專利名稱：Imp-3寡肽及包含它們的疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物科學領域，更具體的說是癌癥治療領域。具體而言，本發(fā)明涉及作為癌癥疫苗極為有用的新寡肽，以及用于治療和預防腫瘤的藥物。優(yōu)先權本申請要求2009年12月I日提交的美國臨時申請No. 61/265，657和2010年8月6日提交美國臨時申請No. 61/371，434的權益 ，通過述及將其全部內(nèi)容收入本文。
背景技術：
已經(jīng)證明，⑶8陽性CTL可識別主要組織相容性復合物(MHC) I類分子上出現(xiàn)的腫瘤相關抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細胞。從TAA的第一個例子一黑素瘤抗原(MAGE)家族被發(fā)現(xiàn)起，人們主要通過免疫學手段(NPL l:Boon T，Int J Cancer
1993May 8，54 (2) : 177-80; NPL 2:Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996MarI, 183(3) :725-9)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA。這些TAA中的一些目前正在作為免疫治療靶標接受臨床開發(fā)。能夠誘導強力且特異性的抗腫瘤免疫應答的新TAA的鑒定保證了針對各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的進一步開發(fā)，臨床考察正在進行(NPL 3, HarrisCC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20) : 1442-55; NPL 4, Butterfield LH etal., Cancer Res 1999 Jul 1，59 (13):3134-42;NPL 5,Vissers JL et al., CancerRes 1999 Nov 1，59 (21) : 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al. , J Immunol1996 May 1，156 (9) : 3308-14; NPL 7, Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct15, 57(20):4465-8;NPL 8，F(xiàn)ujie T et al. , Int J Cancer 1999Jan 18,80(2):169-72;NPL9, Kikuchi M et al. ,Int J Cancer 1999 May 5，81 (3):459-66;NPL 10，Oiso M etal. , Int J Cancer 1999 May 5，81 (3) : 387-94)。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)項使用這些腫瘤相關抗原衍生的肽進行臨床試驗的報告。不幸的是，迄今為止在這些癌癥疫苗試驗中只觀察到較低的客觀應答率(NPL Il1Belli F et al.，J Clin Oncol 2002 Oct15, 20(20):4169-80;NPL 12，Coulie PG et al. , Immunol Rev 2002 Oct, 188:33-42;NPL13，Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep, 10 (9) : 909-15)。因此，仍然需要鑒定能作為免疫治療靶的新TAA。為此目的，通過用含有23040種基因的全基因組cDNA微陣列進行的表達譜分析，鑒定了 MP_3(胰島素樣生長因子II mRNA結(jié)合蛋白3)為在肺癌和食道癌中上調(diào)的基因(NPL 14, T. Kikuchi et al. , Oncogene. 2003Apr 10;22(14):2192-205, PTL
1,W02004/031413, PTL 2, W02007/013665, PTL 3，TO2007/013671)。已經(jīng)觀察到頂P_3 在高于90%的癌癥患者的腫瘤細胞中的表達特異性地上調(diào)，但在除睪丸和胎盤外的其他正常生命器官中不表達。此外，已經(jīng)顯示在表達MP-3的癌細胞系中利用RNA干擾法下調(diào)MP-3表達可遏制細胞生長。在先申請W02006/090810描述了自MP_3(又稱K0C1)衍生的肽具有針對外源表達KOCl (IMP-3)和HLA-A24的腫瘤細胞的特異性的CTL誘導活性。雖然這些肽適用于HLA-A24型的患者，仍需要用于其他HLA型患者的CTL誘導肽。弓丨用表專利文獻[PTL 1]W02004/031413[PTL 2]W02007/013665[PTL 3]W02007/013671[PTL 4]W02006/090810非專利文獻
[NPL I]Boon T,Int J Cancer 1993 May 8, 54(2) :177-80[NPL 2]Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar I,183 (3):725-9[NPL 3]Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20):1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999 Jul I,59(13):3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999 Nov I, 59(21) :5554-9[NPL 6]van der Burg SH et al. , J Immunol 1996 May I, 156(9):3308-14[NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct 15, 57 (20):4465-8[NPL 8]Fujie T et al. , Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) :169-72[NPL 9]Kikuchi M et al. , Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :459-66[NPL 10]Oiso M et al. , Int J Cancer 1999 May 5,81 (3) :387-94[NPL IlJBelli F et al. , J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20):4169-80[NPL 12]Coulie PG et al. , Immunol Rev 2002 Oct, 188:33-42[NPL 13]Rosenberg SA et al. , Nat Med 2004 Sep, 10(9):909-15[NPL 14]T.Kikuchi et al. , Oncogene. 2003 Apr 10;22 (14):2192-20
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地基于新的免疫治療靶標的發(fā)現(xiàn)。由于TAA通常被免疫系統(tǒng)識別為“自身”并因此往往沒有天然免疫原性，合適的靶標的發(fā)現(xiàn)是極為重要的。意識到MP-3已經(jīng)被鑒定為在癌癥如肺癌和食道癌中上調(diào)，本發(fā)明以頂P-3蛋白(SEQ ID NO:22)作為進一步分析的目標，該蛋白由 GenBank Accession No. NM_006547. 2 (SEQ ID N0:21)的基因編碼。具體地，選擇了含有可誘發(fā)針對相應分子特異性的強度驚人的CTL應答的表位肽的MP-3基因產(chǎn)物來進行研究。在本發(fā)明的語境中，使用本發(fā)明的肽刺激了從健康供體獲得的外周血單個核細胞(PBMC)。建立了特異性地識別用相應的肽沖激過的HLA-A2(A*0201)陽性靶細胞的CTL，并鑒定了以及能夠誘導針對腫瘤細胞表面上表達的MP-3的強而特異性的免疫應答的HLA-A2(A*0201)限制性表位肽。綜合起來，這些結(jié)果顯示頂P_3有強免疫原性，而且它的表位是腫瘤免疫療法的有效靶標。因此，本發(fā)明的一個目的是提供具有CTL誘導能力以及選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列的寡肽。此外，本發(fā)明涵蓋修飾肽，具有SEQ ID N0:l、3、5或6的氨基酸序列，其中一個、兩個或數(shù)個氨基酸通過選自替換、缺失、插入和添加的至少一種突變方式而被突變或改變，只要所得的修飾寡肽保留原始肽的CTL誘導能力。當被施用于受試者時，本發(fā)明的寡肽被呈遞于抗原呈遞細胞的表面上，從而誘導出靶向相應肽的CTL。因此，本發(fā)明的一個目的是提供呈遞任何本發(fā)明肽的抗原呈遞細胞及外來體，以及用于誘導與之相關的抗原呈遞細胞的方法。通過施用本發(fā)明的MP-3寡肽或編碼所述寡肽的多核苷酸，以及呈遞此類MP-3寡肽的外來體和抗原呈遞細胞，誘導出抗腫瘤免疫應答。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供含有所述寡肽或編碼它們的多核苷酸、以及相關的外來體和抗原呈遞細胞作為其活性成分的藥劑或藥物組合物。本發(fā)明的藥劑或藥物組合物尤其可以用作疫苗。本發(fā)明的另一個目的是提供用于選自治療、預防(即防范)癌癥(腫瘤)，以及防范它們的手術后復發(fā)中的至少一種目的的方法，以及用于誘導CTL的方法、用于誘導抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括對受試者施用本發(fā)明的MP-3寡肽、編碼MP-3寡肽的多核苷酸、呈遞MP-3多肽的外來體或抗原呈遞細胞，或藥劑或藥物組合物的步驟。此外，本發(fā)明的CTL還可以用作抗癌癥疫苗。目標癌癥的例子包括，但不限于，肺癌和食道癌。更具體地說，本發(fā)明提供了下述

[I], 一種分離的寡肽，其包含選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列，[2], 一種分離的寡肽，其包含選自SEQ ID NO: 1、3、5和6的氨基酸序列，其中替換、缺失、插入和/或添加了 I個、2個或數(shù)個氨基酸，且其中所述寡肽具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力，[3], [2]的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者(a)從N端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和(b) C端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸，[4],分離的多核苷酸，其編碼[1]_[3]中任一項的肽，[5],通過使用如[1]_[3]中任一項所述的寡肽來誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞的方法，[6], [5的方法，其中所述方法包括選自下組的步驟(a)使抗原呈遞細胞與[1]_[3]中任一項的寡肽接觸，和(b)將編碼[1]_[3]中任一項的寡肽的多核苷酸導入抗原呈遞細胞，[7], [5]或[6]的方法，其中所述抗原呈遞細胞在其表面上表達至少一種HLA-A2抗原，[8],通過使用如[1]_[3]中任一項所述的寡肽來誘導CTL的方法，[9], [8]的方法，其中所述方法包括選自下組的步驟(a)使⑶8-陽性T細胞接觸在其表面上呈遞[1]-[3]中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的抗原呈遞細胞和/或外來體；和(b)向⑶8-陽性T細胞中導入編碼能夠形成T細胞受體(TCR)亞單位的多肽的多核苷酸，所述亞單位結(jié)合抗原呈遞細胞表面上的[1]_[3]中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物，[10]. [9]的方法，其中所述HLA抗原為HLA-A2，[11], 一種分離的CTL，其靶向[1]_[3]中任一項的寡肽，[12]. [11]的CTL，其中所述CTL能夠結(jié)合細胞表面上[1]-[3]中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物，[13]. [12]的 CTL，其中所述 HLA 抗原為 HLA-A2，
[14].分離的CTL，其是通過使用[1]_[3]中任一項的寡肽誘導的，[15], [14]的CTL，其中所述CTL是通過[8_10中任一項的方法誘導的，[16]. —種分離的抗原呈遞細胞，該細胞在其表面呈遞HLA抗原與[1]-[3]中任一項的寡肽的復合物，[17]. [16]的抗原呈遞細胞，其中所述HLA抗原是HLA-A2，[18], [16]或17的抗原呈遞細胞，其中所述抗原呈遞細胞是通過[5]_[7]中任一項的方法誘導的，[19]. 一種在受試者中誘導針對癌癥的免疫應答的方法,包括對所述受試者施用疫苗的步驟，所述疫苗包含選自下組的至少一種活性成分
