專利名稱：特異性檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum,異名 Erwinia carotovora)的檢測(cè)方法，具體涉及一種特異性檢測(cè)植物軟腐病中此菌的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)。
背景技術(shù)：
植物軟腐病是一類重要的植物病害，可以由真菌引起，也可由細(xì)菌引起。同一種植物的腐爛病可以由果膠桿菌屬不同種的細(xì)菌引起，如馬鈴薯可以受到3種果膠桿菌即胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum、馬鈴薯黑胚病菌Pectobacterium atrosepticum(異名 Pectobacterium carotovorum var. atrosepticum, Erwinia carotovora subsp. atroseptica)、禾口胃 @ 氏 lif Pectobacterium chrysanthemi (胃名 Erwinia chrysanthemi)的危害，因此造成了病原鑒定的困難。曾有人介紹過馬鈴薯種薯中上述3種菌的常規(guī)鑒定方法，即分離病菌后通過革蘭氏染色、氧化酶試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵、利用α-甲基-D-葡萄糖、37°C和39°C生長(zhǎng)、蔗糖代謝產(chǎn)物的形成、磷酸酶的產(chǎn)生、紅霉素敏感性、吲哚的產(chǎn)生、血清反應(yīng)、組織浸解試驗(yàn)、及致病性檢驗(yàn)進(jìn)行鑒定的方法。這種方法太過于復(fù)雜、耗時(shí)。鑒定細(xì)菌種屬的分子檢測(cè)技術(shù)一般是用細(xì)菌16S rDNA通用引物做PCR，然后將 PCR產(chǎn)物測(cè)序后在NCBI網(wǎng)站做BLAST，根據(jù)最接近PCR產(chǎn)物序列的已經(jīng)報(bào)告的序列來判斷待測(cè)細(xì)菌的歸屬。不過，果膠桿菌屬不同種的16S rDNA序列非常相近，以致于無法準(zhǔn)確作出決斷。本發(fā)明人亦曾試圖依據(jù)已經(jīng)報(bào)告的果膠桿菌16SrDNA序列來設(shè)計(jì)特異性PCR引物，結(jié)果未能成功找到特異性好的備選序列。鑒于果膠桿菌造成軟腐癥狀的原因是產(chǎn)生果膠酶，為此對(duì)果膠桿菌的果膠酶基因做了嘗試，以便為準(zhǔn)確鑒定軟腐細(xì)菌提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決技術(shù)問題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的PCR方法，解決了根據(jù)16S rDNA序列鑒定果膠桿菌屬細(xì)菌特異性不好的問題，可以準(zhǔn)確地判斷植物軟腐病是否由胡蘿卜軟腐果膠桿菌引起。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種特異性檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的PCR方法，該方法是以胡蘿卜軟腐果膠桿菌果膠裂解酶基因特異性引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定。該特異性引物為正向引物5，-CTATAGCGGTAATGAAG-3，(如SEQ ID No 1 所示)，反向引物5，-TTACCGACGCCAGCATAG-3，(如SEQ ID No 2 所示)。對(duì)本發(fā)明詳述如下一、引物的設(shè)計(jì)發(fā)明人利用胡蘿卜軟腐果膠桿菌種間果膠酶基因核苷酸序列的特異性，從NCBI/ GenBank搜索并下載了胡蘿卜軟腐果膠桿菌的果膠酶基因堿基序列，用這些序列分別做BLAST，結(jié)果表明登錄號(hào)為L(zhǎng)32171. 1的胡蘿卜軟腐果膠桿菌果膠裂解酶基因的堿基序列的特異性比較好，見圖1。依據(jù)登錄號(hào)為L(zhǎng)32171. 1的堿基序列，用primerBLAST工具設(shè)計(jì)PCR引物序列如下正向引物5，-CTATAGCGGTAATGAAG-3，，反向引物5，-TTACCGACGCCAGCATAG-3，，上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR產(chǎn)物預(yù)計(jì)大小約為861bp。將正向引物和反向引物分別經(jīng)BLAST檢索，見圖2和圖3。結(jié)果表明該正向引物 BLAST得到的序列排在前面的6個(gè)序列和反向引物BLAST得到的序列排在前面的3個(gè)序列全是胡蘿卜軟腐果膠桿菌的序列。二、PCR 過程細(xì)菌基因組DNA的提取取胡蘿卜果膠桿菌胡蘿卜亞種PCC1000菌系細(xì)菌在常用的肉汁胨細(xì)菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30h，得到單菌落，用無菌牙簽挑取單菌落，洗入 ομ 1 ddH20中，99°C處理lOmin，離心后收集上清液，置于冰上備用。用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)對(duì)細(xì)菌總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為861bp。果膠酶基因擴(kuò)增條件預(yù)變性94°C 5min ；循環(huán)參數(shù)94°C 30sec ；65°C 30sec ； 72°C 60sec ；共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin 延伸。三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定取5μ IPCR產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)檢查，結(jié)果出現(xiàn)的條帶與預(yù)期的大小相符。將PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST，除了 1條登錄號(hào)為CP001790. 1的序列外，得到的全是胡蘿卜軟腐果膠桿菌的序列，見圖4。本文中提及的PCR技術(shù)包含從PCR衍生的所有技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光PCR。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本方法使用的一對(duì)引物是根據(jù)胡蘿卜軟腐果膠桿菌71號(hào)菌系果膠裂解酶基因序列(登錄號(hào)為L(zhǎng)32171. 1)設(shè)計(jì)的，使用此對(duì)引物做PCR 檢測(cè)時(shí)，可將胡蘿卜軟腐果膠桿菌與它屬細(xì)菌準(zhǔn)確區(qū)分，且可將胡蘿卜軟腐果膠桿菌與果膠桿菌屬其它種區(qū)分開來，特異性高。


圖1是登錄號(hào)為L(zhǎng)32171. 1的胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種果膠裂解酶基因的堿基序列BLAST結(jié)果。圖2是本發(fā)明正向引物的BLAST結(jié)果。圖3是本發(fā)明反向引物的BLAST結(jié)果。圖4是用本發(fā)明引物作PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列的BLAST結(jié)果。圖5是用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)作PCR的檢驗(yàn)結(jié)果。圖中從左至右的3道電泳帶依次為接種了胡蘿卜軟腐果膠桿菌的朝鮮薊病株樣品、未接種胡蘿卜軟腐果膠桿菌的無病的朝鮮薊莖對(duì)照、和Marker。圖6是4種細(xì)菌的PCR檢測(cè)結(jié)果。圖中從左至右的5道電泳帶依次為=MarkeiN馬鈴薯黑脛病菌、菊歐氏菌、胡蘿卜軟腐果膠桿菌和鳳梨泛菌。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一檢測(cè)染病植物以朝鮮薊根莖為例進(jìn)行說明，檢測(cè)引起朝鮮薊根莖腐爛病的胡蘿卜軟腐果膠桿菌。將從朝鮮薊根莖腐爛病株分離并鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌的菌種接種在無病的朝鮮薊莖上，等初期癥狀顯示后，從發(fā)病組織提取DNA作為PCR模板，然后用本發(fā)明引物對(duì)做PCR，PCR參數(shù)同前。PCR結(jié)果表明接種了胡蘿卜軟腐果膠桿菌的朝鮮薊莖為陽性，而未接種胡蘿卜軟腐果膠桿菌的無病的朝鮮薊莖為陰性，見圖5。說明用此特異性引物可檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌引起的病害。實(shí)施例二區(qū)分相近細(xì)菌按前述細(xì)菌DNA提取和PCR方法，檢驗(yàn)4種細(xì)菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌、馬鈴薯黑脛病菌、菊歐氏菌和鳳梨泛菌，結(jié)果只有胡蘿卜軟腐果膠桿菌樣品為陽性，其余3種細(xì)菌樣品為陰性，見圖6。由此，從理論上即L32171. 1序列BLAST和正、反向引物BLAST的結(jié)果，和從實(shí)踐上即實(shí)施例一和二都證實(shí)了本發(fā)明的引物對(duì)的特異性。用這對(duì)引物做PCR檢測(cè)，可將胡蘿卜軟腐果膠桿菌與它屬細(xì)菌準(zhǔn)確區(qū)分，且可區(qū)分胡蘿卜軟腐果膠桿菌與果膠桿菌屬的其它種細(xì)菌。
權(quán)利要求
1.一種特異性檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的PCR方法，其特征在于該方法是以胡蘿卜軟腐果膠桿菌果膠裂解酶基因特異的引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后電泳鑒定，該特異性引物為正向引物5，-CTATAGCGGTAATGAAG-3，， 反向引物5’ -TTACCGACGCCAGCATAG-3，。
2.如權(quán)利要求1所述的特異性檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌的PCR方法，其特征在于所述特異性引物是根據(jù)登錄號(hào)為L(zhǎng)32171. 1的胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種71號(hào)菌系果膠裂解酶基因的堿基序列設(shè)計(jì)的，PCR產(chǎn)物大小為861個(gè)堿基。
全文摘要
一種特異性檢測(cè)胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)的PCR方法，是根據(jù)胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種71號(hào)菌系果膠裂解酶基因的堿基序列(GenBankL32171.1)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，BLAST結(jié)果表明這對(duì)引物的特異性好。用這對(duì)引物做PCR檢測(cè)時(shí)不僅可將它屬細(xì)菌排除，且可區(qū)分胡蘿卜軟腐果膠桿菌與果膠桿菌屬的其它種細(xì)菌，特異性高。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102559901SQ20121001515
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者王曉麗, 高必達(dá) 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)