專利名稱：一種ivf胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種IVF(In Vitro Fertilization,試管受精)胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，特別涉及以一種利用改良實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)分析IVF單個植入前胚胎的基因表達來進行IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法。
背景技術(shù)：
1978年7月25日，世界上第一個成功的“試管”嬰孩(IVF，體外受精)路易絲喜悅布朗，在英國出生。從此，IVF為全球超過占10%的不孕癥夫婦帶來了福音。發(fā)明IVF的英國科學(xué)家羅伯特愛德華茲教授被授予2010年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎。然而，三十多年的臨 床實踐并沒有顯著提高IVF的成功率。如，2011年，美國妊娠協(xié)會統(tǒng)計35歲病人IVF成功率(受孕率)在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而嬰兒出生率更低。其中一個重要的原因是IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量。這是IVF胚胎質(zhì)量最重要的決定性因素之一。目前，選擇植入母體的囊胚期胚胎主要是根據(jù)胚胎的形態(tài)學(xué)特性。而迄今尚未有一種特殊的生物學(xué)標(biāo)記及監(jiān)測手段來確定培養(yǎng)液和胚胎質(zhì)量。胚胎質(zhì)量與胚胎學(xué)家的經(jīng)驗密切相關(guān)。這種人為的選擇實際上存在潛在的危險性。因為即使有優(yōu)良形態(tài)學(xué)特性的胚胎仍可能存在基因突變和缺陷。如Sirtuins蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝功能，在IVF植入前胚胎期發(fā)揮了重要的作用。Sirt3基因的缺陷誘導(dǎo)了腫瘤抑制蛋白trp53的表達而抑制了胚胎的發(fā)育。如果sirt3基因和trp53基因同時缺陷，可改善胚胎的發(fā)育。這種情況也可見于單獨trp53基因缺陷時，而胚胎表現(xiàn)為正常的形態(tài)學(xué)特性。在利用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chainsreaction)方法檢測小鼠受精卵體外培養(yǎng)72-96小時后的胚胎發(fā)現(xiàn)一組胚胎中總的腫瘤抑制基因trp53mRNA總量明顯低于體內(nèi)生長的同期胚胎。RNA微陣列(RNA Microarray)也顯示小鼠一組IVF囊胚期胚胎明顯比體內(nèi)生長的囊胚期胚胎表達了低的trp53mRNA。目前尚未知道這組胚胎中有多少個胚胎不表達trp53，如果這個trp53基因缺陷的胚胎植入至母體，下一代的腫瘤發(fā)生率無疑將大大增高。Microarray顯示小鼠受精卵體外在Whitten氏培養(yǎng)液和KSOM+氨基酸培養(yǎng)液培養(yǎng)96小時所形成的囊胚期胚胎分別有114和29個基因表達異常。我們對目前臨床常用的三種IVF培養(yǎng)液中生長成的小鼠囊胚期胚胎的分析顯示52-102個基因表達異常，異常程度非常不同，而且影響了許多關(guān)鍵的細胞功能和重要器官的發(fā)育。例如1.決定干細胞潛能性的轉(zhuǎn)錄因子，Nanog和UTFl ；2.干細胞分裂和維持功能；3.心室肌細胞的發(fā)育，肺泡細胞的發(fā)育，大腦皮層神經(jīng)元的分化和突觸的發(fā)育；4. B淋巴細胞的分化；5.細胞對DNA損傷的反應(yīng)；6.細胞清除極低密度脂蛋白的能力，等等。這說明目如臨床常用IVF培養(yǎng)液可能存在缺陷，也就是說迄今我們尚未有最理想的IVF培養(yǎng)液。其中主要的原因是尚未有可靠有效的手段來監(jiān)測IVF培養(yǎng)液的質(zhì)量。雖然微陣列(MiciOarray)分析提供了強有力的工具來分析單一實驗過程中成千上萬個基因的表達。然而它并不適合于樣品的RNA量相當(dāng)小的時候(對于Microarray,通常每個樣品至少需要50ng RNA，我們的經(jīng)驗需要100個以上囊胚期胚胎)。這不可能用人類單個IVF病例的100個囊胚期胚胎作Microarray分析,換句話說,Microarray目前并不能作為人類檢測IVF胚胎的基因表達的手段。另一種重要的情況是不同基因在卵子和各植入前胚胎期的表達形式差別很大，尤其當(dāng)被測基因的RNA轉(zhuǎn)錄子的豐度低，而且它的轉(zhuǎn)錄子壽命又較短，而這種特性可能在調(diào)節(jié)植入前胚胎期功能發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，這種瞬時表達的基因用Microarray分析技術(shù)也不易監(jiān)測到
發(fā)明內(nèi)容
