專利名稱：從動物血球液中提取超氧化物歧化酶sod的新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超氧化物歧化酶SOD的提取工藝，特別是一種從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工藝。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶，簡稱S0D，是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)。在體內(nèi)，SOD能專一清除過多的氧自由基，有效地防御活性氧對生物體的毒害作用，對由超氧陰離子自由基引起的疾病有明顯的治療作用；在體外，SOD具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、增強人體免疫力等多種功能，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等行業(yè)，市場前景十分廣闊。自上世紀70年代，國外首次報道采用多級沉淀法純化了 CuSi-SOD。到目前為止， 國內(nèi)外的生物學、化學和醫(yī)藥學工作者已采用不同方法從不同的生物資源中分離到了 SOD 的純品。這些制備方法主要有溶劑沉淀法、鹽析法、超濾法和層析法等，但這些方法多數(shù)類同，成本高、工藝繁雜，局限于實驗室小規(guī)模制取，與SOD的市場需求不適應(yīng)。動物血液是國內(nèi)外正在生產(chǎn)SOD的主力資源，最常見是牛羊的血液。在我國，有著最為豐富的豬血資源，而且價格低廉，具有獨特的加工優(yōu)勢。但是由于加工工藝的不完善， 以致我國絕大部分動物血液資源未能開發(fā)利用，造成寶貴資源嚴重浪費和環(huán)境污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工藝，利用該工藝方法提取SOD工藝簡捷、成本低廉、操作方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)的新工藝。如上構(gòu)思，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD 的新工藝，其特征在于依照下列步驟完成(1)在新鮮的動物血液中加入檸檬酸鈉做抗凝處理，離心收集紅細胞，然后加入紅細胞體積1-3倍的去離子水，不斷攪拌，使紅細胞破碎，得溶血液；(2)向溶血液中加入單價中性金屬鹽，調(diào)節(jié)PH值到4. 0-7. 0，加熱至55_75°C，保溫反應(yīng)30-100min，冷卻至室溫，離心取上清，得SOD粗提液；(3)用中空纖維超濾裝置對SOD粗提液進行超濾濃縮得SOD濃縮液；(4)向SOD濃縮液中邊攪拌邊緩慢加入0. 4-1倍體積的預冷丙酮，離心取上清液；(5)然后向步驟(4)所得的清液中邊攪拌邊緩慢加入1. 2-1. 5倍體積的預冷丙酮， 離心取沉淀；(6)將沉淀用去離子水溶解，經(jīng)過陰離子交換樹脂或分子篩層析，冷凍干燥即可得 SOD精品凍干粉。上述抗凝處理時所使用的抗凝劑為食品級檸檬酸鈉，添加量為3. 5_5g/Kg動物血，攪拌溶血時間30-120min。上述單價中性金屬鹽可以是堿金屬的氯化物、溴化物、硝酸鹽和硫酸鹽中的任一種或幾種的混合物，至其終濃度為0. 1-1. 5mol/L。上述步驟C3)使用的中空纖維超濾裝置選擇截留分子量為4K-MK的膜組件，保持回流壓 0. 04-0. IMPa0上述步驟(6)中使用的陰離子交換層析是DEAE陰離子交換層析，層析柱先用 pH6. 5 8. 0的2. 5mM的磷酸緩沖液平衡，至^Onm無光吸收，然后上樣，換用單一濃度的洗脫液洗脫至^Onm無光吸收，收集SOD活力峰。其中的單一濃度洗脫液為與平衡層析柱的緩沖液PH相同、濃度為4 SmM的磷酸緩沖液。上述步驟(6)中使用的分子篩柱層析是kphadex GlOO或kphadex G25柱層析， 層析柱先用蒸餾水平衡，然后上樣，再以蒸餾水洗脫，收集SOD活力峰。

本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)不使用乙醇氯仿，大大降低了生產(chǎn)成本，改善了工作環(huán)境，減少了對操作人員
的毒害；(2)采用熱變性去除血紅蛋白，溶血過程能在常溫下進行，使操作更簡便，降低能耗；(3)在以往的SOD提取中，往往添加大量金屬鹽來提高SOD的活性，但是很容易造成金屬離子超標，且得不到純凈的SOD ；本工藝不添加過渡金屬鹽如銅鹽、鋅鹽、錳鹽中的任何一種，既控制了金屬鹽離子的超標，又節(jié)約了大量的成本；(4)引入了超濾濃縮裝置，既能有效的對SOD進行一定程度的純化，又極大的壓縮了濃縮液的體積，使得丙酮的用量大幅度的減少，操作起來方便快捷，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式實施例1(1)采集新鮮豬血175L加入7L濃度為10%的檸檬酸鈉抗凝，用管式離心機連續(xù)分離得70L血球和112L血漿。血漿經(jīng)噴霧干燥成血漿蛋白粉，血球泵入反應(yīng)罐中，同時加入70L的去離子水攪拌60min使血球破碎，制得溶血液140L ；(2)繼續(xù)攪拌下，向溶血液中加入氯化鈉4. 06Kg，然后用10%的鹽酸調(diào)節(jié)PH值至 6. 0，加熱到62°C并保溫60min，迅速水冷至室溫，三足離心機離心收集上清液得SOD粗提液 100L ；(3)粗提液經(jīng)截留分子量為IOK的中空纖維膜超濾濃縮，保持回流壓0. 08MPa，得 SOD濃縮液IL ；(4)濃縮液在攪拌下加入IL的4°C預冷丙酮，繼續(xù)攪拌30min，離心收集上清液；(5)收集的上清液在攪拌下加入0. 5L的4°C預冷丙酮，產(chǎn)生大量絮狀沉淀，繼續(xù)攪拌20min后離心，小心收集淺藍色的沉淀；(6)沉淀用800mL的pH6. 8的2. 5mM的磷酸緩沖液溶解，溶解液上DEAE陰離子交換層析柱進行純化，上樣后用PH6. 8的5mM的磷酸緩沖液洗脫，收集SOD活力峰。SOD液冷凍干燥得淺藍色的精品凍干粉3. 86g，比活力6100U/mg，密封包裝于_20°C冷凍保存。實施例2 (1)采集新鮮豬血50L，加入175g檸檬酸鈉做抗凝處理，用管式離心機分離得20L
