專利名稱：脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳標(biāo)記領(lǐng)域，尤其涉及一種脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星(microsatellites)或稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats， SSR)是指由1 6個(gè)核苷酸組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)DNA序列。迄今研究過(guò)的所有生物種類中都發(fā)現(xiàn)了它的存在，并且分布密度很大。由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、 多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德?tīng)柗蛛x定律共顯性遺傳、易于PCR擴(kuò)增等特點(diǎn)，已成為近年來(lái)最引人注目的新型DNA標(biāo)記，并廣泛應(yīng)用于生物資源的家系譜系認(rèn)證、 基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)外在其他海產(chǎn)甲殼類有相關(guān)的研究報(bào)道，利用尼龍膜雜交法，Masatsugu takhano等在鋸緣青蟹(正_，serraia)中發(fā)現(xiàn)5個(gè)具有可變性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。 David Gopurenko等在鋸緣青蟹(沙_，Scylla paramamosain )的研究中篩選到5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。利用常規(guī)方法，E. S Yap等在遠(yuǎn)海梭子蟹(/^rtozw1S pelagicus)中篩選到7個(gè)含有二核苷酸重復(fù)單元、1個(gè)含有四核苷酸重復(fù)單元的微衛(wèi)星位點(diǎn)。H. S. AN等利用PCR篩選法，在中華絨螯蟹(五riocAeir siZ^Z^is)基因組富集文庫(kù)中篩選出9個(gè)新的微衛(wèi)星位點(diǎn)。 B. Kinfling等在中華絨螯蟹中篩選到12個(gè)具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。劉萍以及徐鵬等開(kāi)發(fā)了中國(guó)對(duì)蝦O^/wero/^/^i^s chinensis)微衛(wèi)星標(biāo)記，并用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、系譜認(rèn)證和群體遺傳多樣性的分析等；王鴻霞等以人工選育建立的凡納濱對(duì)蝦全同胞家系為實(shí)驗(yàn)材料，探討了微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)混養(yǎng)家系進(jìn)行親權(quán)鑒定的可能性；欒生建立了日本對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus )微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)；李曉萍等構(gòu)建了三疣梭子蟹iFortunus triuberbuculatus)基因組富集文庫(kù)，獲得了 30個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，并用于群體遺傳分析。馮建彬等利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了日本沼蝦Ofecro^racAiws mipponensis) 9個(gè)野生群體遺傳多樣性。這些重要經(jīng)濟(jì)甲殼類的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，已應(yīng)用于親緣關(guān)系鑒定、種群多樣性研究中。但是至今為止，尚未見(jiàn)有脊尾白蝦微衛(wèi)星DNA檢測(cè)技術(shù)方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中尚未有對(duì)脊尾白蝦微衛(wèi)星DNA檢測(cè)方法公開(kāi)的現(xiàn)狀，提供了一種脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，本發(fā)明可快捷的獲得脊尾白蝦 EcSSR0003遺傳標(biāo)記基因座位呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡(jiǎn)便，所得結(jié)果可直觀地檢測(cè)出脊尾白蝦在此位點(diǎn)的每個(gè)個(gè)體的基因型。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括以下步驟首先提取脊尾白蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用脊尾白蝦基因組文庫(kù)中的EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)脊尾白蝦不同地理群或群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從而獲得脊尾白蝦在EcSSR0003核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜；
