較高的剪切力下(分別對(duì)應(yīng)圖IB及C)均存在上述發(fā)現(xiàn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)P-選擇素表面密度的增加顯著影響在對(duì)照表面上的滾動(dòng)速度，但是對(duì)涂覆有多水高嶺土的表面上，在較低及較高剪切力下，對(duì)滾動(dòng)速度的影響均較小。
_0] 多水高嶺土納米管涂覆層增加被捕獲細(xì)胞的數(shù)目滾動(dòng)及靜態(tài)粘附于導(dǎo)管表面的細(xì)胞數(shù)目可用于指示表面捕獲靶細(xì)胞群的效力。分析粘附在導(dǎo)管內(nèi)表面的細(xì)胞數(shù)目，作為剪切力及P-選擇素表面密度的函數(shù)。發(fā)現(xiàn)在涂覆有納米管的表面上，捕獲的細(xì)胞數(shù)目的顯著增加(圖2A，B)，在較低及較高剪切力(分別對(duì)應(yīng)圖2C及D)下的所有P-選擇素表面密度下均如此。有趣的是，納米管涂覆層的效果對(duì)P-選擇素的表面密度不敏感。
_2] 上皮CTC在涂覆有納米管的表面上呈現(xiàn)相似的行為將Colo205結(jié)腸癌細(xì)胞灌注通過涂覆有多水高嶺土及E-選擇素的導(dǎo)管以及單獨(dú)涂覆E-選擇素的導(dǎo)管，并在一定的剪切力范圍內(nèi)比較其行為。Colo205細(xì)胞被用作上皮癌CTC模型。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，E-選擇素孵育溶液的濃度恒定在2.5 ii g/mL。由于涂覆有多水高嶺土納米管，使得Colo205的平均滾動(dòng)速度均降低且粘附細(xì)胞數(shù)量增加，這類似于KGla細(xì)胞中的情況(分別對(duì)應(yīng)圖3A及B)。
_4] 多水高嶺土納米管未影響細(xì)胞的存活在分散有和未分散有多水高嶺土納米管的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，在37°C及5% C02的濕潤條件下孵育72h后測試細(xì)胞的存活。經(jīng)處理的細(xì)胞是那些培養(yǎng)在10%納米管溶液與90%培養(yǎng)基中的細(xì)胞，而未處理的細(xì)胞是那些培養(yǎng)在10%蒸餾水與90%培養(yǎng)基中的細(xì)胞。如圖4A及4B所示，在72h孵育后，KGla及Colo205細(xì)胞均未受到培養(yǎng)基中存在的納米管的影響。AFM顯示納米管伸出表面對(duì)涂覆在聚-L-賴氨酸薄層上的納米管拍攝原子力顯微鏡的圖像，顯示納米管的定位使得其伸出表面數(shù)百納米至數(shù)微米的距離。同時(shí)拍攝了未處理的納米管(圖5B)及經(jīng)處理的納米管(圖5C)，并發(fā)現(xiàn)處理步驟可有效破壞并除去大的聚集物，因此基本上不含有聚集物；而同時(shí)，納米管大多保持了伸出表面的高度。免疫熒光標(biāo)記顯示納米管涂覆層上增加的P-詵擇素吸附用P-選擇素特異性的標(biāo)記抗體進(jìn)行熒光顯微鏡檢，顯示吸附在涂覆有納米管表面上的P-選擇素的表面密度顯著大于對(duì)照導(dǎo)管上的P-選擇素的表面密度(圖6A)。隨著P-選擇素孵育溶液濃度的升高，由于納米管涂覆導(dǎo)致的P-選擇素表面密度的相對(duì)差異減弱。代表性的顯微圖像如圖6B及C所示。對(duì)各圖像計(jì)算相對(duì)于背景亮度的熒光強(qiáng)度值，隨后通過由于導(dǎo)管自發(fā)熒光或非特異性抗體結(jié)合而觀察到的少量熒光，對(duì)導(dǎo)管的平均熒光值進(jìn)行校正。選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞捕獲的特異性在一組實(shí)驗(yàn)中，采用與其他滾動(dòng)實(shí)驗(yàn)相同的方式制備導(dǎo)管，然后與用于封閉的抗P-選擇素抗體進(jìn)行孵育。在對(duì)照導(dǎo)管或涂覆有納米管的導(dǎo)管中均只有極少量的細(xì)胞粘附(圖8)。在另一組實(shí)驗(yàn)中，制備用于滾動(dòng)實(shí)驗(yàn)的涂覆有納米管的導(dǎo)管及對(duì)照導(dǎo)管，允許細(xì)胞發(fā)生粘附及滾動(dòng)。隨后引入EDTA，以螯合溶液中的所有二價(jià)離子，從而使P-選擇素失活。在輕柔洗滌導(dǎo)管以除去所有未結(jié)合細(xì)胞后，在導(dǎo)管中未觀察到保持粘附的細(xì)胞(圖9)。