專利名稱：大白菜葉綠體來源的小rna及其熱響應(yīng)作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及大白菜葉綠體來源的小RNA及其熱響應(yīng)作用。
背景技術(shù)：
真核生物中，非編碼小RNA在許多細(xì)胞程序中有重要的作用，例如轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切，DNA復(fù)制以及RNA加工等。在植物中，一個現(xiàn)代的觀點(diǎn)認(rèn)為小RNA通過Dicer-Iike蛋白(DCLs)剪切其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體或雙鏈RNA分子而產(chǎn)生。這些小RNA直接與Piwi/Argonaute (AGO)家族的蛋白作用形成RNA沉默復(fù)合體(RISC)。然而,來自動物中的數(shù)據(jù)顯 示小RNA與復(fù)合體間的關(guān)系更為復(fù)雜。最近在哺乳動物中的實(shí)驗(yàn)也掲示了小RNA生物合成的分子機(jī)制。新一代測序技術(shù)產(chǎn)生了大量的測序數(shù)據(jù)，更掲示了小RNA來源的多祥性，諸如有些小RNA來源于基因組重復(fù)區(qū)序列，基因間區(qū)域，以及tRNA。然而這些研究更多關(guān)注于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，在動物、植物以及真菌中報(bào)道來源于亞細(xì)胞基因組，諸如葉綠體和線粒體的小RNA逐漸增多。葉綠體和線粒體被廣泛的認(rèn)為是由細(xì)胞中內(nèi)共生細(xì)菌休演化而來，具有獨(dú)立的環(huán)形基因組，有自己的基因表達(dá)機(jī)制[Dyall SD, Brown MT, Johnson PJ Ancientinvasions fromendosymbionts to organelles. Science 2004,304:253-257」。細(xì)胞器基因組的ー個標(biāo)志是具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的優(yōu)勢，包括特異基因及整體范圍的RNA加工和運(yùn)輸。在葉綠體中，幾個非編碼RNA最初在煙草中被發(fā)現(xiàn)，并在其他幾個被子植物中具有保守性，例如，ー個218-nt長的質(zhì)體編碼的RNA被認(rèn)為與16S核糖體RNA成熟有關(guān)[Vera A,bugiura M A novel RNA gene in the tobacco plastidgenome its possible role inthe maturation of 16S rRNA. EMBO Journal 1994,13 :2211-2217],在煙草葉綠體中發(fā)現(xiàn)12個未知功能的非編碼小RNA,其中一些預(yù)測可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)[Lung B, Zemann A, MadejMJ, Schuelke M, Techritz S, Ruf S, Bock R, Hiittenhofer A identification of smallnon-coding RNAs frommitochondria and chloroplasts. Nucleic Acids Res 2006,34:3842-3852]。在葉綠體中，幾乎所有的多順反子轉(zhuǎn)錄都被核酸內(nèi)切酶及核酸外切酶加工，核酸酶可能減少核糖體組裝的ニ級結(jié)構(gòu)。此外，葉綠體中RNA 3’端加工使用了原核生物途徑，即rho-獨(dú)立的末端，產(chǎn)生成熟區(qū)側(cè)端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[Rott R, Drager RG, Stern DB, SchusteLr :The 3’untranslated regions of chloroplast genes inChiamydomonas reinhardtiido not serve as efficient transcriptional terminators. Mo丄 Gen Genet 1996,252:676-683]。盡管如此，與已知的大腸桿菌相比，葉綠體中RNA加工仍然還知之甚少，酶機(jī)制僅僅是ー個探索性的開始，其詳盡的分子機(jī)制仍待闡明。白菜(Brassica rapa ssp. chinensis)是ー種廣泛栽培的綠葉蔬菜,其有大量的葉綠體。其特性是在十字花科中與擬南芥親緣關(guān)系最近，因此可通過比較生物學(xué)研究其葉綠體發(fā)育。白菜適宜的生長溫度是18°C到22°C，在長江流域其產(chǎn)量受熱壓カ影響非常大。在高溫天氣下，莖和根的生長受到嚴(yán)重抑制，導(dǎo)致葉片褪綠及漂白。