專(zhuān)利名稱(chēng)：大腸癌易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種大腸癌易感基因檢測(cè)試劑盒，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬖u(píng)估大腸癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別與程度，并作為預(yù)防和治療大腸癌的參考指南。
背景技術(shù)：
大腸癌為結(jié)腸癌和直腸癌的總稱(chēng)，是我國(guó)常見(jiàn)的腫瘤，其發(fā)病率已位居惡性腫瘤譜的第3 5位，且呈繼續(xù)上升趨勢(shì).引起大腸癌的危險(xiǎn)因素很多，我國(guó)20多年大腸癌的流行病學(xué)研究明確了引起中國(guó)人大腸癌的危險(xiǎn)因素主有腸息肉史、慢性腹瀉、慢性便秘、 粘液血便、精神刺激史、飲不潔水史、闌尾手術(shù)史和家族腫瘤史等，這些因素又可歸為環(huán)境因素與遺傳因素兩大類(lèi)。最近的研究表明，大腸癌的發(fā)生與CYP2E1、hMLHl、GSTMU GSTTU MTHFR五個(gè)遺傳易感基因密切相關(guān)。CYP2E1又稱(chēng)細(xì)胞色素P4502E1，是細(xì)胞色素P450酶體系的一員，是藥物代謝的核心體系成員。該酶主要分布于肝臟，其最適底物多為親脂性小分子化合物，包括苯、乙醇、氯乙烯、亞硝胺等，其中大部分為前致癌物和前毒物。CYP2E1能夠?qū)⑦@些前致癌物和前毒物活化，從而對(duì)機(jī)體帶來(lái)傷害。目前研究表明，CYP2E1基因上多態(tài)現(xiàn)象能改變其編碼酶的表達(dá)水平與活性，因而影響到機(jī)體對(duì)環(huán)境毒物的代謝能力，導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生。CYP2E1存在RsaI多態(tài)性，影響了 CYP2E1基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，CYP2E1 RsaI等位基因在大腸癌病例組和對(duì)照組中的分布具有顯著差異，是大腸癌發(fā)生的易感因素，特別是在與酒精協(xié)同作用下，患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步上升。CYP2E1 RsaI單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型有C/C、C/T、T/T三種，其中T/T基因型與大腸癌密切相關(guān)，該風(fēng)險(xiǎn)基因型攜帶者，CYP2E1基因表達(dá)的蛋白將使苯、乙醇、氯乙烯、亞硝胺等前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)，使個(gè)體患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)驟然升高。因此，CYP2E1 RsaI單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)是可以用于大腸癌的遺傳檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)屬于II相代謝酶，能促進(jìn)各種親電子的化合物(包括環(huán)境致癌物及其中間代謝產(chǎn)物)與谷胱甘肽結(jié)合，形成易溶于水的化合物排除體外，是與毒物或致癌物的解毒代謝有關(guān)的酶類(lèi)，已知人類(lèi)GSTs家族中GSTMl和GSTTl與腫瘤發(fā)生的關(guān)系最為密切。GSTMl具有present和null兩個(gè)等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指結(jié)構(gòu)基因缺失的純合子，又稱(chēng)為空白基因型，缺乏GSTMl酶活性。GSTTl基因多態(tài)現(xiàn)象與GSTMl類(lèi)似，亦存在缺乏GSTTl酶活性的缺失型基因。正常的GSTMl和GSTTl酶活性可能通過(guò)促進(jìn)致癌劑的親電作用及從體內(nèi)的排除而保護(hù)易感組織，防止體細(xì)胞的DNA突變，而GSTMl或GSTTl基因的純和缺失可能會(huì)降低或喪失機(jī)體代謝及排出致癌物的功能，從而具有較大的腫瘤危險(xiǎn)性。因此,GSTMl、GSTTI基因缺失可以作為大腸癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。MTHFR 的全稱(chēng)為 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH),是亞甲基四氫葉酸還原酶蛋白編碼基因。MTHFR作為一種還原酶，可將葉酸代謝通路中的5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，從而有利于葉酸生物學(xué)功能的發(fā)揮。此外，由于葉酸代謝通路與同型半胱氨酸代謝通路耦聯(lián)，因此，MTHFR酶活性的正常發(fā)揮有利于保持血液中的同型半胱氨酸水平，不至于出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥，為DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化提供甲基。此外葉酸的中間代謝產(chǎn)物在核苷酸合成過(guò)程中也有重要的作用，通過(guò)一碳單位代謝為嘌呤環(huán)的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷將導(dǎo)致機(jī)體多個(gè)基礎(chǔ)生化途徑的紊亂，包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、DNA甲基化修飾等，由此將引發(fā)癌癥、心腦血管等多種病癥。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與大腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，當(dāng)葉酸攝入和吸收水平高時(shí)，677T/T和677C/T基因型人群患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)較低，這兩類(lèi)基因型被視為大腸癌保護(hù)基因，而677C/C基因型人群在MTHFR酶耐熱性較強(qiáng)，不利于dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP，容易造成DNA損傷，大腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增強(qiáng)。綜上所述，鑒于CYP2E1、GSTMl、GSTTl、hMLHl和MTHFR基因與大腸癌的發(fā)生有著重要的關(guān)聯(lián)關(guān)系，可以做為預(yù)測(cè)和篩查大腸癌的潛在指征，通過(guò)對(duì)這些大腸癌易感基因的檢測(cè)，能在預(yù)測(cè)預(yù)防和指導(dǎo)治療大腸癌方面起到重要作用，并能大大降低大腸癌在中國(guó)人群中的發(fā)病概率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于CYP2E1基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present) ,MTHFR基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)C677T (rsl801133)這5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型可作為評(píng)估大腸癌發(fā)病的致病因素和危險(xiǎn)因子的基礎(chǔ)上，研制出一種大腸癌易感基因檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)CYP2E1 RsaI (rsl051740) , hMLHl Tl 151A，GSTMl，GSTTl，MTHFRC677T(rsl801133)5個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物；PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)； PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測(cè)序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應(yīng)體系10 X PCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul TaqDNA聚合酶0. 125ul ;20uM特異性引物對(duì)(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產(chǎn)物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ;ddH203. 875ul。測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測(cè)序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例I.大腸癌檢測(cè)試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對(duì)(1)CYP2E1 RsaI 正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'CYP2E1 RsaI 反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)hMLHl T1151A 正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'hMLHl Tll5IA 反向引物5/ TGTCTTATCCTCTGTGACAATG3'(3)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSITl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(5)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5 ill ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u I,ddH20 19. 175u I ；CYP2E1反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30s，58°C 30s退火，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10分鐘。hMLHl反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性40s，55°C 40s退火，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10分鐘。GSTTU GSTMl反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性50s，56°C 50s退火，72°C延伸40s，32個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸10分鐘。3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化使用檢測(cè)試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul，lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在 ABI2720 型 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min, 72°C、20min。4、DNA測(cè)序反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測(cè)序引物(1)CYP2E IRsaI 測(cè)序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'(2)hMLHl T1151A 測(cè)序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(3)GSTMl (Null/Present)測(cè)序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(4)GSTTl (Null/Present)測(cè)序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'