(a) 一種或多種[1]_[3]中任一項所述的寡肽，或其免疫學活性片段；(b) 一種或多種編碼[1]_[3]中任一項所述的寡肽或其免疫學活性片段的多核苷酸；(c) 一種或多種[II]-[15]中任一項的分離的CTL ；(d) 一種或多種[16]或[18]的分離的抗原呈遞細胞，[20], [19]的方法，其中所述受試者是HLA-A2陽性的，[21]. —種用于治療和/或預防癌癥和/或防止其手術后復發(fā)的藥劑，其中該藥劑包含可藥用擔載體以及選自下組的至少一種活性成分(a) 一種或多種[1]_[3]中任一項所述的寡肽，或其免疫學活性片段；(b) 一種或多種編碼[1]_[3]中任一項所述的寡肽或其免疫學活性片段的多核苷酸；(c) 一種或多種在其表面上呈遞[1]_[3]中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的抗原呈遞細胞；(d) 一種或多種能夠結(jié)合細胞表面上[1]_[3]中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的CTL，[22]. —種用于誘導CTL的藥劑，其中該藥劑包含可藥用擔載體以及選自下組的至少一種活性成分(a) 一種或多種[1]_[3]中任一項所述的寡肽，或其免疫學活性片段；(b) 一種或多種編碼[1]_[3]中任一項所述的寡肽或其免疫學活性片段的多核苷酸；(c) —種或多種在其表面上呈遞[1]_[3]中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的抗原呈遞細胞，[23]. [21]或[22]的藥劑，其中所述藥劑配制為用于對HLA-A2陽性的受試者施用，[24]. [21]-[23]中任一項的藥劑，其是疫苗，[25] 選自下組的活性成分(a) 一種或多種[I]_[3]中任一項所述的寡肽；(b) 一種或多種處于可表達形式的編碼[1]_[3]中任一項所述的寡肽的多核苷酸；(c) —種或多種在其表面上呈遞[1]_[3]中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的抗原呈遞細胞；(d) 一種或多種能夠結(jié)合細胞表面上[1]_[3]中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的CTL在制備用于治療癌癥的藥物組合物或藥劑中的用途，[26]. [25]的用途，其中所述藥物組合物或藥劑配制為用于對HLA-A2陽性的受試者施用，[27]. —種包含選自SEQ ID NO: 1、3、 5和6的氨基酸序列的分離的寡肽，其用于在HLA-A2陽性的受試者中治療和/或預防癌癥，和/或預防其手術后復發(fā)，[28]. —種分離的寡肽，其包含選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列，其中替換、缺失、插入和/或添加了 I個、2個或數(shù)個氨基酸，且其中所述寡肽具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力，用于在HLA-A2陽性的受試者中治療和/或預防癌癥，和/或預防其手術后復發(fā)，[29], [28]的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者(a)從N端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和(b) C端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。除了上述之外，在聯(lián)系附圖
和實施例閱讀下面的詳細說明時，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應當理解，前面的發(fā)明概要和后面的詳細說明都僅僅提出了示例性的實施方案，并不對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替換實施方案構(gòu)成限制。尤其是，雖然在本文中就若干具體的實施方案對本發(fā)明進行了說明，應當理解這些描述對本發(fā)明而言是示例說明性的，不解釋成對本發(fā)明的限制。在不背離如隨附的權利要求所描述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下本領域技術人員將容易地想到本發(fā)明的多種修改和應用。類似地，本發(fā)明的其它目的、特征、好處和優(yōu)勢是從此處的概要和下文描述的特定實施方案可以容易地想到的，并且是本領域技術人員可以顯見的。根據(jù)上文的內(nèi)容并結(jié)合隨附的實施例、數(shù)據(jù)、附圖以及從中能夠合理推斷的內(nèi)容，或者進一步考慮本文中引用的參考文獻，這樣的目的、特征、好處和優(yōu)勢是容易想到的。附圖簡述本領域技術人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案的詳細說明后將清楚地得知本發(fā)明的各個方面的應用。[圖I]圖I描述了對在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導的CTL進行的IFN-YELI SPOT測定的結(jié)果。與對照相比，用肽(SEQ ID N0:3，5和6)刺激的CTL顯示了強的IFN-Y產(chǎn)生應答(上部小圖)。誤差棒代表標準偏差(SD)。統(tǒng)計學顯著的差異用星號表示(*P〈0. 05)。還顯示了三復孔的ELISP0T計數(shù)的示例性照片(下部小圖)。CTL響應于用SEQ ID NO:6的肽沖激的BM-DC顯示了 203-226個點/孔(左側(cè)小圖)，而它們在沒有負載肽的BM-DC的存在下顯示74-105個點/孔(右側(cè)小圖)。[圖2]圖2由一系列描繪對健康供體I的人CTL進行的IFN-y EU SPOT測定結(jié)果的條形圖組成。用SEQ ID NO: 1、3、5、和6的肽刺激的人CTL針對用關聯(lián)肽沖激的T2細胞與用無關的HIV肽沖激的T2細胞相比顯示了強的IFN-Y產(chǎn)生應答(P〈0. 05)。誤差棒表示SD0[圖3]圖3由一系列分布圖⑷和線圖⑶組成，描繪了從HLA-A2陽性肺癌患者和健康供體的⑶8+T細胞誘導MP-3特異性人CTL的情況。(A)部分呈現(xiàn)通過FACS (熒光活化細胞分選機)分析來檢測用SEQ ID NO: 1、3或6的肽刺激后的健康供體I或肺癌患者I的人CTL的細胞表面上⑶107a的表達的結(jié)果。將用肽刺激的CTL用FITC(異硫氰酸螢光素)綴合的抗CD107a抗體(上部小圖)或作為對照的FITC綴合的抗小鼠IgGl (中間小圖)染色。作為刺激的陰性對照，用HIV肽刺激CTL并用FITC綴合的抗CD107a抗體染色(下部小圖)。當用SEQ ID NO: 1、3或6的肽刺激CTL時，與對照相比，在CTL上檢測到了⑶107a的表達。(B)部分描繪了 MP-3特異性CTL針對用關聯(lián)的MP-3衍生肽沖激的T2細胞的細胞毒性。51Cr釋放測定中CTL針對用SEQ ID NO: I的肽(空心三角，左部和中部小圖)或用SEQ ID NO:6的肽(空心三角，右部小圖)沖激的T2細胞，以及用無關的HIV-A2肽(實心三角)沖激的T2細胞的細胞毒性。每個值代表基于一式三份重復測定的平均值計算的特異性裂解百分比。[圖4]圖4由一系列條形圖(A)和線圖⑶組成，描繪從三名肺癌患者的PBMC誘導MP-3特異性CTL的情況。(A)部分描繪了從患者14的PBMC通過用SEQ ID NO: 5的肽刺激的CTL、以及從患者103的PBMC用SEQ ID NO:6的肽刺激而誘導的CTL針對用關聯(lián)肽沖激的T2細胞相比于用無關HIV肽沖激的T2細胞顯示了顯著的IFN-Y產(chǎn)生。統(tǒng)計學上顯著的差異用星號表示(*P〈0. 05)。誤差棒表示SD。(B)部分描繪，用SEQ ID NO:3的肽從肺癌患者4的PBMC誘導的CTL針對用關聯(lián)肽沖激的T2細胞相比于無關HIV肽沖激的T2細胞顯示了細胞毒活性。[圖5A-C]圖5由一系列線圖組成，描繪了使用CTL和內(nèi)源表達IMP-3的腫瘤細胞系的51Cr釋放測定的結(jié)果。(A)部分呈現(xiàn)了從健康供體2的PBMC通過使用SEQ ID NO: I、
3、5和6的肽刺激而誘導的CTL的細胞毒活性。這些CTL針對PANC-I (IMP-3+，HLA-A2+)顯示了細胞毒活性，但針對MCF7 (MP-3-，HLA-A2+)和A549 (IMP-3+, HLA-A20不顯示細胞毒活性。(B)部分呈現(xiàn)對于從肺癌患者14的PBMC通過用SEQ ID NO: 3和5的肽刺激而誘導的CTL、以及從患者4的PBMC通過用SEQ ID NO:6的肽刺激而誘導的CTL，通過51Cr釋放測定檢測到了細胞毒活性。這些CTL針對PANC-I (IMP-3+，HLA-A2+)顯示了細胞毒活性，但針對MCF7 (MP-3-，HLA-A2+)和A549 (IMP-3+, HLA-A20不顯示細胞毒活性。(C)部分呈現(xiàn)了通過51Cr釋放測定分析的MP-3特異性CTL針對MCF7/MP3 (空心圓圈，頂P-3基因轉(zhuǎn)染的MCF7細胞)或MCF7細胞(實心圓圈)的細胞毒活性。[圖5D]⑶部分呈現(xiàn)了通過51Cr釋放測定分析的MP-3特異性CTL針對SW620(空心三角)、SKH印I (空心菱形)、MCF7 (實心三角)或A549 (實心菱形)的細胞毒活性。從健康供體通過用SEQ ID NO: I的肽或SEQ ID NO:6的肽刺激而產(chǎn)生的CTL系針對SW620、31(拖？1顯示了細胞毒活性，但針對4549 011^42-，IMP-3+)或MCF7細胞(HLA-A2+，IMPSl貝丨J不然。[圖6A-B]圖6由一系列條形圖(A、B、D)和線圖(C)組成，描繪了抗-HLAI類單抗(W6/32，IgG2a)或抗-HLA-A2單抗對CTL應答的抑制。通過IFN- y EU SPOT測定檢測了從肺癌患者14的PBMC通過用SEQ ID NO: 1、3、5和6的肽刺激而誘導的CTL活性(A)。由CTL介導的IFN- y產(chǎn)生被W6/32顯著抑制，而用抗-HLA-DR單抗處理未檢出IFN- y產(chǎn)生的抑制(H-DR-1，IgG2a)。誤差棒表示SD。統(tǒng)計學上顯著的差異用星號表示(*P〈0. 05)。標示了由CTL介導的IFN-Y產(chǎn)生⑶和細胞毒性(C和D)?？招膱A圈，PANCl ;實心圓圈，、PANC1+W6/32 ;方形，PANCl+對照單抗。條形表示當生成的CTL系與PANCl (空心條形)、PANCl+對照單抗(空心條形)或PANCl+封閉單抗(實心條形)共溫育時的IFN- y生成(B)或細胞毒性(D)。顯示了來自結(jié)果相似的兩次獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。(B)中統(tǒng)計學顯著的差異用星號標示。
[圖6C-D]圖6C-D是圖6A-B的繼續(xù)。實施方案的描述現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，不過在實施或檢驗本發(fā)明的實施方案時可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解本發(fā)明不限于特定大小、性狀、尺度、材料、方法學、方案等，因為它們可因循例行實驗和優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康模且鈭D限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權利要求來限制。通過提述明確地將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開文本。如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實例僅為舉例說明而不構(gòu)成限制。I.定義如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非
另有明確說明。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在型殘基(諸如相應的天然存在型氨基酸的人工化學模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在型氨基酸聚合物。本說明書中有時使用的術語“寡肽”用于指長度為20個殘基或更少，典型地為15個殘基或更少的本發(fā)明的肽，通常由約8個-約11個殘基，經(jīng)常為9個或10個殘基組成。在本說明書全文中，術語“肽”以與術語“寡肽”相同的意義使用，除非另有特別指明。如本文中使用的，術語“氨基酸”指天然存在型和合成型氨基酸，以及具有與天然存在型氨基酸相似的功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在型氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和0-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在型氨基酸具有相同的基礎化學結(jié)構(gòu)(a碳與氫、羧基、氨基、和R基團結(jié)合)但具有經(jīng)過修飾的R基團或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學化合物。氨基酸在本文中可以通過它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來指稱。術語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中除非另有明確說明可互換使用，而且與氨基酸類似地通過它們普遍接受的單字母代碼來指稱。術語“(作用)劑”和“組合物”在本文中可以互換使用，指包含規(guī)定量的規(guī)定成分的產(chǎn)品，以及通過所述規(guī)定量的規(guī)定成分的組合直接或間接得到的任何產(chǎn)品。這些術語結(jié)合修飾詞“藥物”或“藥”(pharmaceutical)意在涵蓋包括活性成分以及任何組成擔載體的惰性成分的產(chǎn)品，以及通過所述任何兩種或更多種成分的組合、復合或聚集，或通過一種或多種成分的其他類型的反應或相互作用而直接或間接得到的任何產(chǎn)品。相應地，在本發(fā)明的語境中，術語“藥劑”或“藥物組合物”可互換地用于指任何通過混合本發(fā)明的產(chǎn)品與藥學或生理學上可接受的擔載體而制備的作用劑、物質(zhì)或組合物。本文中所用的短語“藥學上可接受的擔載體”或“生理學上可接受的擔載體”意思是藥學上或生理學上可接受的材料、組合物、物質(zhì)或媒介，包括但不限于擔載或運輸主題的支架藥效團從一個器官或身體部分到另一個器官或身體部分所涉及的液體或固體填充劑、賦形劑、溶劑或包埋材料。本發(fā)明的藥劑或藥物組合物具體可用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(又稱“免疫原性組合物”)是指在接種到動物中時具有誘導抗腫瘤免疫的功能的物質(zhì)。術語“活性成分”在本文中意指作用劑或組合物中具有生物學活性或生理學活性的物質(zhì)。尤其是，在藥劑或藥物組合物中，“活性成分”是指顯示客觀的藥理學效果的物質(zhì)。例如，在用于治療或預防癌癥的藥劑或藥物組合物的場合，作用劑或組合物中的活性成分可直接或間接地導致對于癌細胞的至少一種生物學或生理學作用。優(yōu)選地，這樣的作用包括減少或抑制癌細胞生長、破壞或殺死癌細胞和/或癌組織，等等。