專利名稱：用于實(shí)蠅種類鑒定的方法及其專用pcr前體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于實(shí)蠅種類鑒定的方法及其專用PCR前體系。
背景技術(shù)：
實(shí)蠅屬于雙翅目(Diptera)實(shí)蠅科(I^phritidae)，全世界廣泛分布，多發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)，約有500屬4500種。150余種實(shí)蠅具有嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)危害性，以卵和幼蟲或蛹隨寄主果實(shí)、包裝物和運(yùn)輸工具等遠(yuǎn)距離人為傳播擴(kuò)散，危害果樹和蔬菜等經(jīng)濟(jì)植物，倍受各國植檢和農(nóng)業(yè)部門的關(guān)注。實(shí)蠅的種類鑒定主要依據(jù)成蟲的形態(tài)學(xué)特征，雖具有快速、簡便和成本低的特點(diǎn)， 但同時(shí)也存在一些局限性。特別是在區(qū)分實(shí)蠅近似種方面，要求標(biāo)本具有完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)， 并需要鑒定人員具有豐富的分類經(jīng)驗(yàn)和技能。此外，對于實(shí)蠅幼蟲的種類鑒定相當(dāng)困難，且在多數(shù)情況下不可能實(shí)現(xiàn)，但在我國口岸截獲的多為實(shí)蠅的卵和幼蟲，將幼蟲飼養(yǎng)到成蟲再進(jìn)行種類鑒定需要較長時(shí)間，直接影響到口岸檢疫的運(yùn)行速度和檢疫質(zhì)量。DNA條形碼技術(shù)是通過對一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)。2003年，加拿大圭爾夫大學(xué)的分類學(xué)家Paul Hebert等通過對動(dòng)物界，包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物11門13320個(gè)物種的COI基因的比較分析得出除腔腸動(dòng)物Cnidaria 外，98%的物種的COI序列差異在種內(nèi)小于2%，種間平均達(dá)到11. 3%。據(jù)此，Hebert提出用位于線粒體COI基因5’端58-705區(qū)域長度為648bp的片段作為條形編碼的基因，為全球生物編碼。目前，線粒體DNA已成為動(dòng)物DNA條形碼研究的首選對象，已有很多成功使用COI基因的報(bào)道。迄今為止，COI基因被證明適用于包括腹足類(gastropods)、彈尾目 (springtails)、蝴蝶、鳥類、蜉蝣類、蜘蛛、甲殼動(dòng)物(Crustacea)以及最近研究的硅藻類 (diatomea)和原生動(dòng)物(Protista)的分類鑒定。尤其在昆蟲種類的鑒定上，相對于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，DNA條形碼具有對昆蟲各生命階段(非成蟲態(tài)和成蟲態(tài))和形態(tài)結(jié)構(gòu)保存不完整的昆蟲標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒定這一明顯優(yōu)勢。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的建立，可使更多的無分類學(xué)專業(yè)知識(shí)的人對某個(gè)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。目前，由國際條形碼協(xié)會(huì)構(gòu)建的生物條形碼數(shù)據(jù)庫(BOLD)中已收錄了大量生物類群的COI條形碼信息，并部分對外公開，可免費(fèi)下載獲得。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于實(shí)蠅種類鑒定的方法及其專用PCR前體系。本發(fā)明提供了一種輔助鑒定實(shí)蠅的種類的方法，包括如下步驟(1)將待測實(shí)蠅的基因組DNA加入PCR前體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；所述PCR前體系由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)在所述前體系中的濃度如下體積百分含量為 12% 的 IOXTaq buffer (Mg2+ free) U. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、0. 0006mM 上游引物 (LC01490)、0· 0006mM下游引物(HC02198)和0. 02U/ μ 1 TaqDNA聚合酶；所述上游引物的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表的序列2所示；
(2)將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過與現(xiàn)有序列進(jìn)行比對鑒定所述待測實(shí)蠅的種類。所述PCR 擴(kuò)增的程序具體可為94°C 3min ；94°C lmin、50°C lmin、72°C lmin，39 個(gè)循環(huán)；72 °C IOmin。每50 μ 1所述PCR前體系具體可通過如下方法制備將6 μ 1 IOXTaq buffer (Mg2+free)、3 μ 1 25mM MgCl2 溶液(商購)、2 μ 1 2. 5mM dNTP、3 μ 1 0. OlmM 所述上游引物、3 μ 1 0. OlmM所述下游引物、0. 4 μ 1 2. 5U/ μ 1 TaqDNA聚合酶和32. 6 μ 1 ddH20混