(5)MTHFR(C677T)測(cè)序引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA測(cè)序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98 °C 2min,進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測(cè)
序儀中。5、基因型分析 熟悉DNA測(cè)序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)工程師能夠通過(guò)辨識(shí)DNA測(cè)序圖譜確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。實(shí)施例2.篩查大腸癌風(fēng)險(xiǎn)人群的基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)服務(wù)I.無(wú)創(chuàng)采樣
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔粘膜上皮細(xì)胞取樣，樣本用細(xì)胞保存液常溫保存。2. DNA 抽提采用酚氯仿法對(duì)采集到的口腔粘膜細(xì)胞進(jìn)行DNA抽提。3.基因型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)受檢者基因組DNA的CYP2E1基因上Rsal(rsl051740), GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present), hMLHl基因上T1151A，MTHFR基因上C677T (rsl801133)的5個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測(cè)序，確定這5個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。4.大腸癌發(fā)病高危人群生物信息學(xué)分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通過(guò)對(duì)受檢者SNPs基因型的生物信息學(xué)分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型鑒定，出具大腸癌易感基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說(shuō)明了受檢者CYP2E1基因上RsaI (rsl051740)，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，hMLHl基因上T1151A，MTHFR基因上C677T (rsl801133)這5個(gè)SNP位點(diǎn)基因檢測(cè)信息、大腸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果和防治方案。根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說(shuō)明并解讀大腸癌易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.ー種檢測(cè)大腸癌易感基因的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，其組成成分為檢測(cè)CYP2E1基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)C677T(rsl801133)基因型的PCR特異引物與DNA測(cè)序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%こ醇溶液、100%こ醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特點(diǎn)在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)CYP2E1基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)C677T (rsl801133)，能特異性擴(kuò)增出包含5個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特點(diǎn)在于所述的DNA測(cè)序引物是針對(duì)CYP2E1基因上 RsaI (rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)C677T(rsl801133)，能通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)特異性檢測(cè)出上述5個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測(cè)序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所示的試劑盒，其所含的5對(duì)特異性引物序列如下(1)CYP2E1RsaI 正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3; CYP2E1 RsaI 反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)hMLHl T1151A 正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3' hMLHl T1151A 反向引物5' TGTCTTATCCTCTGTGACAATG3'(3)GSTMl (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3' GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3' GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3' (5)MTHFR(C677T)正向引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3' MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的5條DNA測(cè)序引物序列如下(1)CYP2E1RsaI 測(cè)序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3;(2)hMLHl T1151A 測(cè)序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(3)GSTMl (Null/Present)測(cè)序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(4)GSTTl (Null/Present)測(cè)序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3' (5)MTHFR(C677T)測(cè)序引物5'GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 (1) 0 反應(yīng)體系10父？0 反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對(duì)，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產(chǎn)物純化體系川/111SAP 酶O. 75ul，10U/ul ExoI 酶0. 375ul，ddH20 3.875ul。
(3)測(cè)序反應(yīng)體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測(cè)序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul，.100% こ醇溶液 15ul，70% こ醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。
本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_(kāi)20°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)大腸癌易感基因的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)5個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測(cè)序引物、PCR反應(yīng)體系、PCR產(chǎn)物純化體系、DNA測(cè)序反應(yīng)體系等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)與大腸癌發(fā)生密切相關(guān)的5個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型來(lái)評(píng)估中國(guó)人群中大腸癌患病的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別與程度，并根據(jù)受檢者基因檢測(cè)結(jié)果從基因維度指導(dǎo)中國(guó)人群有針對(duì)性的預(yù)防大腸癌的發(fā)生，旨在降低大腸癌的發(fā)病概率。本發(fā)明所使用樣本為口腔粘膜脫落細(xì)胞，采用口腔無(wú)創(chuàng)采樣法采集樣本，該法無(wú)痛、無(wú)創(chuàng)、并能避免交叉感染?；驕y(cè)序過(guò)程采用ABI3730型測(cè)序儀，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，適合推廣。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102703581SQ20121005364
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者潘加奎, 鄭俊斌 申請(qǐng)人:解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司