典型地，活性成分的間 接效果是誘導可識別或殺死癌細胞的CTL。在配制之前，“活性成分”又稱“原料藥” (bulk)、“藥物物質(zhì)” (drug substance)或“技術產(chǎn)品” (technical product)。除非另有定義，術語“癌癥”指過表達MP-3基因的癌癥，過表達MP-3的癌癥的實例包括但不限于肺癌和食道癌。除非另有定義，術語“細胞毒性T淋巴細胞”、“細胞毒性T細胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細胞(例如腫瘤細胞、病毒感染的細胞)并誘導此類細胞死亡的T淋巴細胞亞群。除非另有定義，如本文中所用的術語“試劑盒”是指試劑及其他材料的組合?？紤]術語“試劑盒”可包括微陣列、芯片、標記物、等等。術語“試劑盒”不意圖限于某種特定的試劑和/或材料組合。如本文中使用的，在受試者或者患者的語境中，短語“HLA-A2陽性”是指受試者或患者純合地或者雜合地擁有HLA-A2抗原基因,且HLA-A2抗原在受試者或患者的細胞中作為HLA抗原表達。以本發(fā)明的方法和組合物在“治療”癌癥的語境中有用為限，如果治療導致臨床上的收益，例如受試者體內(nèi)IMP-3基因表達的減少、或者癌癥的尺寸、普遍性(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力的降低，則認為治療是“有效的”。當預防性地進行治療時，“有效的”意思是其阻礙或阻止癌癥的形成，或者阻止或減輕癌癥的臨床癥狀?！坝行浴苯Y(jié)合用于診斷或治療特定癌癥種類的任何已知方法來確定。以本發(fā)明的方法和組合物可用于癌癥的“預防”和“防范”的語境為限，此類術語在本文中可互換使用，指降低緣于疾病的死亡率或發(fā)病率負擔的任何活動。預防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預防水平”。一級預防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預防和防范水平涵蓋旨在預防和防范疾病的進展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復功能和減輕疾病相關并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負面影響的活動。或者，預防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等)的廣泛的預防性療法。
在本發(fā)明的語境中，治療和/或預防癌癥和/或預防其手術后復發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術去除癌細胞、抑制癌性細胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導癌癥減退和阻抑癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預防可降低患癌個體死亡率及改善其預后，降低其血液中腫瘤標志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預防，包括10%、20%、30%或更多降低，或?qū)崿F(xiàn)病情穩(wěn)定。如本文中使用的，術語“抗體”意圖包括可以與指定的蛋白或其肽特異性反應的免疫球蛋白及其片段。抗體可以包括人抗體、靈長源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標記物融合的抗體、和抗體片段。另外，在本文中，抗體以最廣義使用，具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學活性。“抗體”指示所有類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。II. At 為了證明來源于MP-3的肽發(fā)揮被細胞毒性T淋巴細胞(CTL)所識別的抗原的功能，對來源于頂P_3(SEQ ID N0:22)的肽進行了分析以確定它們是否為HLA-A2 (例如A*0201和A*0206)限制性的抗原表位，HLA-A2是經(jīng)常遇到的HLA等位基因(Date Y et al. , Tissue Antigens 47:93-101，1996;Kondo A et al. , J Immunol155:4307-12, 1995; Kubo RT et al. , J Immunol 152:3913-24,1994)。基于它們對 HLA-A2的結(jié)合親和力，鑒定了來源于MP-3的HLA-A2結(jié)合肽的候選者。用加載了這些肽的樹突細胞(DC)體外刺激T細胞后，使用每個肽，尤其是SEQ ID勵:1、3、5和6，成功地建立了(11。這些建立的CTL針對經(jīng)相應肽沖激的靶細胞，以及表達HLA_A*0201和MP_3的細胞顯示強且特異性的CTL活性。本文中的這些結(jié)果證明MP-3是被CTL識別的抗原，且這些肽可能是頂P-3的受HLA-A2 (如A*0201和A*0206)限制的表位肽。由于IMP-3基因在大多數(shù)癌癥組織(例如肺癌和食道癌)中過表達，它是良好的免疫治療靶標。因此，本發(fā)明提供對應于IMP-3的被CTL識別的表位的寡肽，諸如九肽(由九個氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個氨基酸殘基組成的肽)。本發(fā)明的寡肽的特別優(yōu)選的例子包括那些具有選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列的肽。一般而言，目前可以通過互聯(lián)網(wǎng)訪問的軟件程序,如Parker KC et al. , J Immunol
1994Jan 1，152 (I) : 163-75等中描述的那些，可以用來在計算機上計算不同肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。與HLA抗原的結(jié)合親和力可以按照例如Parker KC et al. , J Immunol1994Jan 1，152 (I) : 163-75 和 Kuzushima K et al. , Blood 2001，98 (6) : 1872-81 中描述的那樣進行測定。用于測定結(jié)合親和力的方法在例如Journal of Immunological Methods,
1995,185:181-190. ;Protein Science, 2000，9:1838-1846 中有描述。因此，本發(fā)明涵蓋通過這些已知程序被確定為可與HLA抗原結(jié)合的MP-3的肽。此外，本發(fā)明的這些寡肽的側(cè)翼可以具有額外的氨基酸殘基，只要所述肽保持其CTL誘導能力即可。這樣的具有CTL誘導能力的肽典型地少于約40個氨基酸，經(jīng)常少于約20個氨基酸，通常少于約15個氨基酸。本發(fā)明的寡肽(例如由選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列組成的寡肽)的側(cè)翼的氨基酸序列沒有限制，可以由任何種類的氨基酸構(gòu)成，只要其不損害原來的肽的CTL誘導能力。因此，本發(fā)明還提供具有CTL誘導能力和選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列的肽。一般而言，蛋白質(zhì)中一個、兩個、或更多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能，或者在有些情況下甚至會增強原蛋白質(zhì)的期望功能。事實上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中修飾(即替換、缺失、添加和/或插入)一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基而成的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學活性(Mark et al.，Proc Natl Acad SciUSA 1984, 81:5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500;Dalbadie-McFarland et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的寡肽可既具有CTL誘導能力，又具有選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列中添加、插入、缺失、和/或替換一個、兩個或數(shù)個氨基酸而得到的氨基酸序列。
本領域技術人員認可，改變氨基酸序列中的單個氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的個別添加或替換往往會導致原始氨基酸側(cè)鏈的特性得以保留。因此，它們常規(guī)上稱作“保守替換”或“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變導致具有與原始蛋白質(zhì)類似的性質(zhì)和功能的修飾蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保守替換表是本領域公知的。期望保留的氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R, D, N，C，E, Q, G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能團或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A, V，L, I, P);含羥基側(cè)鏈(S，T，Y);含硫原子側(cè)鏈(C, M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N，E，Q);含堿側(cè)鏈(R，K，H);和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組各自含有本領域公認互為保守替換的氨基酸I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守修飾，只要該肽保留原始肽的CTL誘導能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應排除MP-3的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導CTL的肽。為了保持所需的CTL誘導能力，可以修飾(插入、刪除、添加和/或替換)少數(shù)(例如，I個、2個或數(shù)個)或小百分比的氨基酸。這里，術語“數(shù)個”意指5個以下的氨基酸，如3個以下。要被修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選為20%以下，更優(yōu)選15%以下，進一步更優(yōu)選10%以下或1-5%。當在免疫療法的語境中使用時，本發(fā)明的肽應呈遞在細胞或外來體的表面上，優(yōu)選作為與HLA抗原的復合物。因此，優(yōu)選選擇不僅誘導CTL而且擁有對HLA抗原的高結(jié)合親和力的肽。為此，可通過替換、插入、缺失和/或添加氨基酸殘基來對肽進行修飾，產(chǎn)生具有改良的結(jié)合親和力的修飾肽。除了天然被展示的肽之外，由于已經(jīng)知道通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics 1995, 41:178; JImmunol 1994，155:4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原性肽。
例如，為了增加HLA-A24結(jié)合親和力，理想的是將自N端起的第二個氨基酸替換為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或?qū)末端氨基酸替換為纈氨酸或亮氨酸。因此，具有SEQ IDNO: 1、3、5和6的氨基酸序列，其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的自N端起的第二個氨基酸被替換為亮氨酸或甲硫氨酸和/或其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的C端被替換為纈氨酸或亮氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替換，而且可以在肽的潛在TCR識別位置處引入替換。數(shù)項研究已證明了肽中的氨基酸替換可等同于或好于原來，例如CAPl、p53(264_272)、Her-2/neu(369-377)或 gplOO(209_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T.K. Hoffimann et al. J Immunol. (2002) Feb I; 168 (3) : 1338-47. , S. 0. Dionne etal.Cancer Immunol immunother. (2003)52:199-206及 S. 0. Dionne et al. Cancer Tmmunology, Immunotherapy(2004)53, 307-314)。本發(fā)明還考慮向本文中公開的序列添加氨基酸。例如，還可以向本發(fā)明的肽的N 和/或C端添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸。此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導能力的修飾肽也包含在本發(fā)明之內(nèi)。然而，當肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時，可能誘導副作用，諸如自身免疫性病癥和/或針對特定物質(zhì)的變應性癥狀。因此，優(yōu)選的是，首先利用可用的數(shù)據(jù)庫實施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當根據(jù)同源性搜索清楚了即使與目標肽相比僅相差I個或2個氨基酸的肽亦不存在時，可以修飾目標肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導能力，而沒有任何發(fā)生此類副作用的危險。