口 O所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為708bp。所述方法中，所述與現(xiàn)有序列進(jìn)行比對具體可采用實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)進(jìn)行。 實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)(TBIS)已于2011年1月M日進(jìn)行著作權(quán)登記，著作權(quán)編號(hào)為 2011SRBJ0406。每50 μ 1所述PCR前體系中具體可加入2 μ 1基因組DNA。所述基因組DNA具體可為從所述待測實(shí)蠅成蟲的足中提取的基因組DNA、也可為從實(shí)蠅幼蟲、實(shí)蠅蛹或?qū)嵪壜阎刑崛〉幕蚪MDNA。當(dāng)從實(shí)蠅成蟲的足中提取所述基因組 DNA時(shí)，不影響所述實(shí)蠅成蟲的形態(tài)特征，可以結(jié)合所述實(shí)蠅成蟲的形態(tài)特征對所述方法中的鑒定結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。具體可采用試劑盒進(jìn)行所述基因組DNA的提取。所述試劑盒具體可為北京天根 (TIANGEN)生物技術(shù)公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)。應(yīng)用所述試劑盒對實(shí)蠅成蟲進(jìn)行所述基因組DNA的提取的具體步驟如下1、取單只實(shí)蠅，取下一側(cè)的后足，用無水乙醇漂洗后，放在濾紙上晾干；2、將所述后足放入離心管中，加入液氮，研磨成粉末；3、將200 μ 1 GA液加入到步驟2的離心管中，離心15秒；4、將15 μ 1蛋白酶K加入到步驟3的離心管中，56°C水浴3小時(shí)，離心15秒；5、將200 μ 1 GB液加入到步驟4的離心管中，70°C水浴10分鐘，離心30秒；6、在步驟5的離心管中加入200 μ 1無水乙醇，振蕩15秒，離心1分鐘，全部轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，離心30秒；7、將500 μ 1 GD液加入到步驟6的吸附柱CB3中，12000rpm/s離心30秒，棄除洗脫液；8、將700 μ 1漂洗液PW加入到步驟7的吸附柱CB3中，12000rpm/s離心30秒，棄除洗脫液；9、將500 μ 1漂洗液Pff加入到步驟8的吸附柱CB3中，12000rpm/s離心30秒，棄除洗脫液；10、將步驟9的吸附柱CB3以12000rpm/s離心2分鐘，打開吸附柱CB3的蓋子，室
溫放置5分鐘；11、將步驟10的吸附柱CB3放入新的離心管中，向吸附柱CB3中間懸空滴加 20 μ ITE緩沖液，放置2-5分鐘后，12000rpm/s離心2分鐘；12、將步驟11離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘，12000rpm/s 離心2分鐘，基因組DNA被洗脫到離心管中，-20°C保存。
4
本發(fā)明還保護(hù)一種PCR前體系，由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)在所述前體系中的濃度如下體積百分含量為 12% 的 IOXiTaq buffer (Mg2+ free) U. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、 0. 0006mM 上游引物(LC01490)、0· 0006mM 下游引物(HC02198)和 0. 02U/μ 1 TaqDNA 聚合酶；所述上游引物的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表的序列2所示。 所述PCR前體系可用于輔助鑒定實(shí)蠅的種類。以上任一所述的實(shí)蠅具體可為南亞果實(shí)蠅或瓜實(shí)蠅。目前，實(shí)蠅DNA的提取方法主要將成蟲的胸、腹部或整頭成蟲研磨后，以CTAB法或 DNA提取試劑盒法進(jìn)行實(shí)蠅成蟲的基因組DNA提取。由于破壞掉供試樣品，無法再次通過觀察樣品的形態(tài)特征對分子鑒定結(jié)果進(jìn)行核對和檢驗(yàn)，從而使得分子鑒定結(jié)果的可靠性降低。在本發(fā)明的方法中，取實(shí)蠅成蟲樣品的單足作為基因組DNA提取的原始樣本，可以最大限度地保持供試樣品的形態(tài)完整性，在分子鑒定實(shí)驗(yàn)完成后，可繼續(xù)觀察實(shí)蠅成蟲的形態(tài)特征對分子鑒定結(jié)果加以檢驗(yàn)，從而保證了實(shí)蠅成蟲分子鑒定結(jié)果的可靠性。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)實(shí)現(xiàn)對實(shí)蠅樣品各生命階段(成蟲、幼蟲、蛹和卵)，樣品材料完整性差、不同地理來源的種類鑒定。(2)單足提取成蟲樣品的DNA可以最大限度地保持供試樣品的形態(tài)完整性，在分子鑒定實(shí)驗(yàn)完成后，可繼續(xù)觀察實(shí)蠅成蟲的形態(tài)特征對分子鑒定結(jié)果加以檢驗(yàn)，從而保證了實(shí)蠅成蟲分子鑒定結(jié)果的可靠性。C3)標(biāo)準(zhǔn)化操作及技術(shù)的通用性強(qiáng)。通過簡單的技術(shù)培訓(xùn)，可使無分類學(xué)專業(yè)知識(shí)人員實(shí)現(xiàn)對全球180余種果蔬類經(jīng)濟(jì)性實(shí)蠅種類的快速、準(zhǔn)確的鑒定。