在黃化葉子部分，葉綠體積累及發(fā)育，以及光合活性都被明顯抑制[Yamashita T, Butler WL Jnhibitionof chloroplasts by UV-irradiation andheat-treatment. Plant Physiol 1968,43:2037-2040]，可見葉綠體對熱壓カ反應(yīng)劇烈。近年來，大白菜及其他重要經(jīng)濟(jì)作物對熱反應(yīng)及抗熱育種越來越受到重視，小RNA在抗逆反應(yīng)中的重要作用也日益受到重視，尤其是葉綠體小 RNA[Lung B, Zemann A, Madej MJ, Schuelke M, Techritz S, Ruf S, BockR, Hiittenhofer A :Identification of small non-coding RNAs from mitochondriaandchloroplasts. Nucleic Acids Res 2006,34:3842-3852]。因此，還需要探索大白菜葉綠體熱反應(yīng)相關(guān)的小RNA，進(jìn)而尋找到有益于提高作物抗熱能力的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供大白菜葉綠體來源的小RNA及其熱響應(yīng)作用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種篩選具有熱響應(yīng)作用的小RNA的方法，所述方法包括 (I)將2-4周(較佳地2. 5-3. 5周，更佳地3周)大小的熱敏感白菜苗在46±0.5°C熱處理I ±0. I小時，作為熱處理組；以未經(jīng)熱處理的2-4周(較佳地2. 5-3. 5周，更佳地3周)大小的熱敏感白菜苗作為對照組；(2)分別提取熱處理組和對照組白菜苗的RNA，分別獲得熱處理組和對照組的小RNA測序數(shù)據(jù)庫，其中小RNA序列的長度為9-36nt ；(3)比較熱處理組的小RNA測序數(shù)據(jù)庫與對照組的小RNA測序數(shù)據(jù)庫的序列信息，從熱處理組的小RNA測序數(shù)據(jù)庫中分離出相對于對照組的小RNA序列豐度(較佳地，通過測序結(jié)果計(jì)算豐度變化)顯著下降2倍以上(較佳地3倍以上，更佳地4倍以上，更佳地5倍以上)的小RNA序列，其即為(潛在的)具有熱響應(yīng)作用的小RNA。在另一優(yōu)選例中，所述的小RNA包括mRNA, rRNA, tRNA或基因間RNA(intergenicRNA)。在另ー優(yōu)選例中，步驟(I)中，將2.5-3.5周(更佳地3周)大小的熱敏感白菜苗在46±0. 2°C熱處理1±0. 05小時，作為熱處理組；以未經(jīng)熱處理的2. 5-3. 5周(更佳地3周)大小的熱敏感白菜苗作為對照組。在另ー優(yōu)選例中，步驟(2)中，在分別提取熱處理組和對照組白菜苗的RNA，還包括步驟測序并分離出葉綠體相關(guān)的RNA序列。在另ー優(yōu)選例中，步驟(2)中，通過BLAST分析，將所述的RNA與葉綠體基因組序列進(jìn)行匹配，從而分離出葉綠體相關(guān)的RNA序列。在另ー優(yōu)選例中，通過Northern blot方法進(jìn)ー步驗(yàn)證小RNA的表達(dá)情況。在另ー優(yōu)選例中，非熱處理的階段，所述的熱敏感白菜在常溫下培養(yǎng)。在另ー優(yōu)選例中，所述的常溫是22 ± 3°C。在另ー優(yōu)選例中，所述的常溫是22 ± 2°C ;更佳地，所述的常溫是22 ± I °C。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的小RNA，其是通過所述的方法獲得的。在另ー優(yōu)選例中，所述的小RNA具有選自SEQ ID NO :1，SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :3所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的小RNA的用途，用于響應(yīng)熱信號，參與植物的抗熱反應(yīng)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、白菜植株在熱壓カ下黃化變化。 A、22°C，lh，生長到20天的植株；B,44°C, Ih,生長到20天的植株；C、46°C，lh,生長到20天的植株；D、不同高溫處理后葉片發(fā)生黃化的時間進(jìn)程；其中，緑色(葉片綠色)表示熱處理后緑色葉片比例，黃色(葉片黃化)表示熱處理后黃化的葉片比例。圖2、每個測序數(shù)據(jù)庫中csRNA占有比例。A、白菜測序數(shù)據(jù)庫中唯一序列和富集序列中csRNA比例；B、擬南芥數(shù)據(jù)庫中唯一序列和富集序列中csRNA比例；C、白菜和擬南芥測序數(shù)據(jù)庫唯一序列中csRNA同異比例。圖3、白菜csRNA在高溫及常溫培養(yǎng)條件下唯一序列及豐度序列變化。