專利名稱：多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架及其制備方法和用途，具體為將單種或多種細胞層狀分布在多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架的方法及由該方法制得的單種或多種細胞層狀分布的三維管狀結(jié)構(gòu)的用途，屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
組織工程的本質(zhì)是用活細胞構(gòu)建一種新的有功能的組織，這些細胞以某種方式與細胞外基質(zhì)或支架材料相結(jié)合，細胞基質(zhì)和支架材料引導組織的發(fā)育。利用組織工程方法在體外構(gòu)建人造器官，再植入體內(nèi)，在許多疾病的治療特別是器官的修復具有很好的前景。這其中，更真實的模擬體內(nèi)器官多種細胞在細胞外基質(zhì)上生長和分布情況，讓人造器官實現(xiàn)原有功能，成為研究的難點和熱點。體內(nèi)許多器官的結(jié)構(gòu)是管狀結(jié)構(gòu)，如血管、腎小管、腸道、淋巴管、輸卵管等，除了管狀結(jié)構(gòu)外，這些組織大部分都具有一個共同特點:管壁都是有多層不同的細胞構(gòu)成(少數(shù)除外，比如腎小管、毛細血管和淋巴管)。在組織工程領(lǐng)域有許多文獻報道了管狀結(jié)構(gòu)組織工程支架的制備方法。其基本思路是高分子材料依靠柱狀或管狀模具成型后，將細胞種植在管狀結(jié)構(gòu)上，培養(yǎng)形成細胞-材料復合物，或是將細胞種植在平面上，再依靠管狀模具將平面卷起來?，F(xiàn)今主要有兩種多層細胞管狀結(jié)構(gòu)制備方法:第一種，將多層細胞逐層地卷曲在圓柱形模子外側(cè)，經(jīng)過長時間培養(yǎng)(至少三個月)，使細胞層之間形成連接，最終形成管狀結(jié)構(gòu)。第二種，將細胞種植在薄膜表面，然后手動將薄膜疊在一起卷曲成卷，并在外部用O形環(huán)固定，使之保持管狀結(jié)構(gòu)。其存在的問題為:培養(yǎng)時間長，由于需要手動卷曲，并需要用O形環(huán)將管狀結(jié)構(gòu)固定，存在著人為因素對管狀結(jié)構(gòu)的影響。管狀結(jié)構(gòu)中細胞生長的極性與真實器官不符；更不可能實現(xiàn)多種細胞在材料上的可控分布生長。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的培養(yǎng)時間長；需要手動卷曲，并需要用O形環(huán)將管狀結(jié)構(gòu)固定這些人為因素對管狀結(jié)構(gòu)的影響；管狀結(jié)構(gòu)中細胞生長的極性與真實器官不符；更不可能實現(xiàn)多種細胞在材料上的可控分布生長的不足，提供一種多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架及其制備方法和用途，具體為將單種或多種細胞層狀分布在多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架的方法及由該方法制得的單種或多種細胞層狀分布的三維管狀結(jié)構(gòu)的用途，以實現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)中細胞生長的極性與真實器官相符并且實現(xiàn)多種細胞在材料上可控地分布生長。針對上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架，該支架包括高分子彈性膜層和與其貼合的高分子固定層，所述高分子彈性膜層的彈性使得所述支架自動卷曲成多層管狀結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，所述高分子彈性膜層為聚二甲基硅氧烷(PDMS)或丙三醇-癸二酸共聚物(PGS)彈性膜層。優(yōu)選地，所述高分子彈性膜層為帶有多孔結(jié)構(gòu)的彈性膜層或由兩條彈性條帶構(gòu)成的彈性膜層。優(yōu)選地，所述高分子固定層由聚二甲基硅氧烷彈性膜或丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜層或其他具有柔韌性的高分子薄膜構(gòu)成。優(yōu)選地，所述高分子薄膜為電紡絲薄膜。優(yōu)選地，當所述高分子固定層由聚二甲基硅氧烷彈性膜或丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜層構(gòu)成時，所述高分子固定層下表面設(shè)有微槽結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，當所述高分子固定層由具有柔韌性的高分子薄膜構(gòu)成時，所述高分子彈性膜層與高分子固定層通過粘合劑層貼合。