專利名稱：一種含鈰磁性納米粒子用于脂肪酶的固定化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪酶的固定化技術(shù)，屬于脂肪酶固定化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酶是一種天然的高分子催化劑，催化效率極高、反應(yīng)專一性強(qiáng)、來源廣泛、無污染，在食品加工、醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)中有著極為廣闊的應(yīng)用。但天然酶穩(wěn)定性差、易失活、 不能重復(fù)使用，并且反應(yīng)后易混入產(chǎn)品，純化困難，難以在工業(yè)中廣泛的應(yīng)用。此外，分離和提純酶以及它們的一次性使用也大大增加了其作為催化劑的成本。為了克服這些問題，酶的固定化技術(shù)于20世紀(jì)60年代應(yīng)運(yùn)而生并發(fā)展起來，成為近幾年酶工程研究的重點(diǎn)。固定化酶(Immobilized Enzyme)是通過物理的或化學(xué)的方法，將酶分子束縛在載體上，使其既保持酶的天然活性，又便于與反應(yīng)液分離，可以重復(fù)使用，它是酶制劑中的一種新劑型。過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。1971年第一屆國際酶工程會上正式建議采用固定化酶的名稱。而作為固定化酶的一部分，載體材料的結(jié)構(gòu)和性能對固定化酶的各種性能都有著巨大的影響。由于載體材料的重要性，因此自固定化酶技術(shù)興起以來，很多學(xué)者就一直致力于對載體的研究。迄今為止，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，固定化酶的載體材料已從最初的天然高分子材料發(fā)展到合成高分子材料、無機(jī)材料，以及現(xiàn)在的復(fù)合材料等。復(fù)合載體材料是以有機(jī)材料和無機(jī)材料復(fù)合組成的新載體材料。如磁性納米粒子與其它載體材料相比，磁性納米粒子作為固定化載體具有從反應(yīng)體系中易分離和回收、操作簡便、成本較低等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此引起了國內(nèi)外許多學(xué)者的廣泛關(guān)注。脂肪酶是催化動植物油脂進(jìn)行水解、酯交換反應(yīng)一大類生物酶。脂肪酶催化反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物顏色淺，副產(chǎn)物少，且具有專一性，利于生產(chǎn)高質(zhì)量單甘油酯、脂肪酸、甘油和其它種類油脂產(chǎn)物。但脂肪酶價格較高，且用游離脂肪酶進(jìn)行反應(yīng)時，脂肪酶只能使用一次而不能回收，因此造成產(chǎn)物成本較高，且導(dǎo)致后續(xù)分離步驟困難，影響利用脂肪酶水解和酯交換進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。解決這一問題較好方法是對脂肪酶進(jìn)行固定化，酶固定化是應(yīng)用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn)行其特有催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)。在酶固定化過程中，固定化酶性能取決于固定化酶所使用載體材料性質(zhì)和固定化方法。如殼聚糖及其衍生物、纖維素及其衍生物、凝膠材料，有機(jī)合成聚合物、磁性粒子、無機(jī)材料、絲質(zhì)和甲殼素等在酶固定化領(lǐng)域中應(yīng)用。磁性納米材料是指具有納米量級超微粒構(gòu)成固體物質(zhì)。納米材料具有如下結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(1)結(jié)構(gòu)單元或特征維度尺寸在納米數(shù)量級(I-IOOnm) ； (2)存在大量界面或自由表面； (3)各納米單元之間存在一定相互作用；(4)磁性，可方便簡單進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向。由于納米材料結(jié)構(gòu)上特殊性，使納米材料具有一些獨(dú)特效應(yīng)，主要表現(xiàn)為小尺寸效應(yīng)和表面或界面效應(yīng)，因而在性能上與相同組成微米材料有非常顯著差異，體現(xiàn)出許多優(yōu)異性能和全新功能，在酶固定化領(lǐng)域可望有廣泛應(yīng)用。與其它載體材料相比，磁性高分子微球作為固定化脂肪酶的載體具有諸多優(yōu)點(diǎn)提高酶的穩(wěn)定性，易于將酶與底物和產(chǎn)物分離；提高酶的生物相容性和免疫活性；操作簡便，可降低成本；磁性載體固載酶放入磁場穩(wěn)定的流動床反應(yīng)器中，可以減少持續(xù)反應(yīng)體系中的操作，適合于大規(guī)模連續(xù)化操作；利用外部磁場可以控制磁性材料固定化酶的運(yùn)動方式和方向，替代傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌方式，提高固定化酶的催化效率。