圖1為PCR產(chǎn)物檢測電泳結(jié)果圖2為實(shí)蠅種類鑒定流程。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。IOXTaq buffer (Mg2+ free)購自天根生化科技(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào) RP101-04。實(shí)驗(yàn)樣本2009年5月采自于廣西南寧興寧苦瓜菜園中的實(shí)蠅成蟲。南亞果實(shí)蠅(Bactrocera tau)公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；參考文獻(xiàn)李小珍、劉映紅、王澤樂，檢疫性害蟲南亞果實(shí)蠅生物學(xué)及控制技術(shù)，植物保護(hù)，第32卷第6期 (2006)，141-145。瓜實(shí)蠅(Bactrocera cucurbitae)公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得；參考文獻(xiàn)歐劍峰、黃鴻、吳華等，瓜實(shí)蠅國內(nèi)研究概況，長江蔬菜，2008. 9專題綜述，33-37.。
實(shí)施例1、應(yīng)用PCR前體系輔助鑒定實(shí)蠅的種類一、實(shí)蠅成蟲基因組DNA的提取采用北京天根(TIANGEN)生物技術(shù)公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)對實(shí)驗(yàn)樣本(10只實(shí)蠅，依次命名為樣本1至樣本10)進(jìn)行基因組DNA的提取，具體步驟如下1、取單只實(shí)蠅成蟲，取下一側(cè)的后足，在無水乙醇漂洗后，放在濾紙上晾干。2、將所述后足放入離心管中，加入液氮，研磨成粉末狀。3、將200 μ 1 GA液加入到步驟2的離心管中，離心15秒。4、將15 μ 1蛋白酶K懸空加入到步驟3的離心管中，56°C水浴3小時(shí)，離心15秒。5、將200 μ 1 GB液加入到步驟4的離心管中，70°C水浴10分鐘，離心30秒。6、在步驟5的離心管中加入200 μ 1無水乙醇，振蕩15秒，離心1分鐘，全部轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，離心30秒。7、將500 μ 1⑶液加入到步驟6的吸附柱CB3中，12000rpm/s離心30秒，棄除洗脫液。8、將700 μ 1漂洗液PW加入到步驟7的吸附柱CB3中，12000rpm/s離心30秒，棄除洗脫液。9、將500 μ 1漂洗液Pff加入到步驟8的吸附柱CB3中，12000rpm/s離心30秒，棄除洗脫液。10、將步驟9的吸附柱CB3以12000rpm/s離心2分鐘，打開吸附柱CB3蓋子，室溫
放置5分鐘。11、將步驟10的吸附柱CB3放入到干凈的離心管中，向吸附柱CB3中間懸空滴加 20 μ 1 TE緩沖液，放置2-5分鐘后，12000rpm/s離心2分鐘。12、將步驟11離心得到的溶液再加入步驟11的吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘， 12000rpm/s離心2分鐘，基因組DNA被洗脫到離心管中，_20°C保存。所述GA液、蛋白酶K、GB液、吸附柱CB3、⑶液和漂洗液PW均為所述試劑盒的組分。二、目標(biāo)基因片段的PCR擴(kuò)增以步驟一提取的基因組DNA為模板，用上游引物L(fēng)C01490和下游引物HC02198組成的引物對(實(shí)蠅COI基因通用引物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。上游引物L(fēng)C01490(序列表的序列 1) :5，-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3，；下游引物HC02198 (序列表的序列 2) :5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。PCR 前體系(50 μ 1) =IOXTaq buffer (Mg2+ free) 6 μ l、25mM MgCl2 溶液(天根生化科技(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)ΓΡ107)3μ 1、2. 5mM dNTP 2 μ 1、0. OlmM上游引物 LCO1490 3μ 1、0. OlmM 下游引物 HC02198 3 μ 1,2. 5U/μ 1 TaqDNA 聚合酶 0. 4 μ 1 和 ddH20 32. 6 μ 1。PCR前體系中，各個(gè)成分的濃度如下體積百分含量為12 %的10 X Taqbuffer (Mg2+ free) U. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、上游引物 LC014900. 0006mM、下游引物 HC021980. 0006mM、 0. 02U/y 1 TaqDNA 聚合酶。在PCR前體系(50 μ 1)中加入2 μ 1基因組DNA，即為PCR體系。PCR程序:94°C 3min ；94°C lmin、50°C lmin、72°C lmin，39 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；4°C
