專(zhuān)利名稱(chēng)：日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白、重組載體和轉(zhuǎn)化體及其制備方法。背景資料血吸蟲(chóng)病由血吸蟲(chóng)感染引起，包括日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonic·)，曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosoma mansoni)禾口埃及血吸蟲(chóng)(Schistosoma haematobium),在世界上有 76 個(gè)國(guó)家和地區(qū)遭受危害，受感染者約1.5億。在我國(guó)流行的是日本血吸蟲(chóng)。血吸蟲(chóng)病的流行給人民身體健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了巨大的損失。因此，防治血吸蟲(chóng)病、開(kāi)發(fā)研制治療血吸蟲(chóng)病和抗血吸蟲(chóng)的藥物具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。研制新的治療血吸蟲(chóng)病和抗血吸蟲(chóng)的藥物，首先必須找到合適的藥物作用靶位。 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自身編程性死亡，血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)寄生于宿主的血管中可長(zhǎng)達(dá)20年，直接與宿主免疫最活躍的器官接觸，而不死亡。因此，血吸蟲(chóng)的抗凋亡蛋白在維持血吸蟲(chóng)的正常寄生中發(fā)揮作用，可作為抗血吸蟲(chóng)藥物的作用靶點(diǎn)。另外，器官移植已成為治療人類(lèi)某些疾病的重要手段，器官移植面臨的最大問(wèn)題是免疫排斥，造成移植器官細(xì)胞的死亡，這其中，很大一部分為細(xì)胞凋亡。因此，血吸蟲(chóng)凋亡抑制蛋白也具有治療人類(lèi)某些疾病的潛能。。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白、重組載體和轉(zhuǎn)化體及其制備方法。。為此，一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白，為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的蛋白質(zhì)；(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或修飾且具有抗細(xì)胞凋亡活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種多核苷酸分子，其特征在于該多核苷酸分子編碼本發(fā)明所述日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白。在一實(shí)施例里，所述多核苷酸分子的堿基序列如SEQ ID N0. 2所示。另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種包含本發(fā)明所述多核苷酸分子的重組表達(dá)載體。在一些實(shí)施方式中，所述重組表達(dá)載體可為原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體，其中優(yōu)選真核表達(dá)載體。另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種包含本發(fā)明所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種本發(fā)明所述日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白的制備方法，包括如下步驟日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建；日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白轉(zhuǎn)化體的制備；
日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白的表達(dá)；日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白的純化。在一實(shí)施方式中，所述日本血吸蟲(chóng)抗細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)載體為包含編碼SEQ ID NO. 1所示蛋白的DNA的表達(dá)載體，其中所述重組表達(dá)載體可為原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。另一方面，本發(fā)明還提供了能與日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白特異性識(shí)別的抗體。本發(fā)明還提供了日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白在制備防治和治療日本血吸蟲(chóng)病的藥物中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還提供了日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白在抑制細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。如日本血吸蟲(chóng)疫苗，所述疫苗以本發(fā)明所述蛋白為免疫原。本發(fā)明首次公開(kāi)了日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白、重組載體和轉(zhuǎn)化體及其制備方法。本發(fā)明所提供的日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白可作為抗血吸蟲(chóng)藥物的作用靶點(diǎn)，這為開(kāi)發(fā)研制治療血吸蟲(chóng)病和抗血吸蟲(chóng)的藥物提供了新的基礎(chǔ)。


圖1特異性抗體識(shí)別日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白SjCIAPIN圖2日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白SjCIAPIN抑制細(xì)胞凋亡圖3日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白SjCIAPIN抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
具體實(shí)施例方式下文將進(jìn)一步詳細(xì)討論本發(fā)明的多個(gè)方面。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白”指具有日本血吸蟲(chóng)具有抗凋亡活性的 SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)SjCIAPIN。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白相同功能的SEQ ID NO. 1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為 10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)相似或相近的氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白 (SjCIAPIN)的活性片段和活性衍生物。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“編碼日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白基因序列”指編碼具有日本血吸蟲(chóng)抗凋亡活性蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO. 2序列中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列的同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白的DNA以及含有這些DNA的載體、轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化體(transformant)，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過(guò)合成和重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的日本血吸蟲(chóng)抗凋亡蛋白的方法。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、宿主細(xì)胞和生物體。用于本發(fā)明的載體可以是如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？捎糜诳寺『?或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體是能在需復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的載體。