另一方面，本發(fā)明還提供一種多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架的制備方法，包括以下步驟:1)制備高分子彈性薄膜；2)制備高分子固定層；3)將高分子彈性薄膜拉伸后貼合在高分子固定層上成雙層復合膜；4)將上述步驟3)所得雙層復合膜釋放后，自卷曲形成多層管狀結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，在步驟I)中，所述高分子彈性膜層為聚二甲基硅氧烷或丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜層，其是通過包括下述步驟的方法制備的:將聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物旋涂于模板的基底上成薄膜，之后再經(jīng)過高溫反應(yīng)固化交聯(lián)成彈性薄膜，即得；優(yōu)選地，所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液由聚二甲基硅氧烷預聚物與固化劑以10: I體積比組成；優(yōu)選地，所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物在勻膠機中旋涂于模板的基底上，所述勻膠機的轉(zhuǎn)速為IOOOrpm 6000rpm，時間是30s 60s ；優(yōu)選地，當所述高分子彈性膜層為聚二甲基硅氧烷彈性膜時，所述高溫反應(yīng)條件為 80-150°C烘烤 5-30min ;或當所述高分子彈性膜層為丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜層時，所述高溫反應(yīng)條件為于真空干燥箱內(nèi)，真空度為30 50mTorr，120_150°C反應(yīng)24 48h ;更為優(yōu)選地，所述模板的基底經(jīng)等離子體處理后，再用勻膠機旋涂蔗糖水溶液于模板的基底上，所述勻膠機的轉(zhuǎn)速為1000 3000rpm，旋涂時間是30 60s。更為優(yōu)選地，當所述高分子彈性膜層為帶有多孔結(jié)構(gòu)的彈性膜層時，在將聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物旋涂成薄膜之前，還包括通過光刻制備柱狀微陣列模板，再將其通過全氟硅烷處理的步驟；更優(yōu)選地，所述模板的基底為單晶硅片。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述高分子固定層由聚二甲基硅氧烷預聚物彈性膜或丙三醇-癸二酸預聚物彈性膜層或其他具有柔韌性的高分子薄膜構(gòu)成，優(yōu)選地，所述具有柔韌性的高分子薄膜為電紡絲薄膜；優(yōu)選地，當所述高分子固定層由聚二甲基硅氧烷預聚物彈性膜或丙三醇-癸二酸預聚物彈性膜層構(gòu)成時，所述高分子固定層下表面設(shè)有微槽結(jié)構(gòu)；其是通過包括下述步驟的方法制備的:將聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物旋涂于模板的基底上成薄膜，之后再經(jīng)過高溫反應(yīng)，即得，優(yōu)選地，高溫反應(yīng)至所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液達到半固化交聯(lián)狀態(tài)；優(yōu)選地，所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液由聚二甲基硅氧烷預聚物與固化劑以10: I體積比組成；優(yōu)選地，所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物在勻膠機中旋涂于模板的基底上，所述勻膠機的轉(zhuǎn)速為IOOOrpm 6000rpm,時間是30s 60s ；優(yōu)選地，當所述高分子固定層由聚二甲基硅氧烷彈性膜構(gòu)成時，所述高溫反應(yīng)條件為 80-150°C烘烤 5-30min ;或優(yōu)選地，當所述高分子固定層由丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜構(gòu)成時，其是通過包括下述步驟的方法制備的:將丙三醇-癸二酸的預聚物在熔融狀態(tài)下通過旋涂或流延的方法形成薄膜，之后再經(jīng)過真空高溫反應(yīng)固化交聯(lián)成彈性薄膜；更為優(yōu)選地，熔融溫度為120 150°C，高溫真空反應(yīng)條件為真空度為30 50mTorr環(huán)境下120 150°C反應(yīng)24 48h ;或優(yōu)選地，當所述高分子薄膜為電紡絲薄膜時，其是通過包括下述步驟的方法制備的:配制高分子電紡絲溶液，再將其放入電紡絲裝置的注射針筒中，獲得靜電紡絲薄膜；或優(yōu)選地，當所述高分子固定層下表面設(shè)有微槽結(jié)構(gòu)時，在將聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物旋涂成薄膜之前，還包括通過光刻制備柱狀微陣列模板，再將其通過全氟硅烷處理的步驟。