多水高嶺土納米管涂覆層未改變宏觀流體動(dòng)力學(xué)將具有或不具有納米管涂覆層的50cm納米管置于恒定的流體靜壓差中。通過 稱重在導(dǎo)管出口處5min時(shí)間內(nèi)收集的流體，測定四個(gè)不同容器高度下流經(jīng)導(dǎo)管的流速。計(jì)算在涂覆有納米管的導(dǎo)管中及對(duì)照導(dǎo)管中的流速，發(fā)現(xiàn)在各容器高度下的平均流速差異為:84cm 相差 0. 18%、74 11相差0.71%、64011相差0.77%而49011相差2. I %。使用Hagen-Poiseuille方程式計(jì)算理論流速,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)值與理論十分匹配(圖7A)。多水高嶺土納米管涂覆層改變流動(dòng)顆粒的表面分離距離將熒光微球以不同流速灌注通過涂覆有納米管的導(dǎo)管及對(duì)照導(dǎo)管，以獲得流體速度及壁切變率的局部量值。經(jīng)時(shí)熒光顯微鏡檢可計(jì)算個(gè)體微球的速度。發(fā)現(xiàn)涂覆有納米管的導(dǎo)管中，平均微球速度顯著高于對(duì)照導(dǎo)管中的速度，且發(fā)現(xiàn)在涂覆有納米管的導(dǎo)管中，伴隨灌注率增加的微球速度增長率更高(圖7B)。分析若干納米管涂覆表面及未處理管表面的AFM圖像，以表征其納米級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖7C)。在AFM圖像的20個(gè)隨機(jī)薄層斷片中，評(píng)估最大表面特征高度，發(fā)現(xiàn)對(duì)照導(dǎo)管中的平均最大表面特征高度是 30nm，而涂覆有納米管的表面上的平均最大特征高度是 505nm。由于微球不能流動(dòng)到比表面上的最高的粗糙元件更接近于管表面的地方，因此可將該平均最大特征高度用于限制表面-表面分離參數(shù)。根據(jù)剪切流體中近壁球體的Stokes流體方程，可以計(jì)算微球在離平面壁特定距離移動(dòng)時(shí)的理論速度
U0.7431/n豆 (X6376一 0 2()0 In(Sfa)()其中U是微球速度、h是微球中心與壁之間的距離、S是切變率、5是微球表面與壁(分離距離)之間的距離、而a是微球半徑(圖7B)。根據(jù)測量的表面粗糙度預(yù)測得到的微球速度，與不具有可調(diào)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)觀察值十分匹配。這表明，在涂覆有納米管的表面上移動(dòng)的微球，與在對(duì)照表面上流動(dòng)的微球具有相同的速度場；但是，由于大的粗糙元件的作用，而使它們處于不同的流線。在本實(shí)施例中，我們已證明，多水高嶺土涂覆層可顯著增強(qiáng)在流動(dòng)條件下選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞向微型管表面的粘附，且該細(xì)胞粘附特異性地由選擇素相互作用所介導(dǎo)(圖8及9)。隨著剪切力的增加，發(fā)現(xiàn)滾動(dòng)速度增加以及被捕獲細(xì)胞數(shù)目減少。這很可能是因?yàn)樵黾拥募羟辛鬟f更大的作用力，以對(duì)抗細(xì)胞沿表面滾動(dòng)時(shí)選擇素分子與其細(xì)胞表面配體間的結(jié)合。此外，發(fā)現(xiàn)滾動(dòng)速度曲線與納米管涂覆層的濃度具有密切的相關(guān)性，當(dāng)納米管涂覆層被持續(xù)稀釋后，滾動(dòng)速度變快(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，當(dāng)P-選擇素濃度低于2.5 yg/mL時(shí)，可觀察到細(xì)胞捕獲急劇降低(圖10)。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇素的表面密度較低時(shí)，涂覆有納米管的表面與對(duì)照表面間的滾動(dòng)速度存在巨大差異，且該滾動(dòng)速度的差異隨著選擇素表面密度的增加而減小(圖IB及C)。該現(xiàn)象可通過納米管涂覆層上的飽和效應(yīng)加以解釋。當(dāng)相對(duì)大尺寸的多水高嶺土納米管附著在表面上時(shí)，表面的總面積必然會(huì)增加，并提供更大的可吸收選擇素分子的面積。因此，對(duì)于給定的選擇素孵育濃度，在涂覆有納米管的表面上將會(huì)具有更加宏觀的表面選擇素密度。