雖然預期如上所述的對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽是高度有效的，但還是對根據(jù)高結(jié)合親和力的存在為指標選出的候選肽檢查了 CTL誘導能力的存在。這里，短語“CTL誘導能力”指肽被呈遞到抗原呈遞細胞上時誘導細胞毒性淋巴細胞(CTL)的能力。另 外，“CTL誘導能力”包括肽誘導CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細胞、和提高CTL IFN-y生成的能力。CTL誘導能力的確認如下來實現(xiàn)，誘導攜帶人MHC抗原的抗原呈遞細胞(例如B-淋巴細胞、巨噬細胞、和樹突細胞(DC))，或者更具體地說，來源于人外周血單核白細胞的DC，并且在用肽刺激后，與CD8-陽性細胞混合，然后測量由CTL針對靶細胞生成和釋放的IFN-Y。作為反應系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如BenMohamedL, Krishnan R, Longmate J, Auge C，Low L,Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000Aug,61(8):764-79, Related Articles,Books, Linkout Induction of CTL response bya minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLAclass II restricted T(H)response中描述的那些)。例如,可以用51Cr等放射性標記革巴細胞，并且可以自靶細胞釋放的放射性計算細胞毒性活性?；蛘?，CTL誘導能力可以如下評估測量在攜帶固定化肽的抗原呈遞細胞(APC)存在下由CTL生成和釋放的IFN- y，并使用抗IFN-Y單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。作為如上所述檢查肽的CTL誘導能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)具有高的HLA抗原結(jié)合親和力的肽不一定具有高的CTL誘導能力。然而，在被鑒定和評估的那些肽中，選自具有如SEQ IDNO: 1、3、5和6所示的氨基酸序列的肽的寡肽被發(fā)現(xiàn)不但具有對HLA抗原的高親和力，還具有特別高的CTL誘導能力。因此，例舉這些肽為本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。除上文所述修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它物質(zhì)，只要所得的連接肽保留原始肽的必需的CTL誘導能力。合適物質(zhì)的例子包括但不限于肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天然的和合成的聚合物、等。肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破壞原始肽的生物學活性。可實施這些種類的修飾以賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)或使多肽穩(wěn)定。例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽。可以以多種方式測定多肽的穩(wěn)定性。例如，可使用肽酶和各種生物學介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef etal. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。此外，本發(fā)明的肽可以藉由間隔物(spacers)或接頭(linker)與其他的肽相 連。所述其他的肽的例子包括但不限于從其他TAA衍生的能誘導CTL的肽?；蛘撸瑑蓚€或更多個本發(fā)明的肽可以藉由接頭或間隔物連接起來。這些由間隔物或接頭連接起來的肽可以是彼此相同或不同的。接頭或間隔物的種類沒有特殊限制，包括由肽構(gòu)成者，更優(yōu)選的是由具有一個或多個能夠被酶(如肽酶、蛋白酶和蛋白酶體等)切割的切割位點的肽構(gòu)成者。接頭或間隔物的例子包括但不限于AAY(P. M. Daftarian et al. , J Trans Med2007，5:26)，AAA, NKRK (R. P. M-SutmulIer et al. , J Immunol. 2000，165:7308-7315)或一個到數(shù)個賴氨酸殘基(S. Ota et al. , Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al. , JImmunol. 2002, 168:5709-5715)。本發(fā)明的肽涵蓋藉由間隔物或接頭與其他的肽相連而成的肽。當本發(fā)明的肽包含半胱氨酸殘基時，肽傾向于通過半胱氨酸殘基的SH基團之間的二硫鍵形成二聚體。因此，本發(fā)明的肽的二聚體也包括在本發(fā)明的肽之內(nèi)。本文中，本發(fā)明的肽也可以記為“MP-3肽”、“MP-3多肽”或“MP-3寡肽”。HL IMP-3 肽的制備本發(fā)明的肽可使用公知技術來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術或化學合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或合成為由兩個或更多個肽構(gòu)成的較長多肽。然后可以分離，即純化或分離所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主細胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學物質(zhì)。本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破壞原始肽的生物學活性。其他示例性的修飾包括摻入D-氨基酸或其他可用的氨基酸模擬物，以便例如增加肽的血清半壽期?？梢愿鶕?jù)選定的氨基酸序列，借助化學合成來獲得本發(fā)明的肽。可適用于合成的常規(guī)肽合成法的例子包括但不限于(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976 ；(iii) Peptide Synthesis (日文)，Maruzen Co. , 1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文),MaruzenCo.,1985 ；(v) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol. 14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67288 ;和(vii)Barany G. & Merrifield R. B.，Peptides Vol. 2，" Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York，1980，100-118?；蛘撸蓱萌魏我阎倪z傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如Morrison J, J Bacteriology 1977,132:349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods inEnzymology (eds. Wu et al.) 1983，101:347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達形式(例如處于相當于啟動子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)化入合適的宿主細胞。然后培養(yǎng)宿主細胞以生成感興趣的肽。也可以釆用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。IV.多核苷酸
本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括源自天然存在型MP-3/KIF20A 基因(GenBank Accession No. NM_006547. 2 (SEQ ID N0:21))的多核苷酸以及具有它們的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，對于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領域普通技術人員會認識到，核酸中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)都可以被修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一種所公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構(gòu)成。本領域公知，DNA由堿基諸如天然存在的A、T、C、和G合適地構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。本領域技術人員會意識到多核苷酸也會包括非天然存在的堿基。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，其中它們之間有或無居間氨基酸序列存在。例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(例如酶識別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標志基因等等的表達載體(質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術操作多核苷酸來制備，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。重組和化學合成技術都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細胞后能表達的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘?，可借助PCR技術或通過在合適宿主中的表達來擴增多核苷酸(參見例如Sambrook et al. , MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1989)。或者，可使用固相技術來合成多核苷酸，如Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron1992，48:2223-311;Matthes et al. , EMBO J 1984，3:801-5 中記載的。含有本發(fā)明的多核苷酸的載體以及攜帶所述載體的宿主細胞也包含在本發(fā)明之內(nèi)。V.夕卜來體(exosomes)本發(fā)明進一步提供了稱作外來體的細胞內(nèi)囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復合物。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報平11-510507和W099/03499中詳細描述的方法來制備，并可以用從治療和/或預防所針對的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外來體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進行接種。復合物中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預防的受試者的類型匹配。使用在日本人和白種人中高表達的HLA-A2型有利于獲得有效的結(jié)果，且可以使用HLA-A2(A*0201和A*0206)等亞型。典型的，在臨床上，預先考察需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠合適地選擇對這種抗原具有高水平的結(jié)合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的CTL誘導能力的肽。此外，為了獲得具有高結(jié)合親和力和CTL誘導能力二者的肽，可 以在天然存在的IMP-3部分肽的氨基酸序列的基礎上進行I個、2個或數(shù)個氨基酸的替換和/或添加。當本發(fā)明的外來體使用HLA-A2(A*0201)抗原時，具有選自SEQ ID N0:l、3、5和6的序列的肽是特別有用的。VI.杭原旱遞細朐(APC)本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復合物的分離的APC。通過接觸本發(fā)明的肽或?qū)胩幱诳杀磉_形式的編碼本發(fā)明肽的多核苷酸而獲得的APC可來源于作為治療和/或預防對象的患者，而且可作為疫苗單獨地或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體、或細胞毒性T細胞)組合來施用。APC不限于特定種類的細胞，包括樹突細胞(DC)、Langerhans細胞、巨噬細胞、B細胞、和活化的T細胞，已知這些細胞可在它們的細胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，以供淋巴細胞識別。由于DC是APC中具有最強CTL誘導作用的代表性APC，DC可以用作本發(fā)明的APC。例如，可通過自外周血單核細胞誘導DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸(刺激)它們來獲得APC。當對受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者的身體中誘導出呈遞本發(fā)明肽的APC。短語“誘導APC”包括用本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明肽的核苷酸接觸(刺激)細胞，以在細胞的表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復合物。