更為優(yōu)選地，所述模板的基底為單晶硅片或載玻片。優(yōu)選地，在步驟3)中，其是通過包括下述步驟的方法制備的:當所述的高分子彈性膜層和高分子固定層均由聚二甲基硅氧烷構(gòu)成時，將半固化的高分子固定層放置在固定軌道上，再將拉伸后的高分子彈性膜層和高分子固定層貼合后加熱使其完全固化，優(yōu)選地，于80°C 150°C烘箱中加熱15 35min，優(yōu)選地，所述高分子彈性膜層通過拉伸裝置進行拉伸，優(yōu)選地，所述拉伸裝置包括兩個`夾具和與配套的固定軌道。優(yōu)選地，當所述高分子彈性膜層和高分子固定層均由丙三醇-癸二酸預聚物彈性膜構(gòu)成時，將高分子彈性膜層和高分子固定層貼合前，還包括將高分子彈性膜層和高分子固定層的接觸面都經(jīng)過等離子體處理，再將高分子彈性膜層拉伸與高分子固定層貼合的步驟，優(yōu)選地，等離子體處理1.5min ;或當所述高分子彈性膜層為多孔結(jié)構(gòu)的彈性膜層時，還包括在高分子彈性膜層和高分子固定層之間涂抹聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液的步驟；或當所述高分子固定層通過具有柔韌性的高分子薄膜構(gòu)成時，在高分子彈性膜層和高分子固定層貼合前，還包括在高分子彈性膜層和高分子固定層之間均勻涂覆粘合劑的步驟。優(yōu)選地，在步驟4)中，具體通過以下方法進行:將貼合牢固的高分子固定層和高分子彈性膜層從基底和夾具上剝離釋放，高分子固定層和高分子彈性膜層共同自發(fā)卷曲成多層管狀結(jié)構(gòu)的細胞培養(yǎng)支架，即得；優(yōu)選地，所述模板的基底為單晶硅片或載玻片。再一方面本發(fā)明提供一種將單種/多種細胞層狀分布在多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架的方法，包括以下步驟:I)將上述的細胞培養(yǎng)支架或?qū)⑸鲜龇椒ㄖ频玫募毎囵B(yǎng)支架平整地固定于培養(yǎng)皿底部；
2)制備聚二甲基硅氧烷微流管道，并將其緊密貼合在步驟I)中的細胞培養(yǎng)支架表面；3)在聚二甲基硅氧烷微流管道中通入細胞外基質(zhì)蛋白，孵育，優(yōu)選地，所述細胞外基質(zhì)蛋白為纖維連接蛋白(fibronectin, FN)或?qū)诱尺B蛋白(laminin, LN)；4)在聚二甲基硅氧烷微流管道的不同管道分別通入單種/多種細胞懸液；5)細胞貼壁后，將聚二甲基硅氧烷微流管道揭去，釋放載有細胞的自卷曲高分子膜，形成具有單種/多種細胞層狀分布的三維管狀結(jié)構(gòu)，即得。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述聚二甲基硅氧烷微流管道過軟刻蝕的技術(shù)制得，優(yōu)選地，聚二甲基硅氧烷微流管道的模板通過光刻的方法在硅片上制備，或通過機械加工的方法在有機玻璃上刻出圖案，經(jīng)聚二甲基硅氧烷一次翻模和二次翻模制備而得。又一方面，本發(fā)明還提供一種由上述方法制得的單種/多種細胞層狀分布的三維管狀結(jié)構(gòu)的用途，所述三維管狀結(jié)構(gòu)用于模擬血管或腸道等多種細胞層狀分布管狀結(jié)構(gòu)的人體器官、用于病變或受損器官修復和作為體外研究模型。本發(fā)明的有益效果為:不僅能夠制備多層細胞的管狀結(jié)構(gòu)，而且優(yōu)點明顯，首先，不需要圓柱體作為依托和手動卷曲。因為本發(fā)明的卷曲材料為自卷曲彈性薄膜，可以自動卷曲，不需要三個月培養(yǎng)， 只需兩天，然后將薄膜釋放，其就可以自動成卷，釋放后薄膜會自動卷曲，這樣去除了人為因素的影響，更重要的是本發(fā)明的薄膜為內(nèi)部應(yīng)力驅(qū)動的，不需要外部O形環(huán)固定；在三維管狀結(jié)構(gòu)中實現(xiàn)多種細胞的可控層狀分布，更真實模擬體內(nèi)管狀組織結(jié)構(gòu)。解決組織工程學中存在的問題，比如:小尺寸(小于6毫米)人造血管易造成血管堵塞問題。