選擇素表面密度的增加將會(huì)導(dǎo)致滾動(dòng)速度隨之降低，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞會(huì)具有更大的結(jié)合平均數(shù)目，并需要破壞更多的結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的繼續(xù)滾動(dòng)。免疫熒光測試支持了該假設(shè)，納米粒涂覆的表面具有顯著更高的P-選擇素密度，且在P-選擇素孵育濃度最高時(shí)，該差異減小(圖6A)。需要注意的是，所使用的P-選擇素抗體特異性針對(duì)P-選擇素的糖識(shí)別域(CRD)，CRD為P-選擇素與細(xì)胞結(jié)合的區(qū)域。因此，該實(shí)驗(yàn)僅檢測那些能夠以適當(dāng)?shù)姆较蜻M(jìn)行結(jié)合的P-選擇素分子。
進(jìn)一步研究了表面上的粘附細(xì)胞的數(shù)目，以表征納米管涂覆層的影響。在所有條件下均觀察到捕獲的顯著增強(qiáng)。然而，隨著表面上的選擇素表面密度的增加，并未發(fā)現(xiàn)納米管涂覆層的影響如此前對(duì)滾動(dòng)速度那樣出現(xiàn)減弱。因此，由納米管導(dǎo)致表面積增加的簡單解釋不能完全說明該趨勢，因?yàn)楸砻嫔媳徊东@的細(xì)胞數(shù)目未出現(xiàn)飽和。對(duì)上述觀察到的現(xiàn)象的一種可能的解釋參考了已報(bào)道的納米管尺寸納米管的定位為從表面向外伸出，將選擇素分子進(jìn)一步向外伸出至流體面中(圖5A)。因?yàn)榱黧w潤滑力，當(dāng)細(xì)胞靠近壁時(shí)，其沉降時(shí)間值以1/5 (其中8是表面-表面分離距離)增加。因此，選擇素分子可能出現(xiàn)在接近表面的潤滑區(qū)域內(nèi)，而原本需要更多沉降時(shí)間才能接觸表面的流動(dòng)細(xì)胞則較早地被捕獲至表面并開始滾動(dòng)。因此，隨著選擇素孵育濃度的增加，更多的選擇素出現(xiàn)在流動(dòng)場內(nèi)，且細(xì)胞以更高的比率被捕獲。在平坦表面上加入更多選擇素并不會(huì)產(chǎn)生該現(xiàn)象，因此，多水高嶺土對(duì)捕獲細(xì)胞數(shù)目的影響并未減小。通過原子力顯微鏡研究表面上的納米管定向，發(fā)現(xiàn)納米管的確在表面上伸出數(shù)百納米(圖5B)。還發(fā)現(xiàn)，為在所有試驗(yàn)中制備均質(zhì)的溶液，開發(fā)了對(duì)多水高嶺土儲(chǔ)備溶液進(jìn)行處理的步驟，該步驟不會(huì)顯著改變納米管涂覆層的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，因?yàn)槟切┘{米管在表面上伸出相似的高度，并具有可比的表面峰密度(圖5C)。在兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)納米管涂覆層對(duì)微型管內(nèi)流體動(dòng)力學(xué)的影響，上述實(shí)驗(yàn)被設(shè)計(jì)為探究宏觀及微觀流動(dòng)行為。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過維持容器中的流體水平，將沿導(dǎo)管長度的壓差設(shè)定為恒定值，同時(shí)測定流速。隨后移動(dòng)容器至不同高度以產(chǎn)生不同的恒定壓差。觀察到涂覆有納米管的導(dǎo)管及對(duì)照導(dǎo)管的總體流速差異極小。研究了 2至15范圍內(nèi)的雷諾數(shù)，該范圍超出了粘附實(shí)驗(yàn)中所使用的流速范圍。其較好地分布于層流區(qū)內(nèi)，因而，認(rèn)為摩擦因子與表面粗糙度無關(guān)。因此，可以使用Hagan-Poiseuille方程式評(píng)估各導(dǎo)管中的流體流動(dòng)速度，并且與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較也證實(shí)了這一點(diǎn)(圖7A)。用于流經(jīng)導(dǎo)管的粘稠、不可壓縮流體的Hagan-Poiseuille層流方程式將壓差與流量進(jìn)行了如下的關(guān)聯(lián)AP 二如Lp(2)
Tir