由圖中第一列(total即總體上包括所有的葉綠體小RNA，其它幾列是細(xì)分rRNA，tRNA, mRNA, igRNA)的兩個柱形圖可以看出，縱坐標(biāo)是HT比MT，S卩I代表為MT的值，第一列中唯一序列柱形圖值為O. 75，即HT是MT的75%，也就是總的葉綠體小RNA (csRNA) HT比MT減少了 25% ;第一列柱形圖小RNA總豐度值是O. 64，即HT是MT的64%，也就是總的葉綠體小RNA豐度HT比MT減少了 36%。圖4、針對來源于白菜葉綠體ig-RNA的24nt長的csRNA的Northern blot結(jié)果。圖5、針對來源于白菜葉綠體rRNA的32nt長的csRNA的Northern blot結(jié)果。圖6、針對來源于白菜葉綠體tRNA的29nt長的csRNA的Northern blot結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次掲示了一種適用于篩選白菜熱響應(yīng)相關(guān)的小RNA的方法，所述方法通過對處于特定生長時間段的熱敏植株進(jìn)行適當(dāng)熱處理，然后獲取該植株對葉綠體相關(guān)小RNA，與非熱處理的對照植株的葉綠體相關(guān)小RNA進(jìn)行比較而實(shí)現(xiàn)篩選。本發(fā)明還提供了一些篩選獲得的具有熱響應(yīng)反應(yīng)的小RNA。術(shù)語如本文所用，所述的“植物(作物)”包括各種農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是(不限干)雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。作為ー種優(yōu)選方式，所述的“植物”包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限干十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜等，十字花科鼠耳芥屬的擬南芥等，禾本科的水稻，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科蕓薹屬或鼠耳芥屬的植物。如本文所用，所述的“白菜(Brassica rapa ssp. chinensis) ”為十字花科蕓薹屬一年生、二年生草本植物。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的“小RNA”是指來源于植物葉綠體的、長度在9_36nt的RNA序列，其潛在地參與了對其相應(yīng)的靶序列表達(dá)的調(diào)控。所述的“小RNA”包括但不限于mRNA，rRNA, tRNA,基因間 RNA (intergenic RNA)。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上 由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。所述的“抗熱反應(yīng)”是指植物對于高溫的環(huán)境所做出的應(yīng)激反應(yīng)，植物中一些對高溫有響應(yīng)的基因表達(dá)也會發(fā)生變化，以適應(yīng)環(huán)境或參與ー些事件以抵抗高熱。所述的高溫一般指空氣溫度大于30°C (如35°C，40°C )，而相應(yīng)的土壤表面溫度可高達(dá)40-60°C。如本文所用，所述的“唯一序列”是指單一的小RNA序列，就是把所有相同序列的小RNA合并成ー個種類,ー個唯一序列就是ー種小RNA。如本文所用，所述的“豐度”就是ー種序列的小RNA存在的總數(shù)量(如序列的條數(shù))，也即相同序列的小RNA的總數(shù)量。小RNA的篩選為了高效地獲得對熱反應(yīng)響應(yīng)的葉綠體小RNA，本發(fā)明人致力于開發(fā)高通量的篩選方法。在研究篩選手段的過程中發(fā)現(xiàn)，為了獲得具有可比性且差異顯著的小RNA序列信息，對熱處理組植物的高溫處理方法、處理?xiàng)l件(包括溫度、時間)是較為關(guān)鍵的，植物所處的生理階段也是較為關(guān)鍵的。經(jīng)過深入的研究，本發(fā)明人將2-4周大小的熱敏感白菜苗在46±0. 5°C熱處理1±0. I小時，作為熱處理組；將未經(jīng)熱處理的2-4周大小的熱敏感白菜苗作為對照組。以該兩組為基礎(chǔ)，分別從中分離出小RNA(如葉綠體來源的小RNA)，進(jìn)行豐度和/或表達(dá)量的比較，獲得熱處理后豐度和/或表達(dá)量發(fā)生顯著改變的小RNA，該小RNA或其靶序列可以作為潛在的參與植物抗熱反應(yīng)的物質(zhì)。本發(fā)明的篩選方法中，優(yōu)選以2-4周大小的熱敏感白菜苗進(jìn)行熱處理。本發(fā)明人長期研究發(fā)現(xiàn)，該周齡的白菜苗對于熱處理是較為敏感的，2-4周苗就可以鑒定出對熱敏感程度，并在基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)上形成差異化。