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中:圖1為本發(fā)明所述的多種細胞層狀分布在多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架的制備方法的原理圖，A中I為被拉伸的PDMS薄膜的高分子彈性膜層，2為固定的高分子固定層(PDMS薄膜)，3為基底，箭頭為拉伸方向；B中4為微流管道，5為粘合后的雙層自卷曲膜；C中6為不同細胞通入微流管道中不同通道內(nèi)；D1中7為揭去管道后，管道中不同細胞被限定在不同區(qū)域，D2中8為縱向排列的細胞，9為橫向排列的細胞；E1為Dl釋放后形成的三層細胞管狀結(jié)構(gòu)，E2為D2釋放后形成的四層細胞管狀結(jié)構(gòu)；圖2本發(fā)明所述拉伸裝置，圖2A為本發(fā)明所述拉伸裝置的俯視圖，圖2B為本發(fā)明所述拉伸裝置的照片，圖2C為正在拉伸高分子彈性膜層的本發(fā)明所述拉伸裝置的照片，其中I為拉伸裝置，2為高分子彈性膜；圖3為本發(fā)明所述多孔結(jié)構(gòu)的PDMS自卷曲薄膜的制備方法示意圖，其中，A中I為被拉伸的多孔PDMS薄膜的高分子彈性膜層，2為具有高分子薄膜(電紡絲膜)的高分子固定層，3為基底，箭頭為拉伸方向；B中高分子彈性膜層和高分子固定層粘合在一起；C中釋放雙層膜自發(fā)卷曲成多層管狀結(jié)構(gòu)；圖4為本發(fā)明所述電紡絲薄膜的自卷曲膜制備方法示意圖，其中，A中I為被拉伸的PDMS條帶的高分子彈性膜層，2為靜電紡絲薄膜的高分子固定層，3為基底，箭頭為拉伸方向；B中被拉伸的PDMS條帶和靜電紡絲薄膜粘合在一起；C中釋放PDMS條帶和靜電紡絲膜后自發(fā)卷曲成多層管狀結(jié)構(gòu)；圖5為本發(fā)明所述的多種細胞層狀分布的三維管狀結(jié)構(gòu)激光共聚焦熒光顯微鏡照片，圖中A為揭去微流管道后三種細胞在平面PDMS自卷曲膜的分布情況，三種細胞分別染上不同顏色的熒光為釋放載有細胞的自卷曲PDMS膜后管壁的各層；C*B的局部放大圖；圖6為本發(fā)明所述的多層電紡絲管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架的掃描電子顯微鏡照片，A為聚己內(nèi)酯(PCL)電紡絲，B為PCL自卷曲紡絲膜形成的多層管狀結(jié)構(gòu)(即，多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架)；圖7為本發(fā)明所述的多孔結(jié)構(gòu)的自卷曲薄膜(即，多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架)掃描電鏡照片，A為多孔結(jié)構(gòu)的自卷曲膜形成的管狀結(jié)構(gòu)；B為六中矩形框局部放大照片；圖8為本發(fā)明所述的具有上皮細胞層狀分布管狀結(jié)構(gòu)的激光共聚焦熒光顯微鏡照片；圖9為本發(fā)明所述的具有環(huán)形和縱形細胞排列的三種細胞層狀分布管狀結(jié)構(gòu)的激光共聚焦熒光顯微鏡照片，A為三種細胞層狀分布管狀結(jié)構(gòu)；B為中間層平滑肌細胞橫向排列的局部放大照片；C為中間層平滑肌細胞縱向排列的局部放大照片。
具體實施例方式以下實施例中所用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，包括預聚物SYLGARD 184slicone elastomer base,固化劑SYLGARD 184 sliconeelastomer curing agent,購自DOW CORNING公司，單晶硅片購自天津半導體研究所，丙三醇-癸二酸共聚物(PGS)制備方法和性質(zhì)見文 獻NatureBiotechnology，VOLUME 20，2002，602-606，光刻膠購自MiciOChem，新生兒臍帶中的靜脈內(nèi)皮、平滑肌細胞、上皮細胞均購自北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學細胞中心，成纖維細胞由中國科學院力學所提供；PBS緩沖液的配方為IL蒸餾水里加Λ 8g NaCl，3.4g Na2HPO4^H2Oj0.2g KH2PO4,0.2g KC1。實施例1PDMS自卷曲薄膜(即，多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架)的制備，具體步驟如下:(I)制備高分子彈性膜層，即PDMS薄膜:預聚物和固化劑按照10: I的比例配制PDMS預聚物反應(yīng)液，在勻膠機中旋涂于光滑單晶硅片的表面，轉(zhuǎn)速為3000rpm，時間是30s。放在鼓風干燥箱中150°C烘烤15min，從烘箱中取出。(2)制備高分子固定層:將PDMS預聚物(與上述步驟中的PDMS預聚物同)反應(yīng)液在勻膠機中旋涂于干凈載玻片的表面，轉(zhuǎn)速為6000rpm，時間是60s。放在鼓風干燥箱中80°C烘烤4min，從烘箱中取出，要求載玻片表面的PDMS預聚物反應(yīng)液達到部分固化交聯(lián)，形成具有一定粘性但是沒有流動性狀態(tài)。(3)把PDMS薄膜的兩端置于夾具中，高分子固定層置于配套的固定軌道上。