因此，可以通過對受試者使用本發(fā)明的肽，然后從受試者收集APC本發(fā)明的APC，來獲得本發(fā)明的APC。或者，可以通過使從受試者收集的APC與本發(fā)明的肽接觸來獲得本發(fā)明的APC。本發(fā)明的APC本身可以使用給受試者以誘導針對該受試者體內(nèi)的癌癥的免疫應答，例如作為疫苗。本發(fā)明的APC還可以與其他藥物，包括本發(fā)明的肽、外來體或CTL組合施用。離體施用可包括下述步驟a :自第一受試者收集APC ；b 使肽接觸步驟a的APC ；并c :對第二受試者施用加載了所述肽的APC。第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。或者，依照本發(fā)明，提供本發(fā)明的肽在制備用于誘導抗原呈遞細胞的藥劑或藥物組合物中的用途。另外，本發(fā)明提供一種制備用于誘導抗原呈遞細胞的藥劑或藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括將本發(fā)明的肽與藥學上可接受的擔載體混合或配制的步驟。或者，本發(fā)明提供用于制備用于治療癌癥，包括肺癌和食道癌的藥劑或藥物組合物的方法或工藝，其中該方法包括將本發(fā)明的肽與藥學上可接受的擔載體混合或配制的步驟。另外，本發(fā)明還提供用于誘導抗原呈遞細胞的本發(fā)明的肽。通過步驟b獲得的APC可作為疫苗施用于受試者。通過步驟b獲得的肽可以作為疫苗施用給受試者。本發(fā)明提供用于治療癌癥的肽，所述癌癥包括肺癌和食道癌。依照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的APC具有高水平的CTL誘導能力。在術語“高水平的CTL誘導能力”中，高水平是相對于未與肽接觸或與不能誘導CTL的肽接觸的APC的該水平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導能力的APC可通過下述方法來制備，該方法包括在體外將含有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至APC的步驟。所導入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于進行導入的方法的例子包括但不具體限于本領域中常規(guī)實施的各種方法，諸如可使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Res
1996,56:5672-7; J Immunol 1998，161:5607-13; J Exp Med 1996, 184:465-72;國際公開文本No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的APC在其表面上呈遞HLA抗原與包含選自SEQID NO: 1、3、5和6的氨基酸序列的寡肽的復合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的APC在其表面上表達HLA-A2抗原。換言之，本發(fā)明的APC優(yōu)選在其表面上攜帶HLA-A2抗原?；蛘?，將與HLA抗原形成復合物的寡肽可以是這樣的寡肽，其具有選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列中替換、插入、刪去和/或添加了一個、兩個或者幾個氨基酸殘基，例如從N端起的第二個氨基酸可替換為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或C端的氨基酸可以替換為纈氨酸或亮氨酸，而得到的氨基酸序列。VII.細胞毒件T細胞(細胞毒件T淋巴細胞CTL)被誘導的針對任何本發(fā)明肽的細胞毒性T細胞可在體內(nèi)加強靶向腫瘤相關內(nèi)皮的免疫應答，并且因此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明還提供由任何本發(fā)明肽特異性誘導或活化的、分離的細胞毒性T細胞。此類細胞毒性T細胞可通過下述步驟來獲得(I)對受試者施用本發(fā)明的肽然后從該受試者收集細胞毒性T細胞，或(2)在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的APC和CD8陽性細胞、或外周血單核白細胞，然后分離細胞毒性T細胞。可以從要進行治療和/或預防的患者獲取在來自呈遞本發(fā)明肽的APC的刺激下誘導出的細胞毒性T細胞，而且可以將它們單獨施用，或者與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體)組合施用以調(diào)節(jié)效果。所得到的細胞毒性T細胞特異性針對呈遞本發(fā)明的肽或例如與用于誘導的肽相同的肽的靶細胞起作用。換言之，細胞毒性T細胞可以通過T細胞受體來識別(即結(jié)合)靶細胞表面上的HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復合物，然后攻擊該靶細胞以誘導該靶細胞死亡。靶細胞可以是內(nèi)源表達頂P-3的細胞，或被MP-3基因轉(zhuǎn)染的細胞；而且因本發(fā)明肽的刺激而在細胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細胞也可充當活化CTL攻擊的靶標。在優(yōu)選的實施方案中，靶細胞在其表面上攜帶HLA-A2抗原，并在其表面上呈遞、HLA-A2與本發(fā)明的肽之間形成的復合物。VIII. T 細朐等體(TCR)本發(fā)明還提供包含編碼能夠形成T細胞受體(TCR)的亞單位的多肽的核酸序列的組合物，及使用該組合物的方法。TCR亞單位a和0具有形成TCR的能力，這些TCR賦予T細胞針對呈現(xiàn)MP-3的腫瘤細胞的特異性。通過使用本領域已知的方法，可分離出在用本發(fā)明的一種或多種肽誘導的CTL中表達的TCR a和0鏈的核酸序列，并用來構(gòu)建能夠介導對原代人淋巴細胞的高效率基因轉(zhuǎn)移的合適載體(W02007/032255及Morganet al. , J Immunol, 171, 3288 (2003)) 例如，優(yōu)選用PCR方法分析TCR。用于分析的PCR引物可以是，例如，作為5’側(cè)引物的5’ -R引物(5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3 ')(SEQ ID NO:23)，以及作為3’側(cè)引物的對TCR a鏈C區(qū)特異的3_TRa_C引物(5' -tcagctggaccacagccgcagcgt-3' ) (SEQ ID NO:24),對TCR0 鏈01 區(qū)特異的3_TRb_Cl引物(5' -tcagaaatcctttctcttgac-3 ' ) (SEQ ID NO:25)，或?qū)?TCRP 鏈 C2 區(qū)特異的
3_TRbeta_C2 引物(5 ' -ctagcctctggaatcctttctctt-3 ' ) (SEQ ID NO:26),但不限于此。示例的載體包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型(off-the-shelf)組合物，其容許快速修飾患者自己的T細胞(或其他哺乳動物的T細胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細胞殺傷特性的修飾型T細胞。衍生的TCR能夠以高親合力展示頂P-3肽，并任選地在體內(nèi)和體外介導針對呈遞MP-3肽的靶細胞的高效殺傷?？梢詫⒕幋aTCR亞單位的核酸摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。這些載體是本領域公知的。可以將所述核酸或者包含它們的載體有用地轉(zhuǎn)入T細胞，例如來自患者的T細胞中。有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型組合物，其容許快速修飾患者自己的T細胞(或其他哺乳動物的T細胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細胞殺傷特性的修飾型T細胞。特異性的TCR是這樣的受體，它能夠特異性地識別本發(fā)明的肽與HLA分子的復合物，當TCR處于T細胞的表面上時給予T細胞針對靶細胞的特異性。上述復合物的特異性識別可以通過任何已知方法來確認，優(yōu)選的方法包括，例如，利用HLA分子和本發(fā)明的肽的四聚體分析、以及ELISP0T測定。通過實施ELISP0T測定，可以確認在細胞表面上表達TCR的T細胞借助TCR識別細胞，且信號在細胞內(nèi)被傳遞。也可以通過已知方法來確認上述復合物當存在于T細胞表面時能夠給予T細胞以細胞毒活性。優(yōu)選的方法包括，例如，測定針對HLA陽性靶細胞的細胞毒活性，例如鉻釋放測定。此外，本發(fā)明提供通過用編碼在HLA-A2的背景下結(jié)合MP_3肽(例如SEQ IDN0:l、3、5和6)的TCR亞單位多肽的核酸轉(zhuǎn)導而制備的CTL。經(jīng)過轉(zhuǎn)導的CTL在體內(nèi)能夠歸巢(homing)到癌細胞,并且可以利用公知的培養(yǎng)方法體外擴增(例如Kawakami et al. , JImmunol.，142，3452-3461 (1989))?？梢岳帽景l(fā)明的T細胞來形成免疫原性組合物，所述組合物可以用來在需要治療或保護的患者中治療或預防癌癥(W02006/031221)。IX.藥劑或藥物組合物由于MP-3表達在數(shù)種癌癥中與正常組織相比上調(diào)，本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可用于治療和/或預防癌癥或腫瘤，和/或預防它們的手術后復發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預防癌癥或腫瘤，和/或預防它們的手術后復發(fā)的藥劑或藥物組合物，其包括一種或多種本發(fā)明肽或編碼所述肽的多核苷酸作為活性成分。或者，可以在任何上述外來體或細胞諸如APC的表面上表達本發(fā)明的肽，以用作藥劑或藥物組合物。另外，上述靶向任何本發(fā)明的肽的細胞毒性T細胞也可用作本發(fā)明藥劑或藥物組合物的活性成分。在本發(fā)明的語境中，短語“靶向某個肽”，就細胞毒性T細胞的活性而言，是指細胞毒性T細胞通過其T細胞受體識別(即結(jié)合)靶細胞表面上的HLA抗原與肽之間形成的復合物，然后攻擊該靶細胞以誘導該靶細胞的死亡。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供選自下組的活性成分在制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或藥劑中的用途(a)本發(fā)明的肽， (b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(C)本發(fā)明的 APCJP(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞?；蛘?，本發(fā)明進一步提供用于治療癌癥或腫瘤的選自下組的活性成分(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(C)本發(fā)明的 APCJP(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞?；蛘?，本發(fā)明進一步提供一種制備用于治療癌癥的藥物組合物或藥劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學或生理學可接受的擔載體與選自下組的活性成分作為活性成分的步驟(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(C)本發(fā)明的 APCJP(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或藥劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性成分與藥學或生理學可接受的擔載體的步驟，其中所述活性成分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(C)本發(fā)明的 APCJP(d)本發(fā)明的細胞毒性T細胞?；蛘?，本發(fā)明的藥物組合物或藥劑可用于防范癌癥或腫瘤和/或預防其手術后復發(fā)。本發(fā)明的藥劑或藥物組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩，特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預防癌癥或腫瘤，和/或預防其手術后復發(fā)。依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列的寡肽是能誘導強且特異性的免疫應答的HLA-A2限制性表位肽。因此，包括任何這些具有SEQ IDNO: 1、3、5或6的氨基酸序列的寡肽的本發(fā)明藥劑或藥物組合物特別適合于對其HLA抗原為HLA-A2的受試者施用。如本文中使用的，“其HLA抗原為HLA-A2的受試者”是指純合地或者雜合地擁有HLA-A2基因的受試者，且HLA-A2在受試者的細胞中作為HLA抗原表達。換言之，受試者為HLA-A2陽性。這同樣適用于含有編碼任何這些寡肽的多核苷酸的藥劑或藥物組合物。要用本發(fā)明的藥劑或藥物組合物治療的癌癥或腫瘤不受限制，包括其中涉及IMP-3的所有種類的癌癥或腫瘤，包括例如肺癌或食道癌。特別是，本發(fā)明的藥劑或藥物組合物優(yōu)選應用于胰腺癌。除上述活性成分之外，本發(fā)明的藥劑 或藥物組合物還可含有其它具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細胞等等。在本文中，其它具有誘導針對癌性細胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原(例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。