選擇2-4周苗進(jìn)行熱處理而非選擇種子(如萌動種子)相比，其優(yōu)點(diǎn)在于2-4周的苗已經(jīng)具備完全的植株特征，即具有典型的根、莖、葉等生物學(xué)特征，這個時期植株本身涉及正常生長發(fā)育的基因都已經(jīng)啟動，遺傳信息全面，包括各種生理生化反應(yīng)進(jìn)程，這個時期進(jìn)行熱處理，可以更好地收集對熱反應(yīng)的遺傳信息表達(dá)變化,即通過葉綠體小RNA的高通量測序分析，能夠全面理解植物葉綠體小RNA對熱響應(yīng)發(fā)生的變化，有利于進(jìn)ー步尋找有抗熱價值的葉綠體小RNA。如果利用萌動種子進(jìn)行熱處理，不能提供全面的遺傳信息表達(dá)規(guī)律，即植株沒有長成，不具備典型的根、莖、葉等器官組織特征，許多基因沒有表達(dá)。本發(fā)明的篩選方法中，優(yōu)選在46±0. 5°C進(jìn)行熱處理。本發(fā)明人長期研究發(fā)現(xiàn)，該溫度是適合于篩選工作的，可較好地體現(xiàn)小RNA的表達(dá)差異。低于該溫度則差異顯著性差；高于該溫度則導(dǎo)致植物的葉片過快發(fā)生黃化甚至死亡。在經(jīng)過熱處理后，白菜苗恢復(fù)到在常溫條件下培養(yǎng)。用于培養(yǎng)白菜的培養(yǎng)介質(zhì)沒有特別的限制，適合于白菜苗期生長的培養(yǎng)介質(zhì)均是可用的。RNA序列的比較或匹配是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，常規(guī)的例如可通過BLAST法，許多現(xiàn)有的軟件也可支持序列比較。豐度的測定可通過小RNA高通量測序(Illumina GAII)的方法測定，或通過本領(lǐng)域已知的其它方法進(jìn)行。小RNA的表達(dá)量可通過領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)來獲得，常規(guī)的例如通過Northern印跡技木，例如可設(shè)計(jì)特異性針對該小RNA的探針(攜帯可檢測信號，如熒光)來測定。
在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，本發(fā)明人選取了熱敏感的白菜品系，給予不同溫度處理，尋找到一個比較合適的熱處理?xiàng)l件，即3周大小的種苗46°C熱處理lh，對照為正常生長條件下種苗，分別對處理和對照種苗進(jìn)行提取葉綠體RNA樣品，然后送樣進(jìn)行小RNA高通量測序。獲得高通量小RNA測序結(jié)果，經(jīng)過去測序接頭序列后，再除去質(zhì)量差的序列，獲得了比較理想的熱處理和對照組的白菜葉綠體小RNA高通量測序數(shù)據(jù)庫。對數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，葉綠體小RNA包括了 mRNA，rRNA, tRNA,以及基因間RNA(intergenic RNA)，其中rRNA來源的小RNA主要集中定位在rRNA的3’端，而tRNA來源的小RNA主要定位在tRNA的5’端。熱處理后，葉綠體來源的小RNA大量減少，除了 24nt長的小RNA。熱反應(yīng)作用的小RNA本發(fā)明還包括采用所述篩選方法獲得的小RNA，這些小RNA是對高溫具有響應(yīng)作用的小RNA，也是潛在的參與植物抗熱作用的小RNA。這些篩選獲得的小RNA可以構(gòu)成ー個庫，便于進(jìn)行進(jìn)ー步的實(shí)驗(yàn)或研究，從中找到確定的參與植物抗熱作用的小RNA。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，提供了 3個新的白菜葉綠體小RNA，它們分別為來自ig-RNA 的 24nt 長的 UUCAUGGACGUUGAUAAGAUCUUU (SEQ ID NO 1);來自 rRNA 的 32nt 長的 UGAGGCAUCCUAACAGACCGGUAGACUUGNAC (SEQ ID NO 2, N 表示 A、U、C 或 G)；以及來自 tRNA 的29nt 長的 GGGGAUAUAGCUCAGUUGGUAGAGCUCCG(SEQ ID NO :3)。在熱處理過程中，這三個小RNA熱反應(yīng)變化最大，這些新的葉綠體小RNA可能在植物抗熱反應(yīng)中起作用，更可能調(diào)控葉綠體RNA加工，蛋白質(zhì)翻譯以及亞細(xì)胞信號，從而為作物抗熱育種開辟新的認(rèn)識方式及理論依據(jù)。采用所述方法篩選獲得的小RNA所對應(yīng)的靶基因也是研究的對象，小RNA表達(dá)或豐度的顯著降低預(yù)示著其靶基因的表達(dá)也發(fā)生了變化，因此這些靶基因是潛在的參與植物抗熱作用的基因。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法植物材料與培養(yǎng)條件白菜熱敏感系Wu-Il(種子來自于上海孫橋農(nóng)業(yè)科技有限公司)。