拉伸后的PDMS薄膜貼合在高分子固定層上，通過夾具放置在固定軌道孔眼的不同位置來調(diào)節(jié)拉伸距離。高分子彈性膜層貼合在高分子固定層上后放在烘箱中，于80°C烘烤35min后取出。(4)將雙層PDMS膜從夾具和載玻片上取下，可以自發(fā)形成多層管狀結(jié)構(gòu)，即多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架。多層管的直徑由高分子彈性膜層和高分子固定層膜的厚度和高分子彈性膜層的拉伸距離決定。實施例2具有多孔結(jié)構(gòu)的自卷曲薄膜(S卩，多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架)的制備，具體步驟如下:(I)制備具有多孔結(jié)構(gòu)的高分子彈性膜層，即PDMS薄膜:首先是模板的制備，主要過程為光刻，即利用光刻膠在紫外線照射下可改變性質(zhì)的特點在單晶硅片上制備柱狀微陣列，柱形的直徑為I微米到10毫米可調(diào)，高度為0.1微米到I毫米可調(diào)。光刻模板需經(jīng)過全氟硅烷處理后使用。其次是多孔PDMS薄膜的制備，方法是軟刻蝕技術(shù)，將PDMS預聚物反應(yīng)液在勻膠機中旋涂到光刻模板上，轉(zhuǎn)速范圍為3000rpm，時間是60s，隨后在烘箱中150°C加熱5min后，取出，將PDMS薄膜小心揭下即可獲得。(2)制備高分子固定層，即電紡絲薄膜:配制高分子電紡絲溶液，例如:20Wt%聚苯乙烯(PS)溶液，以四氫呋喃/N，N-二甲基甲酰胺(質(zhì)量比為1:1)為混合溶劑，放入電紡絲裝置的注射針筒中，金屬針頭加正高壓，接收鋁箔或不銹鋼網(wǎng)接地，獲得靜電紡絲薄膜。(3)高分子彈性膜層和高分子固定層的粘合:將作為高分子彈性膜層的多孔PDMS膜夾在夾具中，作為高分子固定層的電紡絲膜平鋪在載玻片上，放置在固定軌道之上，兩層之間可以通過涂抹微量PDMS預聚物(與步驟I中的PDMS預聚物同)反應(yīng)液，高分子彈性膜層在拉伸狀態(tài)貼合在高分子固定層上，之后放入80°C烘箱中加熱30min。(4)將雙層膜從夾具中取出，即可形成具有多孔結(jié)構(gòu)的PDMS自卷曲膜，即多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架。實施例3高分子固定層具有微槽結(jié)構(gòu)的PDMS自卷曲薄膜(即，多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架)的制備，具體步驟如下:(I)制備高分子彈性膜層，即PDMS薄膜:PDMS預聚物和固化劑按照10: I的比例配制PDMS預聚物反應(yīng)液，在勻膠機中旋涂于光滑單晶硅片的表面，轉(zhuǎn)速為2000rpm，時間是60s。放在鼓風干燥箱中150°C烘烤5min，從烘箱中取出，將PDMS薄膜從硅片上揭下。(2)制備具有微槽結(jié)構(gòu)的高分子固定層:首先是模板的制備，主要過程為光刻，即利用光刻膠在紫外線照射下可改變性質(zhì)的特點在硅片上制備凸起長方體陣列，寬度為I微米到I毫米可調(diào)，但是一般與細胞大小相當(100微米以內(nèi))，高度為0.1微米到100微米(一般不超過細胞高度，約5微米以內(nèi))。光刻模板需經(jīng)過全氟硅烷處理后使用。其次在勻膠機中將PDMS預聚物反應(yīng)液(與上述步驟中的PDMS預聚物同)旋涂到光刻模板上，轉(zhuǎn)速為2000rpm，時間是60s。放在鼓風干燥箱中150°C烘烤5分鐘，從烘箱中取出，部分固化交聯(lián)形成具有一定粘性但是沒有流動性狀態(tài)。(3)把PDMS薄膜的兩端置于夾具中，高分子固定層置于配套的固定軌道上。拉伸后的PDMS薄膜貼合在高分子固定層上，通過夾具在固定軌道孔眼的不同位置來調(diào)節(jié)拉伸距離。高分子彈性 膜層貼合在高分子固定層上后放在烘箱中，于80°C烘烤35min后取出。(4)將雙層PDMS膜從夾具和光刻模板上小心取下，即可獲得具有微槽結(jié)構(gòu)PDMS自卷曲薄膜，即多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架。實施例4