為解決RNA Microarray在基因表達分析中的不足,本發(fā)明提供了一種IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其利用改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)來有效的分析基因在單個細胞和單個植入前期胚胎表達的方法，以此來監(jiān)控IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量。這種改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)操作要求相當(dāng)高，但非常敏感，高度精確，同時能產(chǎn)生可觀的資料。利用這種方法，可以彌補MiCToarray的不足，對分析單個關(guān)鍵基因在單個細胞的表達和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應(yīng)用價值。這種技術(shù)還提供了有效的方法去檢測那些潛在重要的瞬時表達的RNA轉(zhuǎn)錄子，和怎樣估價并且解釋在總RNA池完成的基因表達分析的結(jié)果，不至于掩蓋那些相對穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)錄子的重要信息。為達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明的用于監(jiān)測IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前期胚胎的基因表達方法包括以下步驟標(biāo)本收集及純化；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄陰性對照和陽性對照；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時定量PCR檢測； 使用組織細胞RNA進行優(yōu)化PCR條件；在該條件下同時放大擴增陰性對照和陽性對照；采用相對定量的方法檢測目的基因的表達量；以及進行統(tǒng)計學(xué)分析。本發(fā)明還提出了利用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前期胚胎的基因表達方法中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系以及PCR檢測的反應(yīng)體系。由于當(dāng)進行人類IVF時，不可能利用較多的受精卵和植入前胚胎期胚胎作基因表達分析。但可以從單個IVF病例中通過超細的玻璃吸管提取幾個植入前胚胎期胚胎和單個胚胎細胞作基因表達分析以評估此病例IVF胚胎質(zhì)量，確定IVF植入前胚胎的生物學(xué)指標(biāo)。本專利申請的發(fā)明人已經(jīng)應(yīng)用此方法對目前臨床常用的四種IVF培養(yǎng)液對植入前胚胎期胚胎進行了幾個重要轉(zhuǎn)錄子基因表達分析，此方法為我們今后再確定新的IVF和體外胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)液的條件提供了一個重要的監(jiān)測手段。


通過下面結(jié)合附圖的詳細描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖I所示為本發(fā)明的一個具體實施例的免疫熒光技術(shù)和Westernblot分析BCL2和FOS在植入前小鼠胚胎中的表達；圖2所示為本發(fā)明的一個具體實施例的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析Bcl2和Fos基因在30個胚胎總RNA池內(nèi)的表達；圖3所示為本發(fā)明的一個具體實施例的利用改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測Bcl2和Fos基因在單個受精卵和二細胞期胚胎中的表達；圖4所示為本發(fā)明的改良實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR用于分析基因在單個細胞和單個植入前期胚胎表達的方法的步驟示意圖。
具體實施例方式如圖4所示，根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的用于IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測的一種改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析基因在單個細胞和單個植入前期胚胎的基因表達方法，包括以下步驟·SI、收集標(biāo)本臨床常規(guī)收集標(biāo)本，經(jīng)過至少三次預(yù)冷的PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)洗滌，通過超細的玻璃吸管將單個受精卵或植入前胚胎或胚胎細胞，總?cè)萘繛镺. lyL，轉(zhuǎn)移到O. 9μ L的RNA抽提液當(dāng)中，所述抽提液為I XPCR緩沖液中加入O. IIU RNA酶抑制齊U，經(jīng)過液態(tài)氮處理后收集全部RNA。S2、收集的 RNA 用 RQl RNase-Free DNase Kit (澳大利亞 Promega 公司生產(chǎn))進一步純化。每個胚胎或胚胎細胞RNA用O. IIURQl RNase-Free DNase，加O. I μ L的緩沖液，經(jīng)過37°C下10分鐘，加O. I μ L終止液，95°C下I分鐘。經(jīng)過這種純化的RNA可直接用于反轉(zhuǎn)錄或儲存在零下80°C備用,最長可儲備至6個月。S3、進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),其反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其是利用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達來進行IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測，所述反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達方法包括步驟 標(biāo)本收集及純化； 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)； 逆轉(zhuǎn)錄陰性對照和陽性對照； 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時定量PCR檢測； 使用組織細胞RNA進行優(yōu)化PCR條件； 在該條件下同時放大擴增陰性對照和陽性對照； 采用相對定量的方法檢測目的基因的表達量；以及 進行統(tǒng)計學(xué)分析。