將白菜種子浸潤，播在培養(yǎng)皿中，22°C培養(yǎng)至種子萌發(fā)，I周后，萌發(fā)的幼苗轉(zhuǎn)移到土盆中，人工氣侯室繼續(xù)培養(yǎng)，22°C，每天光照16h，黑暗8h。3周大小的種苗46°C熱處理lh，恢復(fù)22°C正常培養(yǎng)。觀察葉片黃化的情況。另有一部分熱處理后種苗直接提取總RNA。對照為22°C正常培養(yǎng)，以確定小RNA的表達(dá)模式。RNA提取和質(zhì)量檢測 上述條件熱處理后樣品(熱處理后直接提取RNA)及對照種苗在液氮中研磨，每個樣品10株苗分成兩個重復(fù),使用TRIzol Reagent (Invitrogen)提取總RNA。RNA樣品濃度和質(zhì)量利用 Eppendorf Biophotometer 6121 (Eppendorf)檢測，樣品中的 DNA 利用 TURBODNA-free kit (Ambion)去除。具體如下I)液氮中將材料研磨充分。2)研磨好的材料轉(zhuǎn)到EP管中，加Iml Trizol。3)震蕩，室溫放置10分鐘。4)加入O. 2ml氯仿，震蕩，室溫放置10分鐘。5)4で，12000rpm，離心 10 分鐘。6)取上清，加入I倍體積異丙醇，混勻，冰上放置15分鐘。7) 4°C, 12000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。8)70%こ醇洗ー次，離心(4で，12000印111，5分鐘)，棄上清。超凈臺吹干。9)用30 μ I DEPC處理過的水溶解，_70°C存放。葉綠體分離種苗樣品中葉綠體分離使用蔗糖梯度離心Percoll (GE，17089101)gradient-Dased method[Kubis bE, Lilley KS, Jarvis P-Isolation and preparationofchloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.Methods Mol Biol 2008,425:171-186]。葉綠體的完整度利用顯微鏡觀察檢驗(yàn)(Olympus BX51 wide-fieldmicroscopewith differential interference contrast)和 Hill reaction[Bregman A Laboratoryinvestigations in cell and molecular biology (Third Edition)New York John Wiley& Sons ； 1990]。小RNA高通量測序及序列分析大白菜及擬南芥總RNA 樣品被送到 Keygene N. V. , ffageningen, theNetherlands和浙江大學(xué)加州納米研究所(Zhejiang-California Nanosystemslnstitute,China),利用Illumina GAII sequencer 進(jìn)行測序。使用 EMBOSS 軟件包的 vectorship 去除 Illumina接頭序列，長度為9 36nt的小RNA序列匹配到白菜葉綠體基因組(GenBank accessionnumber DQ231548)of Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. chinensis)以及擬南芥基因組(http://www.arabidopsis.org)。所有的數(shù)據(jù)在比較分析前都進(jìn)行均一化。Northern blot 分析
RNA (20 μ g)樣品在19%變性聚丙烯凝膠電泳(PAGE)上分離，利用毛細(xì)管作用在 20 X SSC 溶液中轉(zhuǎn)移到 Hybond-XL 膜(Amersham biosciences-GEhealthcare)上，利用UV-crosslinking 固定在膜上。預(yù)雜交 42°C, 2X 30min,使用雜交液 PrefectHyb(Sigma)。DNA 探針利用 T4polynucleotide kinase (Roche)標(biāo)記上 y 32P ATP (5000Ci/mmol)。雜交42°C過夜。RNA分子大小用32P-標(biāo)記的Decade Marker System(Ambion)做標(biāo)記。為了分析葉綠體轉(zhuǎn)錄本積累情況，另ー個RNA轉(zhuǎn)移膜按照Bollenbach TJ, Schuster G, SternDB Cooperation ofEndo-and Exoribonuclease in cnloroplast mRNA turnover.ProgNucleic Acid ResMol Biol 2004，78 :305-377 方法進(jìn)行分析。環(huán)形RT-PCR (cRT-PCR)