所述EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5’ -AGGCAACAGGACATAACA _3’，負(fù)鏈 3’- CGTACAGATAGACGGAGA _5’，使用特異性引物時(shí)的退火溫度為51°C。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述脊尾白蝦基因組DNA的稀釋濃度為50ng/^L，每個(gè) PCR反應(yīng)中加入3μ ，反應(yīng)總體積為20μ 。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為每個(gè)PCR反應(yīng)總體積為 20μ ，包括 50ng/^L 脊尾白蝦基因組 DNA3PL ;2. 5mmol/L dNTP 1. 6μ ；含 15 mmol/L Mg2+ 的 10XPCR Buffer 2μ ；5U/^L 的 Taq 酶 0. 2μ ；引物 10mmol/L 各 μ ；最后加 ddH20 至 20μ 。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)使用所述特異性引物時(shí)設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為 95°C預(yù)變性5min ；95°C變性45s，51°C退火45s，72°C延伸45s，25個(gè)循環(huán)；最后72°C再延伸 IOmin ；4°C保存。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將PCR產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電泳1 1. 5h進(jìn)行分離；將膠板通過(guò)10%的冰醋酸溶液20min —蒸餾水6min — 0. 1%的硝酸銀溶液25min — 3%的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可得到脊尾白蝦在EcSSR0003基因座位高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
首先，應(yīng)用本發(fā)明所述引物和檢測(cè)方法可以檢測(cè)脊尾白蝦的每個(gè)個(gè)體在ECSSR0003微衛(wèi)星核心區(qū)的遺傳變異，EcSSR0003的PCR引物是本發(fā)明的核心，可在脊尾白蝦的群體檢測(cè)中呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性，可快捷的獲得脊尾白蝦的EcSSR0003遺傳標(biāo)記基因座位呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，所得電泳結(jié)果可直觀地檢測(cè)出脊尾白蝦在此位點(diǎn)的每個(gè)個(gè)體的基因型，方便、快捷、準(zhǔn)確。其次，相對(duì)于其它分子遺傳標(biāo)記技術(shù)而言，微衛(wèi)星標(biāo)記符合孟德?tīng)栠z傳模式，呈共顯性遺傳，因此，可以區(qū)分個(gè)體是純合子和雜合子狀態(tài)。本發(fā)明適用于脊尾白蝦群體遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證、遺傳圖譜構(gòu)建等應(yīng)用。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清林疋。


圖1為本發(fā)明的ECSSR0003引物對(duì)脊尾白蝦16個(gè)體的檢測(cè)圖譜，編號(hào)1_16為脊尾白蝦個(gè)體，M是標(biāo)準(zhǔn)分子量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1
本發(fā)明所述脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列DNA分子標(biāo)記的檢測(cè)方法包括以下步
驟首先提取脊尾白蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用脊尾白蝦基因組文庫(kù)中的含有 EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)脊尾白蝦不同地理群或群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，并獲得脊尾白蝦在 EcSSR0003核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜(如圖1所示)。脊尾白蝦在EcSSR0003 核心序列為 ATAACTTTCATCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAATTTTTCTC, GenBank 注冊(cè)號(hào)為 JF912422。 1、脊尾白蝦基因組DNA的提取
取脊尾白蝦肌肉組織lOOmg，剪碎后放入1.5ml離心管中，加入pH8. O的TE溶液 (10mmol/L Tris-CI, 10mmol/L EDTA) 500μ ,用研磨棒研磨。加入 10% SDS 溶液 25μ ， 混勻。加入20mg/ml蛋白酶K 4μ ，混勻，55°C消化2. 5 3h。重蒸酚抽提兩次，每次lOmin， 12000轉(zhuǎn)/min離心5min,取上清；酚氯仿(1:1)抽提一次，IOmin, 12000轉(zhuǎn)/min離心5min， 取上清；氯仿抽提一次5min，5000g離心5min，取上清。加入1/25體積的5mol/L NaCl溶液，混勻后再加入兩倍體積的一 20°C的無(wú)水乙醇沉淀DNA 15min ；挑出的DNA，用70%的乙醇洗滌數(shù)十分鐘，使DNA干燥，用滅菌水500μ 充分溶解后，定量將其稀釋成50ng/^L的濃度備用。2、微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)
在脊尾白蝦微衛(wèi)星富集文庫(kù)基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列在同一物種相對(duì)于核心序列的高度保守性，在EcSSR0003核心序列的兩端設(shè)計(jì)特異性引物，用其擴(kuò)增出該位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA片段。由于微衛(wèi)星核心序列突變率相對(duì)較高，造成微衛(wèi)星DNA核心序列重復(fù)次數(shù)的增加或減少，即微衛(wèi)星DNA序列長(zhǎng)度的變化，這是檢測(cè)微衛(wèi)星多態(tài)性的主要依據(jù)。本發(fā)明的EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列區(qū)域兩端的特異性引物序列為正鏈5’ -AGGCAACAGGACATAACA _3’，負(fù)鏈 3’- CGTACAGATAGACGGAGA _5’，使用該引物時(shí)的退火溫度為 51°C。3、PCR 擴(kuò)增