2.如權(quán)利要求I所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法方法，其中所述標(biāo)本收集及純化的步驟包括 臨床常規(guī)收集標(biāo)本，經(jīng)過至少三次預(yù)冷的PBS洗滌，通過超細的玻璃吸管將單個受精卵或植入前胚胎或胚胎細胞，總?cè)萘繛镺. I μ L,轉(zhuǎn)移到O. 9μ L的RNA抽提液當(dāng)中，經(jīng)過液態(tài)氮處理后收集全部RNA ;所述抽提液為IXPCR緩沖液中加入O. IIU RNA酶抑制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其中所述標(biāo)本收集及純化的步驟包括 將收集的 RNA 用 RQl RNase-Free DNase Kit (Promega, Australia)進一步純化，每個胚胎或胚胎細胞RNA用O. IIU RQlRNase-Free DNase,加O. I μ L的緩沖液；經(jīng)過37。。下10分鐘，加O. I μ L終止液，95 °C下I分鐘。
4.如權(quán)利要求I所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)體系為 模板 I. 3 μ 1，逆轉(zhuǎn)錄酶 2. 5U，隨機引物 2. 5 μ M，dNTPsO. 5 μ M，Mg++4mM, RNase 抑制劑O.2U，IOxPCR緩沖液0.4 μ 1，加Milli Q超純水至終體積4 μ I。
5.如權(quán)利要求4所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)條件為25°C下10分鐘，然后42°C下2分鐘；然后在99°C下2分鐘以及4°C下10分鐘。
6.如權(quán)利要求I所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其中在逆轉(zhuǎn)錄陰性對照和陽性對照時，逆轉(zhuǎn)錄陰性對照不加入逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA模板，陽性對照以組織細胞RNA為模板。
7.如權(quán)利要求I所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其中在逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時定量PCR檢測步驟中，RT產(chǎn)物進行實時定量PCR反應(yīng)體系如下模板(cDNA)2y 1，TaqDNApolymerase O. 75IU，引物 I μ Μ, dNTPs O. 5 μ M, DMSO O. 05 μ I, Mg++2mM,熒光染料 SYBRgreen O. I μ I, IOxPCR緩沖液I μ 1，加MilliQ超純水至終體積10 μ I。
8.如權(quán)利要求I所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其中在使用組織細胞RNA進行優(yōu)化PCR條件步驟中，所用的PCR條件如下95°C10分鐘95°C15 秒〕60°C30秒[40周期 72°C45秒」 40C 10分鐘。
9.如權(quán)利要求8所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其中在該優(yōu)化條件下放大擴增陰性對照和陽性對照時，所述陰性對照不加入逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA模板，所述陽性對照包括Housekeeper基因,和目的基因在已知的組織細胞中的表達。
10.如權(quán)利要求I所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測方法，其中采用相對定量的方法檢測目的基因的表達量的步驟包括計算出組織細胞中檢測目的基因與Housek^per基因的閾值差，和胚胎中檢測目的基因與Housek^per基因的閾值差，采用相對定量2_Λ Act的方法檢測目的基因的表達量。
全文摘要
本發(fā)明提出一種利用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達來進行IVF胚胎培養(yǎng)液質(zhì)量監(jiān)測的方法，所述利用反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個植入前胚胎的基因表達方法包括步驟標(biāo)本收集及純化；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；逆轉(zhuǎn)錄陰性對照和陽性對照；RT產(chǎn)物進行實時定量PCR檢測；使用組織細胞RNA進行優(yōu)化PCR條件；在該條件下同時放大擴增陰性對照和陽性對照；采用相對定量的方法檢測目的基因的表達量；以及進行統(tǒng)計學(xué)分析。這種改良的實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)非常敏感，高度精確，同時能產(chǎn)生可觀的資料。利用這種方法，可以彌補Microarray的不足，對分析單個關(guān)鍵基因在單個細胞的表達和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應(yīng)用價值。此方法為確定新的IVF和體外胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)液的條件提供了一個重要的監(jiān)測手段。
文檔編號C12Q1/68GK102864212SQ201110362870
公開日2013年1月9日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者金星亮, 白麗君, 常菁 申請人:江蘇邁健生物科技發(fā)展有限公司