葉綠體小RNA的5’和3’端精確位置利用環(huán)形RT-PCR獲得。DNase酶處理過的葉綠體RNAs樣品在40單位(U)的T4RNA連接酶(New England Biolabs)作用下，產(chǎn)生5’與3’端連接的環(huán)形RNA分子。用酹-氯仿抽提后，在反轉(zhuǎn)錄酶Revertra Ace (TRT-101,Toyobo)和特異引物作用下，單鏈cDNAs被合成。接下來利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，正向引物(cRTPrimer I gctcgacgccaggatg(SEQ ID NO :7))同 csR-5sr-l,反向引物(cRT Primer 2:gtgttaagcttttcat(SEQ ID NO :8))。PCR 條件 30 個循環(huán)，94 °C，30s，48 °C，30s 和 72 °C，30s。cRT-PCR 產(chǎn)物用 MagExtractor (NPK-600，Toyobo)純化，然后連接到測序載體 pMD18_Tvector (D101A, Takara)送樣測序。II.實(shí)施例實(shí)施例I、不同溫度和時間處理?xiàng)l件下葉片白化水平——確定熱處理?xiàng)l件為確定高溫對葉片白化的影響，本發(fā)明人將白菜種苗置于44，45，46，47和48°C，分別處理O. 5，1和2小時。如圖I所示，種苗在44°C處理0.5h，生長與正常22°C (MT)下相同，當(dāng)在44°C處理lh，其生長比正常條件下緩慢，熱處理后22天葉片開始黃化。這指出44°C，lh熱處理引起種苗形態(tài)和生理發(fā)生變化。溫度提高及處理時間延長，生長受抑制表現(xiàn)更為嚴(yán)重(圖1D)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，熱處理46°C、lh，種苗在處理后12天葉片開始黃化(圖1C);熱處理47°C、lh，葉片黃化在熱處理后第5天。這掲示了 47°C、lh是這一生態(tài)型植株熱忍受警戒線。由于在早期基因表達(dá)和生理反應(yīng)之間的不同，如果選用熱處理47°C、lh，種苗的葉片過早黃化，有些熱響應(yīng)基因還沒有得到充分熱響應(yīng)表達(dá)就因種苗生長受到抑制而被印制；如果選用熱處理44°C，lh，種苗對熱反應(yīng)引起的形態(tài)和生理變化緩慢，不能更好地表現(xiàn)出熱響應(yīng)基因應(yīng)有的熱響應(yīng)表達(dá)模式，因此，從熱反應(yīng)表型作為依據(jù)，本發(fā)明人選擇分別以46°C處理I小時(HT，熱處理組)和正常溫度22°C (MT，對照組)處理用于小RNA高通量測序并比較，能夠更好地反應(yīng)出熱響應(yīng)小RNA的熱響應(yīng)表達(dá)模式的變化。實(shí)施例2、白菜葉綠體基因組產(chǎn)生的小RNA-測序數(shù)據(jù)分析，將小RNA序列匹配
到葉綠體基因組上為了解白菜小RNA表達(dá)模式，本發(fā)明人對HT和MT處理種苗提取的RNA樣品進(jìn)行測序，利用 Illumina Genome Analyzer MiRvana kit (Ambion, Inc)分析 9-36 核苷酸(nt)長度的小RNA。兩個重復(fù)HT處理分別產(chǎn)生1460萬(HTl)和1280萬(HT2)個序列讀數(shù)，兩個重復(fù)MT處理分別產(chǎn)生1470萬(MTl)和1130萬(MT2)個序列讀數(shù)。為了從整個序列讀數(shù)群中選擇葉綠體小RNA，本發(fā)明人去除接頭序列后，對白菜基因組序列進(jìn)行BLAST，整理出完全匹配到葉綠體上的小RNA,命名為葉綠體相關(guān)小RNA(chloroplast_related smallRNA(csRNA))。本發(fā)明人從MT和HT中分別獲得2，228，924和I, 331，972個csRNA,分別代表了142，542個和97，337個唯一小RNA序列，分別占總小RNA數(shù)(以HTl和MTl的讀數(shù)計(jì))的約15% (葉綠體小RNA豐度占總小RNA豐度的比值，(2，228，924/1470萬)X 100% )和約10% ((I, 331，972/1460 萬)X 100% )(圖 2A)。通過對擬南芥葉綠體基因組DNA匹配，多于96%的白菜csRNA完全匹配到擬南芥葉綠體基因組上。擬南芥數(shù)據(jù)庫中唯一序列和富集序列中csRNA比例見圖2B。白菜和擬南芥測序數(shù)據(jù)庫唯一序列中csRNA同異比例見圖2C。實(shí)施例3、csRNA的抗熱反應(yīng)——熱處理與對照之間小RNA表達(dá)差異(表現(xiàn)為豐度和種類)在亞細(xì)胞水平，熱壓カ嚴(yán)重?fù)p害了葉綠體活性和結(jié)構(gòu)[Smillie RM, CritchleyC,Bain JM, Norr REffect of Growth Temperature on Chloroplast Structure·andActivity in Barley. Plant physiol 1978,62 :191-196],例如葉綠體 Cu/Zn 過氧化物超氧歧化酶丟失和對光合系統(tǒng)II損害增加[Sainz M, Diaz P, Monza J, BorsaniO Heatstress results in loss of chloroplast Cu//,n superoxide dismutase anaincreaseddamage to Photosystem II in combined drought—heat stressed Lotusjaponicus.Physiol Plant 2010,140 :46-56]。