其中AP是壓差、ii是流體的動(dòng)力學(xué)粘度、L是導(dǎo)管長度、Q是體積流量、而r是導(dǎo)管半徑。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中控制了 AP、U、及L，而且也發(fā)現(xiàn)Q在兩種導(dǎo)管中是相同的，因此我們可以得出兩種導(dǎo)管具有相等的水力學(xué)半徑。檢驗(yàn)了涂覆有納米管的導(dǎo)管中的微量流體動(dòng)力學(xué)，并將其與對(duì)照導(dǎo)管進(jìn)行比較。熒光微球的顯微鏡延時(shí)動(dòng)態(tài)視頻最初顯示，接近導(dǎo)管表面的流體動(dòng)力學(xué)是不同的，這是由于微球在涂覆有納米管的導(dǎo)管中比在對(duì)照導(dǎo)管中移動(dòng)更快的觀察結(jié)果。然而，既然之前已確定，總流體流動(dòng)對(duì)應(yīng)于具有或不具有納米管涂覆層的相同的導(dǎo)管直徑，對(duì)于該觀察結(jié)果的另一種解釋是，涂覆有納米管的導(dǎo)管中的微球在遠(yuǎn)離導(dǎo)管表面的流線上進(jìn)行移動(dòng)。沿著表面流動(dòng)的負(fù)浮力粒子接近表面的最近距離只能與表面上的最大粗糙度特征相同。當(dāng)考慮接近表面的微球的沉降速度時(shí)，這是顯而易見的。可通過Smart及Leighton所使用的針對(duì)Stokes定律的Brenner校正,對(duì)沉降速度進(jìn)行計(jì)算(Phys. Fluids A, 1989,1(1) :52-60)。F = 6 JI U a2Us A(3)·
其中Us是球體沉降速度，而\是校正項(xiàng)
4X = - sinh(a) x
-/V
/ n{n + I) ) 2sinh(2 + l)a + {In + l)sinli(2a)—,, = i ((2.n I) (2 + 3) Ja - (2n - I)2sinh2 (a))
(4)a = cosh—!(l+d) = ln(l +(5+ .7(5(2 + 3)) (5)通過進(jìn)行微球受力平衡、對(duì)較正阻力及凈浮力進(jìn)行平衡，預(yù)測沉降速度，即4/3 a3 A pg,在 5 = 505nm 時(shí)是 5 X 10_5nm/s,而在 6 = 30nm 時(shí)是 3 X lCT6nm/s?？紤]到微球以IO2-IO3 u m/s的數(shù)量級(jí)進(jìn)行移動(dòng)，且存在每10 y m I個(gè)數(shù)量級(jí)的粗糙度特征，預(yù)期微球?qū)⒁跃嚯x表面恒定的距離進(jìn)行移動(dòng)，該距離由最高粗糙度特征所確定。納米管伸入流體中的高度足以解釋微球在其上流動(dòng)的分離距離，并進(jìn)一步提供證據(jù)證明導(dǎo)管中的流體流動(dòng)場未被出現(xiàn)的納米管涂覆層所改變，而顆粒/細(xì)胞對(duì)流將會(huì)被改變(圖7C)。因此，導(dǎo)管中的切變率，以及通過Poiseuille定律所預(yù)測的導(dǎo)管表面上的剪切力，在給定的流速下與光滑面是等同的。既然導(dǎo)管半徑比微球大約150倍，且比特性參數(shù)8大約150倍，因此假設(shè)為平面構(gòu)造而產(chǎn)生的誤差是可忽略的。不同于之前一些關(guān)于納米顆粒對(duì)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)多水高嶺土納米顆粒是無毒的(圖4)。該發(fā)現(xiàn)，結(jié)合其對(duì)于白血病及上皮CTC捕獲的同等的增強(qiáng)作用，表明多水高嶺土納米管涂覆層提供了用于增強(qiáng)癌細(xì)胞捕獲的有效并實(shí)用的方法，并最終有望推動(dòng)個(gè)體化癌癥治療的可行性。雖然本發(fā)明通過特定的實(shí)施例進(jìn)行描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道，經(jīng)過常規(guī)的修改可得到各種不同的實(shí)施例。這些變化方式也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于細(xì)胞遷移的方法，所述方法包括以下步驟 a)提供其上固定有納米管的表面，所述納米管選自多水高嶺土、二氧化硅及氧化鈦，且所述納米管的外表面固定有細(xì)胞粘附分子；以及 b)在所述表面上流動(dòng)包含細(xì)胞混合物的流體，其中，與細(xì)胞表面不表達(dá)細(xì)胞粘附分子的配體的細(xì)胞相比，在細(xì)胞表面表達(dá)細(xì)胞粘附分子的配體的細(xì)胞呈現(xiàn)滾動(dòng)并因此以不同的速度進(jìn)行流動(dòng)，從而允許將表達(dá)配體的細(xì)胞與不表達(dá)配體的細(xì)胞分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述細(xì)胞粘附分子選自由選擇素、鈣粘素、整合素和GPlb，及其片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述選擇素選自由P-選擇素、L-選擇素及E-選擇素。