高分子固定層為電紡絲薄膜的自卷曲膜(B卩，多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架)制備，具體步驟如下:(I)制備高分子彈性膜層，即PDMS薄膜:預聚物和固化劑按照10: I的體積比例配制PDMS預聚物反應(yīng)液，在勻膠機中旋涂于光滑單晶硅片的表面，轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，時間是45s。放在鼓風干燥箱中150°C烘烤5min，從烘箱中取出，將PDMS薄膜從硅片上揭下。(2)制備高分子固定層，即電紡絲薄膜:配制高分子電紡絲溶液，例如:20Wt%聚乙交酯丙交酯預聚物(PLGA)溶液，以丙酮/N，N-二甲基甲酰胺(質(zhì)量比為2: I)為混合溶劑或20wt%聚己內(nèi)酯(PCL)溶液，以二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺(質(zhì)量比為3: I)為混合溶劑，放入電紡絲裝置的注射針筒中，金屬針頭加正高壓，接收鋁箔或不銹鋼網(wǎng)接地，獲得靜電紡絲薄膜。(3)把電紡絲膜放置載玻片上并置于固定軌道上。將PDMS薄膜切割成PDMS條帶，條帶按一定間距放入夾具 中，一般條帶的數(shù)目是兩條，拉伸后與電紡絲膜貼合，之間涂覆硅膠粘合劑層，等待粘合劑層固化。(4)將PDMS條帶從夾具中釋放，即可獲得電紡絲自卷曲膜，即多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架(如圖6所示)。實施例5按照與實施例3相同的方法制備微槽結(jié)構(gòu)的PDMS自卷曲薄膜，所不同的是，在(I)制備高分子彈性膜層中，放在鼓風干燥箱中120°C烘烤18min ;在(2)制備具有微槽結(jié)構(gòu)的高分子固定層中，也放在鼓風干燥箱中120°C烘烤18分鐘，在步驟(3)中，高分子彈性膜層貼合在高分子固定層上后放在烘箱中，于115°C烘烤25min后取出。實施例6PGS (制備方法和性質(zhì)見文獻 Nature Biotechnology, VOLUME 20，2002，602-606)
自卷曲膜(即，多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架)的制備。(I)高分子彈性膜層，即PGS薄膜的制備:單晶硅片經(jīng)等離子體處理5min，用勻膠機旋涂61.5%蔗糖水溶液于硅片上，轉(zhuǎn)速為3000rpm，時間是60s。在烘箱內(nèi)135°C烘烤IOmin0將PGS預聚物在120°C熔融，隨后旋涂到涂覆蔗糖的硅片上，轉(zhuǎn)速是1500rpm，時間是60s。隨后在真空干燥箱內(nèi)(真空度為30mTorr) 120°C反應(yīng)48h。(2)將PGS薄膜從硅片上小心揭下，高分子彈性膜層在夾具中夾好，高分子固定層膜平鋪在載玻片上放置在固定軌道上，兩層膜膜接觸面都經(jīng)過等離子體處理1.5min，拉伸高分子彈性膜層貼合在高分子固定層上，放入烘箱中80°C烘烤30min。(3)將PGS雙層膜從夾具中釋放，即可獲得PGS自卷曲膜，即多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架，其特點是可以完全降解。實施例7-9按照與實施例6相同的方法制備PGS自卷曲膜，不同的條件如下:
權(quán)利要求
1.一種多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架，該支架包括高分子彈性膜層和與其貼合的高分子固定層，所述高分子彈性膜層的彈性使得所述支架自動卷曲成多層管狀結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述高分子彈性膜層為聚二甲基硅氧烷或丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜層，優(yōu)選地，所述高分子彈性膜層為帶有多孔結(jié)構(gòu)的彈性膜層或由兩條彈性條帶構(gòu)成的彈性膜層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，所述高分子固定層由聚二甲基硅氧烷彈性膜或丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜層或具有柔韌性的高分子薄膜構(gòu)成，優(yōu)選地，所述高分子薄膜為電紡絲薄膜，優(yōu)選地，當所述高分子固定層為由聚二甲基硅氧烷預聚物彈性膜或丙三醇-癸二酸預聚物彈性膜層構(gòu)成時，所述高分子固定層下表面設(shè)有微槽結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞培養(yǎng)支架，其特征在于，當所述高分子固定層由具有柔韌性的高分子薄膜構(gòu)成時，所述高分子彈性膜層與高分子固定層通過粘合劑層貼合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的細胞培養(yǎng)支架的制備方法，包括以下步驟: 1)制備高分子彈性薄膜； 2)制備高分子固定層； 3)將高分子彈性薄膜拉伸后貼合在高分子固定層上成雙層復合膜； 