本發(fā)明的目的就是將含鈰磁性納米粒子用于共價固定脂肪酶，確定脂肪酶固定化的條件，使一定量的載體納米粒子上所固定的脂肪酶的酶活力達(dá)到最大，并對比了固定化酶和游離酶的酶學(xué)特性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是將含鈰磁性納米粒子用于共價固定脂肪酶，確定脂肪酶固定化的條件，使一定量的載體納米粒子上所固定的脂肪酶的酶活力達(dá)到最大，并對比了固定化酶和游離酶的酶學(xué)特性。提供了一種新型的固定化脂肪酶，使脂肪酶的PH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性均比自由酶明顯提高，固定化脂肪酶具有從反應(yīng)體系中易分離和回收、操作簡便從而使成本較低。本發(fā)明的技術(shù)方案一種含鈰磁性納米粒子用于脂肪酶的固定化技術(shù)，將脂肪酶直接加入牛乳中，酶的活性較低、半衰期短，酶只能使用一次，利用率低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，限制了半脂肪苷酶在乳制品工業(yè)中的應(yīng)用。為克服這些問題，可通過物理的或化學(xué)的方法，將脂肪酶分子束縛在載體上，使其既保持酶的天然活性，又便于與反應(yīng)液分離，并可以重復(fù)使用，即固定化脂肪酶。主要處理方法稱取1. Og無皂乳液聚合制備的P(AM-C0-St)-Ce(III)磁性高分子納米微球粉末于50mL三角燒瓶中，加入一定量含酶的緩沖液5mL，35°C條件下震蕩(120r/ min)反應(yīng)30h，離心直到上清液中脂肪酶的偶聯(lián)率大于95%，抽濾，用5°C的去離子水洗滌， 得到固定化脂肪酶。根據(jù)固定化脂肪酶磁性粒子的沉降時間，考察納米磁性粒子的磁分離性能。根據(jù)固定化酶的偶聯(lián)率和活力回收的影響，確定了納米微球粒徑，鈰的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及給酶量。根據(jù)酶的活性確定了固定化脂肪酶的pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性范圍。所述納米磁性粒子的磁分離性能固定脂肪酶后的磁性納米微球具有優(yōu)異的磁分離能力，在緩沖液中，磁沉降速度是重力沉降的15倍；在正己烷中，磁沉降速度是重力沉降的60倍。所述納米微球粒徑對偶聯(lián)率和活力回收的影響隨著微球直徑的增加，固定化酶的偶聯(lián)率逐漸減小，活力回收也逐漸減小。所述鈰的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對偶聯(lián)率和活力回收的影響微球表面鈰納米粒子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1. 時，固定化酶的偶聯(lián)率和活力回收為96%和74%。所述給酶量對偶聯(lián)率和活力回收的影響隨著給酶量的增加，固定化酶的偶聯(lián)率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，但在給酶量80mg/g時，酶的活力回收仍高達(dá)60%。所述固定化脂肪酶的PH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性范圍固定化脂肪酶在 PH值6-9范圍內(nèi)均保持較高的活性；最適反應(yīng)溫度為50°C，比游離酶的最適反應(yīng)溫度高了 IO0C ；固定化脂肪酶反復(fù)使用7次后，酶活仍保持了 75%以上。本發(fā)明的有益效果第一次將含鈰磁性納米粒子用于脂肪酶的固定化技術(shù)，可以提高脂肪酶的活性， 延長半衰期，由于固定化酶可以循環(huán)利用，從而提高了酶的利用率，降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本。固定化后的脂肪酶有了更寬的PH適用范圍，熱穩(wěn)定性得到明顯提高，最適反應(yīng)溫度達(dá)到50°C，固定化脂肪酶反復(fù)使用7次后，酶活仍保持了 75%以上；同時鈰離子對固定化脂肪酶有明顯的激活作用，當(dāng)鈰離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 時，固定化酶的偶聯(lián)率和活力回收為 96%和 74%。


附圖為含鈰磁性納米粒子固定化脂肪酶的工藝流程示意圖。
具體實施例方式實施例1 以含鈰磁性納米粒子固定磷脂酶A1采用無皂乳液聚合制備P (AM-co-St)-Ce (III)磁性高分子納米微球，然后通過共價鍵固定磷脂酶A115具體實施方法本發(fā)明的主要過程為稱取1. Og含鈰磁性納米粒子粉末于50mL三角燒瓶中，加入一定量含酶的緩沖液5mL，35°C條件下震蕩(120r/min)反應(yīng)30h， 離心直到上清液中脂肪酶的偶聯(lián)率大于95%，抽濾，用5°C的去離子水洗滌，得到固定化磷脂酶、。其中微球表面鈰納米粒子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 1%，隨著含酶緩沖液中的給酶量的增加， 固定化酶的偶聯(lián)率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，控制給酶量在30mg/g-70mg/g之間。固定磷脂酶A1后的磁性納米微球具有優(yōu)異的磁分離能力，在緩沖液中，磁沉降速度是重力沉降的15倍；在正己烷中，磁沉降速度是重力沉降的60倍，隨著微球直徑的增加，固定化磷脂酶A1的偶聯(lián)率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，微球直徑在IOOnm時，偶聯(lián)率和活力回收達(dá)到92%。