首先加樣，PCR擴(kuò)增體系如下包括50ng/^L脊尾白蝦基因組DNA3PL ；2. 5mmol/L dNTP 1.6μ ;含 15 mmol/L Mg2+ 的 10XPCR Buffer2PL ;5U/^L TaqO. 2μ ；本發(fā)明的引物 10mmol/L 各 μ ；最后加 ddH20 至 20μ 。其次進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增儀程序參數(shù)為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性45s，51°C 退火45s，72°C延伸45s，25個(gè)循環(huán)；最后72°C再延伸IOmin ；4°C保存。4、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)
PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物在8%的變性聚丙烯酰氨的凝膠中進(jìn)行電泳，電泳儀的功率為 12W,電泳的時(shí)間在1 1. 5h左右，即可終止。將膠板通過(guò)10%的冰醋酸溶液20min —蒸餾水6min — 0. 1%的硝酸銀溶液25min — 3%的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即得到如圖 1所示的多態(tài)性圖譜。本發(fā)明檢測(cè)方法主要利用磁珠富集法建立的脊尾白蝦微衛(wèi)星富集文庫(kù)中 EcSSR0003的微衛(wèi)星DNA序列，使用Primer (Version 5. 00)軟件在其核心序列的兩端設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物，將引物序列合成后對(duì)脊尾白蝦個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而快速地檢測(cè)脊尾白蝦每個(gè)個(gè)體在此微衛(wèi)星區(qū)的遺傳變異，從而獲得該引物對(duì)脊尾白蝦在EcSSR0003序列區(qū)的遺傳變異圖譜，通過(guò)該圖譜直觀地表現(xiàn)出每個(gè)個(gè)體的基因型。 以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管 參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.脊尾白蝦ECSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟首先提取脊尾白蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用脊尾白蝦基因組文庫(kù)中的 EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)脊尾白蝦不同地理群或群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從而獲得脊尾白蝦在EcSSR0003核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜；所述EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為正鏈5’ -AGGCAACAGGACATAACA _3’，負(fù)鏈 3’- CGTACAGATAGACGGAGA _5’，使用特異性引物時(shí)的退火溫度為51°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于所述脊尾白蝦基因組DNA的稀釋濃度為50ng/^L，每個(gè)PCR反應(yīng)中加入3μ ，反應(yīng)總體積為 20μ 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為每個(gè)PCR反應(yīng)總體積為20μ ，包括50ng/^L脊尾白蝦基因組 DNA3PL ；2. 5mmol/L dNTP 1. 6μ ；含 15 mmol/L Mg2+ 的 IOXPCR Buffer 2μ ；5U/^L 的 Taq 酶 0. 引物 10mmol/L 各 μ ；最后加 ddH20 至 20μ 。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于使用所述特異性引物時(shí)設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性45s， 51V退火45s，72 °C延伸45s，25個(gè)循環(huán)；最后72 °C再延伸IOmin ；4 V保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將PCR產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電泳1 1. 5h進(jìn)行分離；將膠板通過(guò)10%的冰醋酸溶液20min —蒸餾水6min — 0. 1%的硝酸銀溶液 25min — 3%的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可得到脊尾白蝦在EcSSR0003基因座位高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括首先提取脊尾白蝦基因組DNA并稀釋備用；再在EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)脊尾白蝦基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，從而獲得脊尾白蝦在EcSSR0003核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。應(yīng)用本發(fā)明所述引物和檢測(cè)方法可以檢測(cè)脊尾白蝦的每個(gè)個(gè)體在EcSSR0003微衛(wèi)星核心區(qū)的遺傳變異，可快捷的獲得脊尾白蝦的EcSSR0003遺傳標(biāo)記基因座位呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜；本發(fā)明適用于脊尾白蝦群體遺傳標(biāo)記、系譜認(rèn)證、遺傳圖譜構(gòu)建等應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102304576SQ201110246399
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月24日
發(fā)明者劉萍, 李健, 賈舒雯 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所