如果需要，本發(fā)明的藥劑或藥物組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性成分，只要該物質(zhì)不抑制活性成分(例如任何本發(fā)明肽)的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗炎劑或組合物、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了在藥物自身中包括其它治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學作用劑或組合物順序或同時施用。藥物和藥理學作用劑或組合物的量取決于例如所使用的藥理學作用劑或組合物的類型、所治療的疾病、及施用的時序安排和路徑。應當理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥劑或藥物組合物可包括與所討論的配制劑類型相關的本領域常規(guī)的其它制劑或組合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的藥劑或藥物組合物可包括在制品和試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制品可包括任何本發(fā)明藥劑或藥物組合物的容器及標簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標簽應指明該藥劑或組合物用于治療或預防一種或多種疾病狀況。標簽還可指明關于施用的指導等等。除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥劑或藥物組合物的試劑盒還可任選進一步包括第二容器，其中裝有藥學可接受稀釋劑。它可進一步包括從商業(yè)和用戶立場看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。如果期望的話，藥劑或藥物組合物可在藥包或分配器裝置中提供，該藥包或分配器裝置可裝有一個或多個含有活性成分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的肽還可以作為可藥用鹽的形式施用。所述鹽的優(yōu)選實例包括與堿金屬的鹽、與堿土金屬的鹽、與有機堿的鹽、與有機酸的鹽、和與無機酸的鹽。(I)含有肽作為活性成分的藥劑或藥物組合物本發(fā)明的肽可以作為藥劑或藥物組合物直接施用，或者如果必要，通過常規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，除本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物的擔載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類擔載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液、等等。另外，藥劑或藥物組合物可在必要時含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥劑或藥物組合物可用于抗癌目的。
本發(fā)明的肽可制備成由兩種或更多種本發(fā)明肽構(gòu)成的組合以在體內(nèi)誘導CTL。肽組合可采取雞尾酒的形式，或者可使用標準技術彼此綴合。例如，可以將各個肽化學連接或表達成為單一融合多肽序列。組合中的各個肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后誘導出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的復合物特異性起反應的CTL?；蛘撸梢酝ㄟ^從受試者分離APC (例如DC)，并用本發(fā)明的肽刺激它們，來獲得在其細胞表面上展示任何本發(fā)明的肽的APC，通過將這些APC(例如DC)重新施用給受試者而在受試者體內(nèi)誘導出CTL,結(jié)果,可提高針對癌細胞,諸如肺癌和食道癌細胞的攻擊性。包括本發(fā)明的肽作為活性成分、用于治療和/或預防癌癥或腫瘤的藥劑或藥物組合物還可包括已知可有效誘導細胞免疫的佐劑?；蛘?，所述藥劑或藥物組合物可以與其它活性成分一起施用，或者通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學活性的蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時增強針對該蛋白質(zhì)的免疫應答的化合物。本文中涵蓋的佐劑包括文獻中記載的那些(Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89)。合適佐劑的例子包括但不限于磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等等，但不限于此。
另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制齊U、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的肽還可以作為可藥用鹽的形式施用。所述鹽的優(yōu)選實例包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機堿的鹽、與有機酸的鹽、和與無機酸的鹽。本文中所用的“可藥用鹽”是指保留所述化合物的生物學有效性和性質(zhì)，通過與無機酸或堿(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等)反應所得到的鹽。優(yōu)選的鹽包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機堿的鹽、與有機酸的鹽、和與無機酸的鹽。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥劑或藥物組合物可進一步包括引發(fā)(prime)CTL的成分。已經(jīng)確認脂質(zhì)是能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的作用劑或組合物。例如，可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的e-和a-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應答的另一個例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS),當與適宜的肽共價連接時,可用來引發(fā)CTL (參見例如Deres et al. , Nature1989，342:561-4)。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。本發(fā)明肽的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當加以調(diào)整，通常是0. OOlmg至IOOOmg,例如0. OOlmg至IOOOmg,例如0. Img至IOmg,而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領域技術人員能恰當選擇合適的劑量。(2)含有多核苷酸作為活性成分的藥劑或藥物組合物本發(fā)明的藥劑或藥物組合物也可含有處于可表達形式的編碼本文中公開的肽的核酸。在本文中，短語“處于可表達形式的”意味著多核苷酸在導入細胞時會在體內(nèi)表達成誘導抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細胞的基因組所需的配置(關于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR & Capecchi MR, Cell1987,51:503-12)。參見例如 Wolff et al. , Science 1990, 247:1465-8;美國專利 No. 5，580, 859; 5, 589, 466; 5, 804, 566; 5, 739, 118; 5，736，524; 5，679，647;及 W 98/04720?；贒NA的投遞技術的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導的)投遞、陽離子脂質(zhì)復合物、和顆粒介導的(“基因槍”)或壓力介導的投遞(參見例如美國專利No. 5，922，687)。本發(fā)明的肽還可用病毒或細菌載體來表達。表達載體的例子包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如牛痘病毒作為載體來表達編碼肽的核苷酸序列。在導入宿主后，重組牛痘病毒表達表達免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應答?？捎糜诿庖呓臃N方案的牛痘載體和方法記載于例如美國專利No. 4，722，848。另一個例子是卡介苗(BCG，Bacille Calmette Guerin) qBCG載體記載于Stover et al. , Nature 1991，351:456-60。有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是容易想到的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如 Shata et al. , Mol Med Today 2000，6:66-71; Shedlock et al. , J LeukocBiol 2000,68:793-806;Hipp et al. , In Vivo 2000,14:571-85。 將多核苷酸投遞入受試者可以是直接的，其中使受試者直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化細胞，然后將細胞移植入受試者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。關于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al. , Clinical Pharmacy1993, 12:488-505;Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95;Tolstoshev, Ann Rev PharmacolToxicol 1993, 33:573-96;Mulligan, Science 1993, 260:926-32;Morgan & Anderson, AnnRev Biochem 1993, 62:191-217;Trends in Biotechnology 1993，11(5):155-215。在 eds.Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,1993;及 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, StocktonPress, NY, 1990中描述的重組DNA技術領域的公知方法也可用于本發(fā)明。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化?？梢砸罁?jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當調(diào)整合適的擔載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細胞中的多核苷酸的劑量，而且通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如
0.OOlmg至IOOOmg,例如0. Img至IOmg,而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領域技術人員能恰當選擇合適的劑量。X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法本發(fā)明的肽和編碼此類肽的多核苷酸可用于誘導APC和CTL，以及用于針對癌癥或腫瘤的免疫應答。本發(fā)明的外來體和APC也可用于誘導CTL，以及用于誘導針對癌癥或腫瘤的免疫應答。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該化合物不抑制它們的CTL誘導能力。因此，任何前文所述的本發(fā)明的藥劑或藥物組合物均可用于誘導CTL，而且除它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導APC，如下文討論的。此外，本發(fā)明的CTL也可以用來誘導針對癌癥或腫瘤的免疫應答。(I)誘導抗原呈遞細胞(APC)的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸來誘導APC的方法。誘導APC可以如上文“VI.抗原呈遞細胞”部分所述來實施。本發(fā)明還提供了用于誘導具有高水平CTL誘導能力的APC的方法，上文“VI.抗原呈遞細胞”項目下也提到了其誘導。優(yōu)選的是，誘導APC的方法包括選自下面的至少一個步驟a 使APC與本發(fā)明的肽接觸，和b :將編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸以可表達的形式導入APC。這樣的APC誘導方法優(yōu)選地以體外或離體的方式實施。為了以體外或離體方式實施所述方法，可以從受試者或者與待治療的受試者的HLA抗原相同的其他人獲得要誘導的APC0在優(yōu)選的實施方案中，通過本方法誘導的APC在其表面上攜帶HLA-A2抗原。(2)誘導CTL的方法 本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的肽、編碼所述肽的多核苷酸、或呈遞所述肽的外來體或APC來誘導CTL的方法。本發(fā)明還提供了使用編碼能形成T細胞受體(TCR)亞單位的多肽的多核苷酸來誘導CTL的方法，所述TCR亞單位識別(即結(jié)合)本發(fā)明的肽與HLA抗原的復合物。優(yōu)選地，所述誘導CTL的方法包括選自下組的至少一個步驟(a)使⑶8-陽性T細胞與抗原呈遞細胞和/或外來體接觸，所述抗原呈遞細胞和外來體在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復合物；和(b)向⑶8陽性T細胞中導入編碼能夠形成TCR亞單位的多肽的多核苷酸，所述TCR亞單位可識別HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復合物。當本發(fā)明的肽被施用給受試者后，受試者的身體中誘導出CTL，而且靶向腫瘤相關內(nèi)皮的免疫應答的強度增強?；蛘?，肽和編碼肽的多核苷酸可用于離體治療方法，其中在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)源自受試者的APC和CD8陽性細胞或外周血單核白細胞，并在誘導CTL后，將活化的CTL細胞返還給受試者。例如，該方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;b :用本發(fā)明的肽接觸步驟a的APC ；c :將步驟b的APC與OT8+T細胞混合，并共培養(yǎng)以誘導CTL ;并d :自步驟c的共培養(yǎng)物收集OT8+T細胞?；蛘撸勒毡景l(fā)明，提供了本發(fā)明的肽在制備用于誘導CTL的藥物組合物中的用途。另外，本發(fā)明提供了一種制備用于誘導CTL的藥劑或藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括將本發(fā)明的肽與藥學上可接受的擔載體混合或配制的步驟。另外，本發(fā)明還提供了用于誘導CTL的本發(fā)明的肽。通過步驟d獲得的具有細胞毒性活性的OT8+T細胞可作為疫苗施用于受試者。上文步驟c中要與⑶呵細胞混合的APC也可通過將編碼本發(fā)明肽的基因轉(zhuǎn)移入APC來制備，如上文“VI.抗原呈遞細胞”部分中詳述的；但是不限于此。相應地，任何將本發(fā)明的肽有效呈遞給T細胞的APC或外來體均可用于本發(fā)明的方法。(3)誘導免疫應答的方法本發(fā)明進一步提供用于誘導受試者中針對癌癥，例如肺癌和食道癌的免疫應答的方法。所述方法包括施用本發(fā)明的疫苗，所述疫苗包括(a) 一種或多種本發(fā)明的寡肽，或其免疫學活性片段；(b) 一種或多種編碼(a)的寡肽或免疫學活性片段的多核苷酸；