4)將上述步驟3)所得雙層復合膜釋放后，自卷曲形成多層管狀結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細胞培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，在步驟I)中，所述高分子彈性膜層為聚二甲基硅氧烷或丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜層，其是通過包括下述步驟的方法制備的:將聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物旋涂于模板的基底上成薄膜，之后再經(jīng)過高溫反應(yīng)固化交聯(lián)成彈性薄膜，即得； 優(yōu)選地，所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液由聚二甲基硅氧烷預聚物與固化劑以10: I體積比組成；優(yōu)選地，所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物在勻膠機中旋涂于模板的基底上，所述勻膠機的轉(zhuǎn)速為IOOOrpm 6000rpm，時間是30s 60s ； 優(yōu)選地，當所述高分子彈性膜層為聚二甲基硅氧烷彈性膜時，所述高溫反應(yīng)條件為80-150°C烘烤 5-30min ;或 當所述高分子彈性膜層為丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜層時，所述高溫反應(yīng)條件為于真空干燥箱內(nèi)，真空度為30 50mTorr，120 150°C反應(yīng)24 48h ;更為優(yōu)選地，所述模板的基底經(jīng)等離子體處理后，再用勻膠機旋涂蔗糖水溶液于模板的基底上，所述勻膠機的轉(zhuǎn)速為1000 3000rpm，旋涂時間是30s 60s ;或 更為優(yōu)選地，當所述高分子彈性膜層為帶有多孔結(jié)構(gòu)的彈性膜層時，在將聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物旋涂成薄膜之前，還包括一通過光刻制備柱狀微陣列模板，再將其通過全氟硅烷處理的步驟； 更優(yōu)選地，所述模板的基底為單晶硅片。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的細胞培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，所述高分子固定層由聚二甲基硅氧烷預聚物彈性膜或丙三醇-癸二酸預聚物彈性膜層或具有柔韌性的高分子薄膜構(gòu)成，優(yōu)選地，所述高分子薄膜為電紡絲 薄膜；優(yōu)選地，當所述高分子固定層為由聚二甲基硅氧烷預聚物彈性膜或丙三醇-癸二酸預聚物彈性膜層構(gòu)成時，所述高分子固定層下表面設(shè)有微槽結(jié)構(gòu)； 其是通過包括下述步驟的方法制備的:將聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物旋涂于模板的基底上成薄膜，之后再經(jīng)過高溫反應(yīng)，即得，優(yōu)選地，高溫反應(yīng)至所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液達到半固化交聯(lián)狀態(tài)；優(yōu)選地，所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液由聚二甲基硅氧烷預聚物與固化劑以10: I體積比組成；優(yōu)選地，所述聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或熔融狀態(tài)的丙三醇-癸二酸預聚物勻膠機中旋涂于模板的基底上，所述勻膠機的轉(zhuǎn)速為IOOOrpm 6000rpm,時間是30s 60s ； 優(yōu)選地，當所述高分子固定膜層由聚二甲基硅氧烷彈性膜構(gòu)成時，所述高溫反應(yīng)條件為 80-150°C烘烤 5-30min ;或 優(yōu)選地，當所述高分子固定層由丙三醇-癸二酸共聚物彈性膜構(gòu)成時，其是通過包括下述步驟的方法制備的:將丙三醇-癸二酸的預聚物在熔融狀態(tài)下通過旋涂或流延的方法形成薄膜，之后再經(jīng)過真空高溫反應(yīng)固化交聯(lián)成彈性薄膜；更為優(yōu)選地，熔融溫度為100 1200C，高溫真空反應(yīng)條件為真空度為30 50mTorr環(huán)境下120 150°C反應(yīng)24 48h ;或優(yōu)選地，當所述高分子薄膜為電紡絲薄膜時，其是通過包括下述步驟的方法制備的:配制高分子電紡絲溶液，再將其放入電紡絲裝置的注射針筒中，獲得靜電紡絲薄膜； 更優(yōu)選地，當所述高分子固定層下表面設(shè)有微槽結(jié)構(gòu)時，在將聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液或丙三醇-癸二酸預聚物在熔融狀態(tài)旋涂成薄膜之前，還包括一通過光刻制備柱狀微陣列模板，再將其通過全氟硅烷處理的步驟； 更為優(yōu)選地，所述模板的為單晶硅片或載玻片。