植株在46°C處理I小時，與常溫狀態(tài)比，csRNA明顯減少，分別為常溫總量的25%唯一序列和36%豐度(圖3)。實(shí)施例4、一組來源白菜葉綠體的csRNA熱響應(yīng)作用對實(shí)施例2獲得小RNA測序樣本數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選取熱處理與對照相比較表達(dá)下降超過5倍的典型的小RNA序列,表達(dá)變化通過豐度體現(xiàn),之后可進(jìn)ー步用Northernblot驗(yàn)證這種表達(dá)的變化，即在熱處理中下降。通過高通量測序結(jié)果分析熱處理組小RNA序列和對照組小RNA序列，本發(fā)明人確定了在常溫及高溫條件下變化劇烈(表達(dá)量降低5倍以上)的小RNA對熱反應(yīng)響應(yīng)。找到的對熱反應(yīng)響應(yīng)的小RNA分別為來自ig-RNA 的 24nt 長的 UUCAUGGACGUUGAUAAGAUCUUU (SEQ IDNO 1);來自 rRNA的 32nt 長的 UGAGGCAUCCUAACAGACCGGUAGACUUGNAC(SEQ ID NO :2，N 表示 A、U、C 或 G);以及來自 tRNA 的 29nt 長的 GGGGAUAUAGCUCAGUUGGUAGAGCUCCG(SEQ ID NO :3)。它們的更為詳細(xì)的信息如表I。表I、HT中相對于MT下調(diào)至20%以下的CsRNAa
CSRNAim 大た豐度(Reads)bmm被CDS信息
__Μ._
__腸腿一 I ^=|
^^^^GA^UCCG7 29 5359 4742 507 539 102742..102770 tm-Ala—3 tRNA stmnd=+ 103665 103702 hi1=2CMUAAGAUCTOU 24 1914 1543 333 299 103694..103717 ig-RNA 114 ig-RNA stamd—+ 104539 104690 hit-2ACCC^AGACUUGNAC 32 6 20 1 1 106746..106777 4.5S rm rRNA strand=+ 107599 107701 hit=^
a:所述的下調(diào)表示(ΗΤ-1+ΗΤ-2)/(ΜΓ-1+ΜΤ-2) < 0.2b:所述的為在標(biāo)準(zhǔn)化—midi—on)之前的序列讀數(shù)用Northern blot進(jìn)ー步確證小RNA對溫度的反應(yīng)(即驗(yàn)證其表達(dá)量變化)。針對來源于白菜葉綠體ig-RNA 的 24n 長 csRNA (SEQ ID NO I)的 Northern blot結(jié)果見圖4，探針序列為TTCATGGACGTTGATAAGATCTTT(SEQID NO 4)的反向互補(bǔ)序列。針對來源于白菜葉綠體rRNA的32nt長csRNA (SEQ ID NO 2)的Northernblot結(jié)果見圖 5，探針序列為 TGAGGCATCCTAACAGACCGGTAGACTTGNAC(SEQ ID NO 5)的反向互補(bǔ)序列。針對來源于白菜葉綠體tRNA的29nt長csRNA (SEQ ID NO 3)的Northernblot結(jié)果見圖6，探針序列為GGGGATATAGCTCAGTTGGTAGAGCTCCG(SEQID NO 6)的反向互補(bǔ)序列。實(shí)施例5、csRNA對植物抗熱有重要作用葉片黃化是植物對高溫敏感的ー個重要指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境暴露在溫和熱壓カ下，類囊體膜結(jié)構(gòu)受到損害，光合系統(tǒng)I中電子傳遞流動量増加，導(dǎo)致產(chǎn)生大量光氧化壓力和伴隨釋放高強(qiáng)度細(xì)胞毒性的自由基和活性氧。當(dāng)葉綠體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)在熱壓カ下受損，光合能力急劇下降。這個改變通常伴隨葉片黃化。對于白菜抗熱品系，相對于熱敏感品系，葉片黃化出現(xiàn)的較晩，較輕。高溫條件下，46°c處理lh，葉片黃化后csRNA大量減少。提示熱響應(yīng)csRNA跟葉片黃化表型有夫。ー個合理解釋是熱響應(yīng)csRNA具有維持葉綠體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和光合能力的作用。當(dāng)植株暴露在高溫條件下，熱響應(yīng)csRNA生物合成受抑制，導(dǎo)致這些csRNA豐度急劇降低?