(c) 一種或多種本發(fā)明的CTL ；(d) —種或多種本發(fā)明的抗原呈遞細胞；或(e) 一種或多種分離的經(jīng)過TCR編碼基因轉(zhuǎn)化的T細胞。在本發(fā)明的語境中，可以用這些活性成分治療過表達IMP-3的癌癥。這樣的癌癥的例子包括但不限于肺癌和食道癌。因此，在施用含有所述活性成分的疫苗或藥物組合物之前，優(yōu)選確認要治療的癌細胞或組織中MP-3的表達水平相比于相同器官的正常細胞是否提高。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療(過)表達IMP-3的癌癥的方法，該方法可包括下述步驟i)測定從具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細胞或組織中的MP-3的表達水平；
ii)比較所述MP-3表達水平與正常對照；并iii)對具有與正常對照相比過表達MP-3的癌癥的受試者施用至少一種選自上文所述(a)至⑷的成分?；蛘撸景l(fā)明可提供包含至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或藥物組合物，其用于對具有過表達MP-3的癌癥的受試者施用。換言之，本發(fā)明進一步提供了用于鑒定要用本發(fā)明MP-3多肽來治療的受試者的方法，所述方法包括測定源自受試者的癌細胞或組織中的MP-3表達水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示該受試者具有可用本發(fā)明IMP-3多肽來治療的癌癥。本發(fā)明的治療癌癥的方法將在下面更加詳細的加以敘述。任何源自受試者的細胞或組織均可作為用于測定MP-3表達，只要它包括目標的MP-3轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。合適的樣品的例子包括，但不限于，身體組織與體液，例如血液，痰，與尿液。優(yōu)選地，源自受試者的細胞或組織含有這樣的細胞群體，該群體包括上皮細胞，更優(yōu)選癌性上皮細胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細胞。進一步，如果必要，可從所得的身體組織與體液中純化所述細胞，并將其用為源自受試者的樣品。需用本方法治療的患者優(yōu)選為哺乳動物。哺乳動物的例子包括但不僅限于，例如，人、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬以及牛。根據(jù)本發(fā)明，測定在自受試者獲得的癌細胞或組織中MP-3的表達水平。表達水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平確定，使用本領域熟知的方法。舉例而言，可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針來定量MP_3的mRNA。所述檢測可在芯片或陣列上實施。對檢測MP-3的表達水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領域技術人員可利用MP-3的序列信息制備上述探針。舉例而言，MP-3的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標記物來標記，所述標記物例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達水平可以作為發(fā)生了雜交的標簽的強度檢測。進一步，頂P-3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(SEQ ID N0:21)可通過基于擴增的檢測方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因的可用的序列信息來制備。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴格條件、中等嚴格條件與低嚴格條件下與IMP-3的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，在不同的環(huán)境下會不同。較長序列與較短序列相比在較高溫度觀察到特異雜交。一般地，嚴格條件的溫度應選擇比特定序列在限定的離子強度和pH下的熔點(Tm)低大約5° C。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm下，平衡時50%的探針被占據(jù)。典型地,嚴格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約0. 01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30° C，用于較長的探針或引物是至少大約60° C。嚴格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來實現(xiàn)。探針或引物可具有特定的大小。大小的 范圍可為至少10個核苷酸，至少12個核苷酸，至少15個核苷酸，至少20個核苷酸，至少25個核苷酸，至少30個核苷酸，且探針和引物的大小范圍可為5-10個核苷酸，10-15個核苷酸，15-20個核苷酸，20-25個核苷酸，和25-30個核苷酸?；蛘撸梢詸z測翻譯產(chǎn)物以進行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定IMP-3蛋白(SEQID NO:22)的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對IMP-3蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。作為另一種基于MP-3的翻譯產(chǎn)物檢測其基因的表達水平的方法，可利用針對IMP-3蛋白的抗體通過免疫組織化學分析觀察其染色的強度。意即，在這種測量中，強染色表明所述蛋白質(zhì)存在/水平增加，且同時表明MP-3基因的高表達水平。對于癌細胞中的靶基因(例如MP-3基因)，如果其較之靶基因的對照水平(例如正常細胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過I. I倍，超過I. 5倍，超過2. 0倍，超過5. 0倍，超過10倍或者更多，則可以認為其在癌細胞中的表達水平增加了。對照水平可以與癌細胞同時確定，使用先前從疾病狀態(tài)(患癌或未患癌)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細胞可用作正常對照?；蛘?，對照水平可以借助統(tǒng)計方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的MP-3基因表達水平獲得的結(jié)果加以確定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中IMP-3基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的樣品的組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中MP-3基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值+/-2S. D.或平均值+/-3S. D.的范圍可以用作標準值。在本發(fā)明的語境下，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則稱作“癌對照水平”。測試生物樣品的表達水平與對照水平間的差異，可以相對已知表達水平不會隨著細胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對照核酸(例如管家基因)的表達水平加以標準化。示例的對照基因包括，但不僅限于，P -肌動蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。當MP-3基因的表達水平相比正常表達水平有所提高，或與癌性對照水平相似/等同，則受試者可診斷為具有要治療的癌癥。更具體地，本發(fā)明提供了一種⑴診斷受試者是否具有要治療的癌癥，和/或(ii)選擇受試者進行癌癥治療的方法，該方法包括下述步驟a)測定MP-3在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的生物樣品中的表達水平；b)將MP-3的表達水平與正常對照水平比較； c)若MP-3的表達水平與正常對照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥治療?；蛘撸祟惙椒砂ㄏ率霾襟Ea)測定IMP-3在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的生物樣品中的表達水平；b)將MP-3的表達水平與癌性對照水平比較；c)若MP-3的表達水平與癌性對照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥治療。本發(fā)明還提供了用于確定能用本發(fā)明的MP-3多肽來治療的患有癌癥的受試者的試劑盒，其亦可用于評價和/或監(jiān)測特定的癌癥療法，更特別地是癌癥免疫療法的功效。合適的癌癥的示例包括，但不限于肺癌和食道癌。更特別地，所述試劑盒優(yōu)選包含至少一種在源自受試者的癌細胞中檢測MP-3基因表達的試劑，所述試劑選自下組(a)用于檢測MP-3基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測MP-3蛋白的試劑；(c)用于檢測MP-3蛋白的生物學活性的試劑。適于檢測MP-3基因mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或識別MP_3mRNA的核酸，諸如具有與MP-3mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對MP_3mRNA特異性的引物與探針。這類寡核苷酸可基于本領域眾所周知的方法制備。如果需要，用于檢測MP_3mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測MP-3mRNA的試劑。另一方面，適于檢測MP-3蛋白的試劑包括針對MP-3蛋白的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要所述片段或經(jīng)修飾抗體保留與MP-3蛋白的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備此類抗體的方法在本領域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價物。進一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標記技術進行標記。標記物與標記抗體以及檢測抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種用于檢測IMP-3蛋白的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。舉例而言，從沒有癌癥或患有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和帶有使用說明書(例如，書面的、磁帶、⑶-ROM等等)的裝箱單。這些試劑之類的可標上標簽包含在容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可用多種材料制造，例如玻璃或塑料。作為本發(fā)明的一個實施方案，當所述試劑是針對IMP_3mRNA的探針時，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位置?；蛘撸瑢φ瘴恢每晌挥谂c測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較大而在后面的位置上量較小。在加入測試樣品之后，顯示可檢測信號位置的數(shù)目提供了在樣品中存在的IMP-3mRNA量的定量指征。所述檢測位置可設置成具有任何合適可檢測的形狀，通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。本發(fā)明所述試劑盒可進一步包括陽性對照樣品或MP-3標準樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集MP-3陽性樣品，隨后測定其MP-3水平來制備。