4血球和30. 17L血漿，血球泵入反應(yīng)罐中，同時加入40L的去離子水攪拌溶血90min ；(2)繼續(xù)攪拌下，向溶血液中加入696g氯化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至7. 0，加熱到70°C 并保溫30min，迅速水冷至50°C以下，三足離心機離心收集SOD粗提液52L ；(3)粗體液經(jīng)截留分子量為6K的中空纖維膜超濾濃縮，保持回流壓為0. IMPa^l 提液濃縮至IL ；(4)濃縮液在攪拌下加入0. 5L的4°C預冷丙酮，繼續(xù)攪拌20min，離心收集上清液；(5)收集的上清液在攪拌下加入0. 8L的4°C預冷丙酮，繼續(xù)攪拌20min后離心收
集沉淀；(6)沉淀用IOOmL的蒸餾水溶解，溶解液上分子篩柱層析進行純化，上樣后用蒸餾水洗脫，收集SOD活力峰。體積300mL左右的SOD純化液冷凍干燥得凍干粉1. 03g，比活力 6500U/mg，密封包裝后-20°C冷凍保存。以下通過具體實施例對本發(fā)明進行闡釋，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚，以下實施例涉及到的SOD活性檢測使用GB/T 5009. 171-2003第一法。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但是這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工藝，其特征在于依照下列步驟完成(1)在新鮮的動物血液中加入檸檬酸鈉做抗凝處理，離心收集紅細胞，然后加入紅細胞體積1-3倍的去離子水，不斷攪拌，使紅細胞破碎，得溶血液；(2)向溶血液中加入單價中性金屬鹽，調(diào)節(jié)PH值到4.0-7. 0，加熱至55-75°C，保溫反應(yīng) 30-100min,冷卻至室溫，離心取上清，得SOD粗提液；(3)用中空纖維超濾裝置對SOD粗提液進行超濾濃縮得SOD濃縮液；(4)向SOD濃縮液中邊攪拌邊緩慢加入0.4-1倍體積的預冷丙酮，離心取上清液；(5)然后向步驟(4)所得的清液中邊攪拌邊緩慢加入1.2-1. 5倍體積的預冷丙酮，離心取沉淀；(6)將沉淀用去離子水溶解，經(jīng)過陰離子交換樹脂或分子篩層析，冷凍干燥即可得SOD 精品凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工藝，其特征在于上述抗凝處理時所使用的抗凝劑為食品級檸檬酸鈉，添加量為3. 5-5g/Kg動物血，攪拌溶血時間30-120min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工藝，其特征在于上述單價中性金屬鹽可以是堿金屬的氯化物、溴化物、硝酸鹽和硫酸鹽中的任一種或幾種的混合物，至其終濃度為0. 1-1. 5mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工藝，其特征在于上述步驟C3)使用的中空纖維超濾裝置選擇截留分子量為4K-MK的膜組件，保持回流壓 0. 04-0. IMPa0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工藝，其特征在于上述步驟(6)中使用的陰離子交換層析是DEAE陰離子交換層析，層析柱先用 pH6. 5 8. 0的2. 5mM的磷酸緩沖液平衡，至^Onm無光吸收，然后上樣，換用單一濃度的洗脫液洗脫至^Onm無光吸收，收集SOD活力峰。其中的單一濃度洗脫液為與平衡層析柱的緩沖液PH相同、濃度為4 SmM的磷酸緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從動物血球液中提取超氧化物歧化酶SOD的新工藝，其特征在于上述步驟(6)中使用的分子篩柱層析是kphadex GlOO或kphadex G25柱層析，層析柱先用蒸餾水平衡，然后上樣，再以蒸餾水洗脫，收集SOD活力峰。
全文摘要
本發(fā)明公開的從動物血球液中提取超氧化物歧化酶的新工藝，主要步驟包括動物新鮮血液抗凝處理后，離心分離血球，經(jīng)溶血，熱變性，超濾濃縮，丙酮分級沉淀得SOD粗品。粗品經(jīng)陰離子交換樹脂或分子篩層析純化后冷凍干燥得SOD精品。本發(fā)明不僅放棄了氯仿乙醇，而且在熱變性的過程中不添加過渡金屬鹽如銅鹽、鋅鹽、錳鹽中的任何一種，在此基礎(chǔ)上進一步引入超濾濃縮工藝，在丙酮分級沉淀過程中丙酮的用量極少。本發(fā)明提取SOD的新工藝能最大限度的保證原有SOD的活力，操作簡單，成本低廉，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/08GK102250851SQ20111022806
公開日2011年11月23日 申請日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者盧進峰, 葉躍國, 尹倫, 方俊生, 王雅靜, 臧盛, 袁訓安 申請人:天津?qū)毜限r(nóng)業(yè)科技股份有限公司