一般說(shuō)來(lái)，多核苷酸和/或載體可用于任何真核或原核細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)、大鼠、倉(cāng)鼠(如CH0、NS0和幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)或小鼠細(xì)胞(如L細(xì)胞))、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)。有關(guān)適用于多種類(lèi)型宿主細(xì)胞的適當(dāng)載體的例子可參見(jiàn)例如 F. Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Inter science (1992)禾口 Sambrook et al. (1989)?？梢允褂煤羞@些多核苷酸的宿主細(xì)胞來(lái)大量表達(dá)可用于例如藥物、診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質(zhì)。已開(kāi)發(fā)出多種方法用于經(jīng)由互補(bǔ)的粘性末端使DNA與載體可操作相連。例如，可在欲插入載體DNA內(nèi)的DNA區(qū)段添加互補(bǔ)的同聚體序列片段。然后通過(guò)互補(bǔ)同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區(qū)段以形成重組DNA分子。含有一或多種限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了另一種連接DNA區(qū)段與載體的方法。 用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過(guò)內(nèi)切核酸酶限制性消化產(chǎn)生的 DNA區(qū)段，所述的兩種聚合酶用其3'，5’-核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，并用其聚合活性補(bǔ)平3’-凹端。因此，這些活性的聯(lián)合產(chǎn)生了平端DNA區(qū)段。然后在能催化平端 DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶的存在下將平端區(qū)段與大摩爾過(guò)量的接頭分子一起保溫。因此，反應(yīng)產(chǎn)物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區(qū)段。然后用適當(dāng)?shù)南拗菩悦噶呀膺@些DNA區(qū)段，并連接至已用酶裂解的表達(dá)載體中，所述酶能產(chǎn)生與所述DNA區(qū)段相容的末端。從多個(gè)商家可以買(mǎi)到含有多個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的合成接頭。多核苷酸插入物應(yīng)該可操作地連接于同表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞相容的適當(dāng)啟動(dòng)子上。啟動(dòng)子可以是強(qiáng)啟動(dòng)子和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。列舉的一些啟動(dòng)子的例子包括噬菌體久PL啟動(dòng)子、大腸桿菌lac、trP、phoA、tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子。其它適當(dāng)啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。表達(dá)重組載體進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始、終止位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)錄區(qū)含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。重組載體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分可包括位于起點(diǎn)處的翻譯起始密碼子和適當(dāng)?shù)匚挥诒环g多肽的末端的終止密碼子(UAA, UGA 或 UAG)。如上所述，表達(dá)載體可包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記包括對(duì)真核細(xì)胞培養(yǎng)物而言的二氫葉酸還原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大腸桿菌和其它細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲(chóng)細(xì)胞，如果蠅S2和夜蛾SF9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列經(jīng)本領(lǐng)域已知的技術(shù)與一或多種異源控制區(qū)(如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)可操作相連。可以選擇能調(diào)節(jié)插入的基因序列的表達(dá)，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主菌株。在某些誘導(dǎo)物的存在下，某些啟動(dòng)子啟動(dòng)的表達(dá)會(huì)升高；因此，可以控制經(jīng)基因改造的多肽的表達(dá)。另外，不同宿主細(xì)胞具有特征性的和特殊的翻譯、翻譯后加工和修飾(如磷酸化、裂解) 蛋白質(zhì)的機(jī)制。可以選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系以確保對(duì)表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行合乎需要的修飾和加工。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法，即可將本發(fā)明的核酸和核酸重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所述方法描述于多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中，如Davis et al. ,BasicMethods In Molecular Biology (1986)。編碼本發(fā)明的人重組chemerin蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標(biāo)記的載體連接以在宿主中增殖。一般說(shuō)來(lái)，可在沉淀物，如磷酸鈣沉淀物或其與帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中導(dǎo)入質(zhì)粒載體。如果載體是病毒，可使用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系在體外對(duì)其進(jìn)行包裝，再轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞。通過(guò)眾所周知的技術(shù)可以鑒定出被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明的DNA重組載體的細(xì)胞。例如，可培養(yǎng)導(dǎo)入表達(dá)重組載體所得的細(xì)胞以產(chǎn)生所需多肽。收集并裂解細(xì)胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent et al (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，檢測(cè)其DNA內(nèi)容物中DNA的存在?；蛘?，使用抗體檢測(cè)上清液中蛋白質(zhì)的存在。通過(guò)眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的人重組chemerin 蛋白較為有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層析。 在一些實(shí)施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行純化。在一些實(shí)施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發(fā)明的人重組 chemerin蛋白。在其它實(shí)施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本發(fā)明的人重組 chemerin 蛋白，所述層析柱有Q sepharose FF 柱、SPsepharose FF 柱、Q sepharose High Performance 柱、Blue sepharose FF柱、Blue 柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF 或 Methyl 柱。另外，可使用國(guó)際
發(fā)明者程國(guó)鋒, 羅榮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所