6保存。三、瓊脂糖凝膠電泳將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳(120V電泳30分鐘，以D2000Maker 為電泳指示劑)，然后用溴化乙錠染色15分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀察電泳結(jié)果。結(jié)果見圖1 (泳道1至9依次為樣本1至9，泳道11為樣本10)。樣本1至10均在700bp左右位置現(xiàn)實(shí)一條清晰明亮的目標(biāo)條帶。四、PCR產(chǎn)物的測序回收步驟三的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測序。樣本1至樣本10的測序結(jié)果依次如序列表的序列3至序列12所示(均為708bp)。五、采用實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)(TBIS)進(jìn)行序列分析實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)(TBIS)已于2011年1月M日進(jìn)行著作權(quán)登記，著作權(quán)編號(hào)為2011SRBJ0406。通過對我國實(shí)蠅種類的廣泛取樣測序和收集已公開的實(shí)蠅COI條形碼信息，建立了涵蓋180余種實(shí)蠅的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，即實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)(TBIS)。同時(shí)，建立了適用于我國的實(shí)蠅檢疫鑒定DNA條形碼技術(shù)體系，并運(yùn)用該技術(shù)體系，完成了對來自中國、泰國、越南和布隆迪實(shí)蠅樣品的種類鑒定，實(shí)際應(yīng)用效果良好。將序列3至序列12所示DNA輸入實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)(TBIS)中，與已知種類的實(shí)蠅條形碼序列進(jìn)行相似度比較分析。樣本1與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的南亞果實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到 99. 84% ；實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列13所示)，初步鑒定為南亞果實(shí)蠅。樣本2與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的南亞果實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到 99. 84% ；實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列14所示)，初步鑒定為南亞果實(shí)蠅。樣本3與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的瓜實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到100%; 實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列15所示)，初步鑒定為瓜實(shí)蠅。樣本4與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的瓜實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到100%; 實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列16所示)，初步鑒定為瓜實(shí)蠅。樣本5與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的南亞果實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到 99. 84% ；實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列17所示)，初步鑒定為南亞果實(shí)蠅。樣本6與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的瓜實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到 99. 84% ；實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列18所示)，初步鑒定為瓜實(shí)蠅。樣本7與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的瓜實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到100%; 實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列19所示)，初步鑒定為瓜實(shí)蠅。樣本8與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的南亞果實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到100% ；實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列20所示)，初步鑒定為南亞果實(shí)蠅。