；蛘呖梢哉J(rèn)為，熱響應(yīng)csRNA在高溫條件下降解。每ー個csRNA參與調(diào)控葉綠體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和光合能力中的基因表達(dá)，植物葉綠體的這個生物加工與葉片發(fā)育是緊密相關(guān)聯(lián)的，這個過程也包括了ー些miRNAs參與。結(jié)論葉綠體是ー個重要的器官，其含有大量的小RNA，本發(fā)明人的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，葉綠體小RNA不是RNA降解或生物合成的隨機(jī)產(chǎn)物，而是ー類新的有精確定位的小RNA，在葉綠體RNA加工、翻譯調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要抗熱調(diào)節(jié)作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每ー篇文獻(xiàn)被単獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種篩選具有熱響應(yīng)作用的小RNA的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)將2-4周大小的熱敏感白菜苗在46±0.5°C熱處理I±0. I小時，作為熱處理組；以未經(jīng)熱處理的2-4周大小的熱敏感白菜苗作為對照組； (2)分別提取熱處理組和對照組白菜苗的RNA，分別獲得熱處理組和對照組的小RNA測序數(shù)據(jù)庫，其中小RNA序列的長度為9-36nt ； (3)比較熱處理組的小RNA測序數(shù)據(jù)庫與對照組的小RNA測序數(shù)據(jù)庫的序列信息，從熱處理組的小RNA測序數(shù)據(jù)庫中分離出相對于對照組的小RNA序列豐度顯著下降2倍以上的小RNA序列，其即為具有熱響應(yīng)作用的小RNA。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的小RNA包括mRNA，rRNA,tRNA或基因間 RNA。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，將2.5-3. 5周大小的熱敏感白菜苗在46±0. 2°C熱處理1±0. 05小時，作為熱處理組；以未經(jīng)熱處理的2. 5-3. 5周大小的熱敏感白菜苗作為對照組。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，在分別提取熱處理組和對照組白菜苗的RNA，還包括步驟測序并分離出葉綠體相關(guān)的RNA序列。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，通過BLAST分析，將所述的RNA與葉綠體基因組序列進(jìn)行匹配，從而分離出葉綠體相關(guān)的RNA序列。
6.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,通過Northernblot方法進(jìn)ー步驗(yàn)證小RNA的表達(dá)情況。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，非熱處理的階段，所述的熱敏感白菜在常溫下培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的常溫是22±3°C。
9.一種分離的小RNA，其是通過權(quán)利要求1-8任一所述的方法獲得的。
10.如權(quán)利要求9所述的小RNA，其特征在于，所述的小RNA具有選自SEQIDNO 1,SEQID NO :2或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求9或10所述的小RNA的用途，用于響應(yīng)熱信號，參與植物的抗熱反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及大白菜葉綠體來源的小RNA及其熱響應(yīng)作用。首次揭示了一種適用于篩選白菜熱響應(yīng)相關(guān)的小RNA的方法，所述方法通過對處于特定生長時間段的熱敏植株進(jìn)行適當(dāng)熱處理，然后獲取該植株對葉綠體相關(guān)小RNA，與非熱處理的對照植株的葉綠體相關(guān)小RNA進(jìn)行比較而實(shí)現(xiàn)篩選。本發(fā)明還提供了一些篩選獲得的具有熱響應(yīng)反應(yīng)的小RNA。
文檔編號C12N15/11GK102690820SQ20111007430
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者于祥, 何玉科, 孫傳寶, 王晗, 王璐 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院