此外，可將純化的MP-3蛋白或多核苷酸添加到不表達MP-3的細胞中以形成所述陽性樣品或MP-3標準品。在本發(fā)明中，純化的MP-3可以是重組蛋白。例如，陽性對照樣品的MP-3水平大于截留值。提供下面的實施例來例示本發(fā)明及幫助本領域普通技術人員來制備和使用本發(fā)明。實施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例材料和方法小鼠人白細胞抗原(HLA)-A2 轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠；引入了人 beta2m-HLA_A2. I (HLA_A*0201，a I, a 2)-H_2Db(a 3跨膜胞質(zhì))單鏈構(gòu)建體基因的H_2Db和beta2m雙敲除小鼠系于Department SIDA-Retrovirus, Unite d' Immunite Cellulaire Antivirale, InstitutePasteur, France制作，由F. A. Lemonnier博士惠贈。這些小鼠飼養(yǎng)在熊本大學動物資源和開發(fā)中心(Center for Animal Resources and Development ofKumamoto University),依照熊本大學動物照看指南來操作它們。細胞系PANC I, A549, Lu99, MCF7, SW620, SKHep I 和 T2, TAP-缺陷和 HLA-A2 (A*0201)-陽性細胞系，購自Riken Cell Bank(日本筑波)。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應分析確定了IMP-3的表達。血液樣品利用自HLA-A2陽性供體分離的外周血單個核細胞(PBMC)進行的研究獲得了日本熊本熊本大學機構(gòu)評審委員會(Institutional Review Board of KumamotoUniversity, Kumamoto, Japan)的批準。在熊本大學醫(yī)院，在獲得了患者的正式書面知情同意書后，在例行診斷程序中獲取了 4名肺癌患者(代號為患者I、患者3、患者4、患者14和患者103)的血液樣品。還在獲得書面知情同意后從HLA-A2(A*0201)陽性健康供體(代號為供體-I、供體-2和供體-3)獲得了血液樣品。所有樣品均經(jīng)過匿名化處理、隨機編號，并、保持在-80攝氏度直到使用。 來源于MP-3的肽的候選者選擇使用結(jié)合預測軟件"BIMAS" (http://www_bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bi nd)(Parker et al. , J TmmunoI 1994，152 (I):163-75，Kuzushima et al. , Blo od2001,98(6) :1872-81)預測了來源于IMP-3的可能結(jié)合HLA-A2 (A*0201)分子的肽。由American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA合成了這些妝以及HLA-A2 (A*0201)限制型HIV 肽(SLYNTYATL)，純度 >95%。IMP-3反應性小鼠CTL的誘導對于HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，在第7和第14天用5X IO5個經(jīng)候選肽沖激的同基因骨髓衍生樹突細胞(BM-DC)體內(nèi)免疫。在第21天，用經(jīng)每種肽沖激的BM-DC刺激從經(jīng)免疫的 小鼠分離的⑶4-脾細胞，歷時6天。用酶聯(lián)免疫斑點(ELISP0T)測定檢測IFN-Y產(chǎn)生。IMP-3反應性人CTL的誘導通過Ficoll-Conray密度梯度離心分離來自HLA-A2 (A*0201)陽性供體的肝素化血液的PBMC，以產(chǎn)生外周血單核細胞衍生的DC。在含有2%熱滅活的自體血漿的 AIM-V (Invitrogen Japan, Tokyo, Japan)中將這些 DC 在 4 u g/mL ^ -2 微球蛋白(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的存在下用 20 u g/mL 候選肽在 37°C沖激 2 小時。然后照射細胞(40Gy)，并將細胞與⑶8+T細胞一起溫育。然后在24孔平板中設置培養(yǎng)物，每個孔含有2mL AM-V (含2%自體血漿)，其中有IX IO5個經(jīng)肽沖激的DC、2X IO6個⑶8+T細胞、和5ng/mL人重組IL_7 (ffako, Osaka, Japan)。2天后，向這些培養(yǎng)物中加入重組人IL-2 (PeproTech, Rocky Hill1NJ, USA)至最終濃度為20IU/mL。另外使用同樣的程序用加載有肽的自體DC刺激，每周一次，進行兩次(在第7天和第14天)。在最后一次刺激后六天，通過IFN- y ELISP0T測定和51Cr釋放測定來考察誘導出的CTL的抗原特異性應答。對于IFN- y ELISP0T測定，用經(jīng)關聯(lián)肽或無關的HIV肽沖激過的T2 (IX IO4/孔)刺激CTL (10XIO5個細胞/孔)。對于51Cr釋放測定，以標示的效應物/靶物比將CTL與作為靶細胞的經(jīng)肽沖激的T2細胞或癌細胞(5X103/孔)共溫育，按照前人的描述(Komori H et al.，ClinCancer Res. 2006 May I; 12 (9) : 2689-97)進行標準 51Cr 釋放測定。對⑶107a(LAMP_l;溶酶體相關膜蛋白_1)在CTL細胞表面上的暴露的分析通過抗⑶107a抗體檢測了在抗原刺激后⑶107a在CTL的細胞表面上的暴露。在綴合有FITC的抗CD107a單抗或作為對照的小鼠IgGl的存在下，用關聯(lián)肽或無關HIV肽刺激MP-3肽特異性CTL。將這些CTL在37°C溫育5小時，然后用綴合有PE的抗人⑶8單抗染色。所有肽以I微克/ml的終濃度使用。所顯示的事件是對CD8+T細胞設門的。抗HLA I類單克隆抗體對CTL應答的抑制如前人所述(KomoriH et al. , Clin Cancer Res. 2006 May I; 12 (9) : 2689-97)進行HLA I類的抑制。具體地，分別將Lu99靶細胞與抗HLA I類單抗(W6/32，IgG2a)或抗HLA-DR單抗(HLA II類單抗)(H-DR-1，IgG2a)溫育I小時后，將Lu99細胞與通過用關聯(lián)肽刺激而自肺癌患者衍生的CTL共溫育。統(tǒng)計學分析使用雙尾Student氏t檢驗來評估IFN- y EU SPOT測定獲得的數(shù)據(jù)的差異的統(tǒng)計學顯著性。P〈0. 05的值認為是顯著的。統(tǒng)計學分析使用市售的統(tǒng)計學軟件包(SPSS forWindows, version11. 0，Chicago, ILj USA)來進行。結(jié)果來源于IMP-3的HLA-A2結(jié)合肽的預測表I顯示以最高結(jié)合親和力為序排列的MP-3的HLA-A2(A*0201)結(jié)合肽(表I)。選擇了總共20種具有潛在HLA-A2(A*0201)結(jié)合能力的肽。源自頂P-3的 HLA-A2 (A*0201)結(jié)合肽
權利要求
1.一種分離的寡肽，其包含選自SEQ ID N0:l、3、5和6的氨基酸序列。
2.一種分離的寡肽，其包含選自SEQ ID NO: 1、3、5和6的氨基酸序列，其中替換、缺失、插入和/或添加了 I個、2個或數(shù)個氨基酸，且其中所述寡肽具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力。
3.權利要求2的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者 (a)從N端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和 (b)C端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。
4.分離的多核苷酸，其編碼權利要求1-3中任一項的肽。
5.通過使用如權利要求1-3中任一項所述的寡肽來誘導具有CTL誘導能力的抗原呈遞細胞的方法。
6.權利要求5的方法，其中所述方法包括選自下組的步驟 (a)使抗原呈遞細胞與權利要求1-3中任一項的寡肽接觸，和 (b)將編碼權利要求1-3中任一項的寡肽的多核苷酸導入抗原呈遞細胞。
7.權利要求5或6的方法，其中所述抗原呈遞細胞在其表面上表達至少一種HLA-A2抗原。
8.通過使用如權利要求1-3中任一項所述的寡肽來誘導CTL的方法。
9.權利要求8的方法，其中所述方法包括選自下組的步驟 (a)使CD8-陽性T細胞接觸在其表面上呈遞權利要求1-3中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的抗原呈遞細胞和/或外來體；和 (b)向CD8-陽性T細胞中導入編碼能夠形成T細胞受體(TCR)亞單位的多肽的多核苷酸，所述亞單位結(jié)合細胞表面上的權利要求1-3中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物。
10.權利要求9的方法，其中所述HLA抗原為HLA-A2。
11.一種分離的CTL，其靶向權利要求1-3中任一項的寡肽。
12.權利要求11的CTL，其中所述CTL能夠結(jié)合細胞表面上權利要求1-3中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物。
13.權利要求12的CTL，其中所述HLA抗原為HLA-A2。
14.分離的CTL，其是通過使用權利要求1-3中任一項的寡肽誘導的。
15.權利要求14的CTL，其中所述CTL是通過權利要求8-10中任一項的方法誘導的。
16.一種分離的抗原呈遞細胞，該細胞在其表面呈遞HLA抗原與權利要求1-3中任一項的寡肽的復合物。
17.權利要求16的抗原呈遞細胞，其中所述HLA抗原是HLA-A2。
18.權利要求16或17的抗原呈遞細胞，其中所述抗原呈遞細胞是通過權利要求5-7中任一項的方法誘導的。
19.一種在受試者中誘導針對癌癥的免疫應答的方法，包括對所述受試者施用疫苗的步驟，所述疫苗包含選自下組的至少一種活性成分 (a)一種或多種權利要求1-3中任一項所述的寡肽，或其免疫學活性片段； (b)一種或多種編碼權利要求1-3中任一項所述的寡肽或其免疫學活性片段的多核苷酸； (c)一種或多種權利要求11-15中任一項的分離的CTL ;和(d) —種或多種權利要求16或18的分離的抗原呈遞細胞。
20.權利要求19的方法，其中所述受試者是HLA-A2陽性的。
21.一種用于治療和/或預防癌癥和/或防止其手術后復發(fā)的藥劑，其中該藥劑包含可藥用擔載體以及選自下組的至少一種活性成分 (a)一種或多種權利要求1-3中任一項所述的寡肽，或其免疫學活性片段； (b)一種或多種編碼至少一種權利要求1-3中任一項所述的寡肽或其免疫學活性片段的多核苷酸； (c)一種或多種在其表面上呈遞至少一種權利要求1-3中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的抗原呈遞細胞；和 (d)一種或多種能夠結(jié)合細胞表面上權利要求1-3中任一項的寡肽與HLA抗原的復合 物的CTL。
22.一種用于誘導CTL的藥劑，其中該藥劑包含可藥用擔載體以及選自下組的至少一種活性成分 (a)一種或多種權利要求1-3中任一項所述的寡肽，或其免疫學活性片段； (b)一種或多種編碼至少一種權利要求1-3中任一項所述的寡肽或其免疫學活性片段的多核苷酸； (c)一種或多種在其表面上呈遞權利要求1-3中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的抗原呈遞細胞。
23.權利要求21或22的藥劑，其中所述藥劑配制為用于對HLA-A2陽性的受試者施用。
24.權利要求21-23中任一項的藥劑，其是疫苗。
25.選自下組的活性成分 (a)一種或多種權利要求1-3中任一項所述的寡肽； (b)—種或多種處于可表達形式的編碼權利要求1-3中任一項所述的寡肽的多核苷酸； (c)一種或多種在其表面上呈遞權利要求1-3中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的抗原呈遞細胞；和 (d)一種或多種能夠結(jié)合細胞表面上權利要求1-3中任一項的寡肽與HLA抗原的復合物的CTL 在制備用于治療癌癥的藥物組合物或藥劑中的用途。
26.權利要求25的用途，其中所述藥物組合物或藥劑配制為用于對HLA-A2陽性的受試者施用。
27.—種包含選自SEQ ID勵:1、3、5和6的氨基酸序列的分離的寡肽，其用于在見^-八2陽性的受試者中治療和/或預防癌癥，和/或預防其手術后復發(fā)。
28.一種分離的寡肽，其包含選自SEQ ID NO:l、3、5和6的氨基酸序列，其中替換、缺失、插入和/或添加了 I個、2個或數(shù)個氨基酸，且其中所述寡肽具有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)誘導能力，用于在HLA-A2陽性的受試者中治療和/或預防癌癥，和/或預防其手術后復發(fā)。
29.權利要求28的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者 (a)從N端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸，和(b)C端氨基酸是 纈氨酸或亮氨酸。
全文摘要
本申請中描述了具有細胞毒性T淋巴細胞誘導能力、適于在癌癥免疫治療的語境中使用的寡肽。突出的例子包括具有SEQ ID NO:1、3、5或6的氨基酸序列的寡肽，其中任選替換、缺失、插入或添加1個、2個或數(shù)個氨基酸，只要它們保留原始肽的細胞毒性T淋巴細胞誘導能力。還描述了與這些寡肽相關的適于治療或預防癌癥或腫瘤或其手術后復發(fā)的藥物制劑或“藥物”。
文檔編號C12N15/00GK102741271SQ20108006287
公開日2012年10月17日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權日2009年12月1日
發(fā)明者中村佑輔, 原尾美智子, 富田雄介, 西村泰治, 角田卓也 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司