樣本9與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的南亞果實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到 99. 84% ；實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列21所示)，初步鑒定為南亞果實(shí)蠅。樣本10與實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中的南亞果實(shí)蠅相似度最高(相似度達(dá)到 99. 84% ；實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列如序列表的序列22所示)，初步鑒定為南亞果實(shí)蠅。如為實(shí)蠅復(fù)合種，需利用DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合樹圖，進(jìn)一步確認(rèn)供試實(shí)蠅成蟲樣品的種類(流程示意圖見圖2)。六、鑒定結(jié)果驗(yàn)證對取完后足后的實(shí)蠅進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征鑒定，確定其種類，與步驟五的鑒定結(jié)果一致。同時(shí)，鑒定結(jié)果與成蟲誘捕結(jié)果相吻合，同時(shí)也與當(dāng)?shù)氐膶?shí)蠅優(yōu)勢種及寄主一致。如果待測樣本為實(shí)蠅的幼蟲、蛹或卵時(shí)，參照實(shí)施例1的方法檢測即可。
權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定實(shí)蠅的種類的方法，包括如下步驟(1)將待測實(shí)蠅的基因組DNA加入PCR前體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 所述PCR前體系由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)在所述前體系中的濃度如下體積百分含量為 12%的 IOXTaq bufferU. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、0. 0006mM上游引物、0. 0006mM下游引物和0. 02U/ μ 1 TaqDNA聚合酶；所述上游引物的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表的序列2所示；(2)將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過與現(xiàn)有序列進(jìn)行比對鑒定所述待測實(shí)蠅的種類。
2.如權(quán)利要求1所示的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C3min； 94°C lmin、50°C lmin、72°C lmin，39 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述與現(xiàn)有序列進(jìn)行比對是采用實(shí)蠅條形碼鑒定系統(tǒng)進(jìn)行的。
4.一種PCR前體系，由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)在所述前體系中的濃度如下體積百分含量為 12%的 IOXTaq bufferU. 5mM MgCl2、0. ImM dNTP、0. 0006mM上游引物、0. 0006mM下游引物和0. 02U/y 1 TaqDNA聚合酶；所述上游引物的核苷酸序列如序列表的序列1所示； 所述下游引物的核苷酸序列如序列表的序列2所示。
5.權(quán)利要求4所述PCR前體系在輔助鑒定實(shí)蠅的種類中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于實(shí)蠅種類鑒定的方法及其專用PCR前體系。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟(1)將待測實(shí)蠅的基因組DNA加入PCR前體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過與現(xiàn)有序列進(jìn)行比對鑒定測實(shí)蠅的種類。PCR前體系由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)濃度如下體積百分含量為12％的10×Taq buffer、1.5mM MgCl2、0.1mM dNTP、0.0006mM序列1所示的上游引物、0.0006mM序列2所示的下游引物和0.02U/μl TaqDNA聚合酶。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)實(shí)現(xiàn)對實(shí)蠅樣品各生命階段，樣品材料完整性差、不同地理來源的種類鑒定；(2)可以最大限度地保持供試樣品的形態(tài)完整性；(3)標(biāo)準(zhǔn)化操作及技術(shù)的通用性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102367480SQ20111034767
公開日2012年3月7日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者伍祎, 劉佳琪, 姜帆, 李志紅, 楊定, 柳麗君, 梁亮, 陳英才 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)