固定化的磷脂酶A1在？!1值6. 0-8. 0范圍內(nèi)均保持較高的活性，相對活力均在 70%以上；最適反應(yīng)溫度為52°C，比游離酶的最適反應(yīng)溫度高了 7°C;固定化磷脂酶A1反復(fù)使用7次后，酶活仍保持了 75 %以上。實施例2 以含鈰磁性納米粒子固定南極假絲酵母脂肪酶采用無皂乳液聚合制備P (AM-co-St)-Ce (III)磁性高分子納米微球，然后通過共價鍵固定南極假絲酵母脂肪酶。具體實施方法本發(fā)明的主要過程為稱取l.Og含鈰磁性納米粒子粉末于50mL三角燒瓶中，加入一定量含酶的緩沖液5mL，35°C條件下震蕩(120r/ min)反應(yīng)30h，離心直到上清液中脂肪酶的偶聯(lián)率大于95%，抽濾，用5°C的去離子水洗滌， 得到固定化南極假絲酵母脂肪酶。其中微球表面鈰納米粒子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 1%，隨著含酶緩沖液中的給酶量的增加， 固定化酶的偶聯(lián)率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，控制給酶量在30mg/g-70mg/g之間。固定化南極假絲酵母脂肪酶后的磁性納米微球具有優(yōu)異的磁分離能力，在緩沖液中，磁沉降速度是重力沉降的15倍；在正己烷中，磁沉降速度是重力沉降的60倍，隨著微球直徑的增加，固定化南極假絲酵母脂肪酶的偶聯(lián)率逐漸減小，活力回收也逐漸減小，微球直徑在 IOOnm時，偶聯(lián)率和活力回收達(dá)到92%。固定化南極假絲酵母脂肪酶1在pH值6. 5-8. 8范圍內(nèi)均保持較高的活性，相對活力均在70%以上；最適反應(yīng)溫度為48°C，比游離酶的最適反應(yīng)溫度高了 5°C ；固定化南極假絲酵母脂肪酶反復(fù)使用7次后，酶活仍保持了 75%以上。
權(quán)利要求
1.一種含鈰磁性納米粒子用于脂肪酶的固定化技術(shù)，主要過程為稱取l.Og含鈰磁性納米粒子粉末于50mL三角燒瓶中，加入一定量含酶的緩沖液5mL，35°C條件下震蕩(120r/ min)反應(yīng)30h，離心直到上清液中脂肪酶的偶聯(lián)率大于95%，抽濾，用5°C的去離子水洗滌， 得到固定化脂肪酶，并對納米粒子進(jìn)行了磁性分析，確定了納米微球粒徑、鈰的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 給酶量對固定化酶偶聯(lián)率和活力回收的影響，和酶活的PH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性范圍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米微球粒徑納米微球粒徑在IOOnm時，偶聯(lián)率和活力回收均在90%以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鈰的質(zhì)量分?jǐn)?shù)微球表面鈰納米粒子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.時，偶聯(lián)率達(dá)到96 %，活力回收達(dá)到74 %。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的給酶量給酶量在30mg/g-70mg/g之間，偶聯(lián)率和活力回收均在60%以上，當(dāng)給酶量在30mg/g時，偶聯(lián)率和活力回收達(dá)到94%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶活的PH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性范圍固定化的脂肪酶在PH值6-9范圍內(nèi)均保持較高的活性，相對活力均在70%以上；最適反應(yīng)溫度為45°C，比游離酶的最適反應(yīng)溫度高了 5°C ；固定化脂肪酶反復(fù)使用7次后，酶活仍保持了 75%以上。
全文摘要
本發(fā)明采用無皂乳液聚合制備的P(AM-co-St)-Ce(III)磁性高分子納米微球，在此基礎(chǔ)上通過共價鍵固定脂肪酶，屬于脂肪酶固定化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是①第一次將含鈰磁性納米粒子用于脂肪酶的固定；②固定脂肪酶后的磁性納米微球具有優(yōu)異的磁分離能力，鈰離子對固定化脂肪酶有明顯的激活作用；③脂肪酶被固定化后其pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性均比自由酶明顯提高；④固定化后的脂肪酶的米氏常數(shù)比游離酶下降，說明脂肪酶在固定化后其結(jié)合底物的能力有所增強(qiáng)；⑤固定化脂肪酶具有從反應(yīng)體系中易分離和回收，可循環(huán)利用，而且操作簡便從而降低企業(yè)成本。
文檔編號C12N11/08GK102199591SQ20111008182
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者張暉, 張艷杰, 王立, 郭曉娜, 錢海峰, 齊希光 申請人:江南大學(xué)