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述流動(dòng)裝置的內(nèi)徑介于10-500微米以促進(jìn)靶細(xì)胞朝著裝置表面靠邊(margination)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述細(xì)胞混合物中的一種細(xì)胞是干細(xì)胞或癌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中步驟b)包括使細(xì)胞承受0.5至10dynes/cm2的剪切力。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述納米管是多水高嶺土納米管，且多數(shù)納米管具有500至1200nm的長度及40至200nm的直徑。
8.一種用于細(xì)胞遷移的裝置，所述裝置包含內(nèi)表面上固定有納米管的流體流動(dòng)腔，所述納米管選自多水高嶺土、二氧化硅及氧化鈦，并且所述納米管的外表面固定有細(xì)胞粘附分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其中在固定所述納米管之前，采用包含正電荷分子的組合物對(duì)腔體內(nèi)表面進(jìn)行涂覆。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其中所述正電荷分子是聚L-賴氨酸或鈦酸丁酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其中所述納米管是多水高嶺土納米管且多數(shù)納米管具有500nm至I. 2 y m的長度及40nm至200nm的直徑。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其中所述納米管插入所述流體流動(dòng)腔的內(nèi)腔至多I. 2iim的高度。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其中所述納米管插入所述流體流動(dòng)腔的內(nèi)腔至多小于900nm的高度。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞滾動(dòng)分子選自選擇素、鈣粘素、整合素和GPlb，及其片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述選擇素選自P-選擇素、L-選擇素及E-選擇素。
16.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其中所述納米管在所述內(nèi)腔中裝載遞送分子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的裝置，其中所述遞送分子是陽離子分子。
18.制備用于細(xì)胞遷移裝置的方法，所述方法包括如下步驟 a)提供流體流動(dòng)腔； b)提供納米管，所述納米管選自多水高嶺土、二氧化硅及氧化鈦，所述納米管基本上不含聚集物； C)將細(xì)胞粘附分子附著至所述納米管的所述外表面； d)將c)中的所述納米管附著至所述流體流動(dòng)腔的流動(dòng)表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于細(xì)胞遷移的裝置及方法。特別地，本發(fā)明涉及流動(dòng)表面上固定有納米管的流體流動(dòng)裝置。納米管的外表面具有支持細(xì)胞滾動(dòng)的分子。同時(shí)提供從混有不同細(xì)胞類型的混合物或從流體中分離一種細(xì)胞類型的方法，所述方法基于各種細(xì)胞類型在流動(dòng)表面上滾動(dòng)性質(zhì)的差異。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102762741SQ201080056107
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2010年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月8日
發(fā)明者安德魯·休斯, 邁克爾·R·金 申請(qǐng)人:康奈爾大學(xué)