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的細胞培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，在步驟3)中，其是通過包括下述步驟的方法制備的:將半固化的高分子固定層放置在固定軌道上，再將拉伸后的高分子彈性膜層和高分子固定層貼合后加熱使其完全固化，優(yōu)選地，于80 150°C烘箱中加熱15 35min，優(yōu)選地，所述高分子彈性膜層通過拉伸裝置進行拉伸，優(yōu)選地，所述拉伸裝置包括兩個夾具和與配套的固定軌道； 優(yōu)選地，當所述高分子彈性膜層和高分子固定層均由丙三醇-癸二酸預聚物彈性膜構(gòu)成時，將高分子彈性膜層和高分子固定層貼合前，還包括將高分子彈性膜層和高分子固定層均經(jīng)過等離子體處理，再將高分子彈性膜層拉伸與高分子固定層貼合的步驟，優(yōu)選地，等離子體處理1.5min ;或 當所述高分子彈性膜層為多孔結(jié)構(gòu)的彈性膜層時，還包括在高分子彈性膜層和高分子固定層之間涂抹聚二甲基硅氧烷預聚物反應(yīng)液的步驟或 當所述高分子固定層通過具有柔韌性的高分子薄膜構(gòu)成時，在高分子彈性膜層和高分子固定層貼合前，還包括在高分子彈性膜層和高分子固定層之間均勻涂覆粘合劑層的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項所述的細胞培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，在步驟4)中，具體通過以下方法進行:將貼合牢固的高分子固定層和高分子彈性膜層從基底和夾具上剝離釋放，高分子固定層和高分子彈性膜層自發(fā)卷曲成多層管狀結(jié)構(gòu)的細胞培養(yǎng)支架，即得。
10.一種將單種/ 多種細胞層狀分布在多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架的方法，包括以下步驟:1)將權(quán)利要求1-4中任一項的多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架或?qū)?quán)利要求5-9中任一項制得的多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架平整地固定于培養(yǎng)皿底部； 2)制備聚二甲基硅氧烷微流管道，并將其緊密貼合在步驟I)中的細胞培養(yǎng)支架表面； 3)在聚二甲基硅氧烷微流管道中通入細胞外基質(zhì)蛋白，孵育，優(yōu)選地，所述細胞外基質(zhì)蛋白為纖維連接蛋白或?qū)诱尺B蛋白； 4)在聚二甲基硅氧烷微流管道的不同管道分別通入單種/多種細胞懸液； 5)細胞貼壁后，將聚二甲基硅氧烷微流管道揭去，釋放載有細胞的自卷曲高分子膜，形成具有單種/多種細胞層 狀分布的三維管狀結(jié)構(gòu)，即得。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，所述聚二甲基硅氧烷微流管道過軟刻蝕的技術(shù)制得，優(yōu)選地，聚二甲基硅氧烷微流管道的模板通過光刻的方法在硅片上制備，或通過機械加工的方法在有機玻璃上刻出圖案，經(jīng)聚二甲基硅氧烷一次翻模和二次翻模制備而得。
12.—種由權(quán)利要求10或11制得的單種/多種細胞層狀分布的三維管狀結(jié)構(gòu)的用途，所述三維管狀結(jié)構(gòu)用于模擬血管或腸道多種細胞層狀分布管狀結(jié)構(gòu)的人體器官、用于病變或受損器官修復和作為體外研究模型。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架及其制備方法和用途，該支架包括位于高分子彈性膜層和與其貼合的高分子固定層，所述高分子彈性膜層的彈性使得所述支架自動卷曲成多層管狀結(jié)構(gòu)；所述該細胞培養(yǎng)支架的制備方法，包括以下步驟高分子彈性薄膜的制備；高分子固定層的制備；高分子彈性薄膜的拉伸及將其貼合在高分子固定層上；管狀結(jié)構(gòu)的成型；所述用途為提供一種將單種/多種細胞層狀分布在多層管狀結(jié)構(gòu)細胞培養(yǎng)支架的方法及由該方法制得的單種/多種細胞層狀分布的三維管狀結(jié)構(gòu)的用途，其用于模擬血管或腸道多種細胞層狀分布的人體器官、用于病變或受損器官修復和作為體外研究模型。
文檔編號C12N5/078GK103173353SQ20111043941
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者蔣興宇, 靳鈺, 袁博, 張偉 申請人:國家納米科學中心