專利名稱：一種胸水分離肺癌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤細(xì)胞分離的方法，具體涉及一種胸水中分離純化肺癌細(xì)胞的方法，屬于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胸腔是由壁層胸膜與臟層胸膜所組成的一個封閉性腔隙，其內(nèi)為負(fù)壓，正常情況下兩層胸膜之間存在很少量(約f 30毫升)的液體所起潤滑作用，減少在呼吸活動過程中兩層胸膜之間的摩擦，利于肺在胸腔內(nèi)舒縮。這種液體從壁層胸膜產(chǎn)生，由臟層胸膜吸收，不斷循環(huán)之處于動態(tài)平衡，液體量保持恒定。當(dāng)發(fā)生某種情況影響到胸膜，無論是壁層胸膜產(chǎn)生胸水或是臟層胸膜吸收胸水的速率有變化，都可使胸腔內(nèi)液體增多，也就是所謂胸腔積水(積液)。、肺癌胸水是中晚期肺癌患者較常見的并發(fā)癥，最初可能對生活質(zhì)量影響還不大，但隨著病程進(jìn)展，會引起呼吸困難、咳嗽、胸痛等癥狀，對病人的危害甚至超過了肺癌本身。癌性胸水往往是血性的，除脫落的腫瘤細(xì)胞外內(nèi)含大量紅白細(xì)胞以及細(xì)胞碎片。腫瘤研究需要大量的臨床腫瘤組織和細(xì)胞，目前大部分研究者主要選用臨床腫瘤病人的手術(shù)標(biāo)本，雖然來源較多，標(biāo)本量大，但由于晚期肺癌的治療往往以保守治療為主，不易獲得相應(yīng)的手術(shù)標(biāo)本。晚期肺癌病人較多出現(xiàn)胸水等并發(fā)癥，抽取胸水是臨床的常規(guī)治療方法，在胸水中分離腫瘤細(xì)胞具有簡便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，同時又可以得到大量的惡性度高病程晚期的肺癌細(xì)胞。以往采用直接離心的方法雖然簡單易行，但其它細(xì)胞和組織碎片較多，腫瘤細(xì)胞的純度較低，實(shí)際應(yīng)用意義不大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種胸水分離肺癌細(xì)胞的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的諸多不足之處。本發(fā)明的原理
使用梯度離心的方法可以將不同大小、比重的細(xì)胞進(jìn)行分層和分離，我們在此方法的引導(dǎo)下，經(jīng)過反復(fù)探索和實(shí)驗(yàn)，利用腫瘤細(xì)胞比其它正常細(xì)胞體積大、比重大的特點(diǎn)，建立了一個胸水中分離肺癌細(xì)胞的方法，并用于肺癌細(xì)胞的收集、培養(yǎng)和細(xì)胞系的建立。Percoll是一種包有乙烯卩比咯燒酮的娃膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm/kg H 2
0)，粘度也很小，可形成高達(dá)I. 3g / ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時可在低離心力(200 IOOOg)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細(xì)胞無毒害，因此用于分離細(xì)胞、細(xì)菌及病毒。但未見利用相應(yīng)密度梯度的離心方法在胸水中分離肺癌細(xì)胞，同時進(jìn)行相關(guān)的原代培養(yǎng)和建系。
本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
一種胸水分離肺癌細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)不同濃度Percoll溶液的制備先用9份Percoll與I份8.5% NaCl或I. 5M PBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液稀釋到6(T70%Wt、4(T50%Wt ；
(2)胸水懸液的制備胸水樣本1500rpm離心5分鐘，棄上清，1% PBS清洗一遍，1500rpm離心5分鐘，棄上清，1%PBS重懸；此時胸水懸液中含多種細(xì)胞成分以及細(xì)胞組織碎片; (3)不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備
6(T70%Wt、4(T50%Wt、胸水懸液按照I :1 1的比例由高密度向低密度逐層配置，形成3個密度梯度；
(4)離心2800-3200rpm離心 25_40min ；
(5)取樣所要分離的細(xì)胞位于兩層界面，小心地吸取中間細(xì)胞層，1%PBS清洗I遍，1500rpm離心5min,棄上清，收獲細(xì)胞；以及
(6)細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞用10%FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)。其中，步驟(I)中所述的生理溶液為0.85% WT NaCl或0.15M PBS。所述Percoll 溶液的濃度為 60%wt、40%wt。其中，步驟(3)中每個梯度3ml，共9ml，由下至上加入IOml離心管，根據(jù)胸水懸液的多少確定多少離心管。其中，步驟(4)中所述的離心為3000rpm離心30min。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的方法具有簡單、穩(wěn)定、成本低、效果好的優(yōu)點(diǎn)。
以下結(jié)合附圖
和具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明。圖I為細(xì)胞分離后的形態(tài)圖。圖2為細(xì)胞分離后的形態(tài)圖。圖3為細(xì)胞分離后的形態(tài)圖。圖4為細(xì)胞分離后的形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)步驟
I.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備
先用9份Percoll與I份8. 5% NaCl或I. 5M PBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0. 15M PBS)稀釋到所需濃度。我們采用的是60%與40%濃度。該濃度梯度經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)簡便有效，分離效果較好。
2.胸水懸液的制備
胸水樣本1500rpm離心5分鐘,棄上清，1% PBS清洗一遍，1500rpm離心5分鐘,棄上清，1%PBS重懸；此時胸水懸液中含多種細(xì)胞成分以及細(xì)胞組織碎片。3.不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備
60%、40%、胸水懸液按照I :1 1的比例由高密度向低密度逐層配置，形成3個密度梯度。具體要求是加液時盡量輕柔緩慢，以免影響原有密度梯度。一般每個梯度3ml，共9ml，由下至上加入IOml離心管，根據(jù)胸水懸液的多少確定多少離心管。4.離心
2800-3200rpm離心25_40min，腫瘤細(xì)胞較大故離心速度較快和時間較長，通常我們選用3000rpm離心30min，由于3層之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。離心機(jī)放置的實(shí)驗(yàn)臺要穩(wěn)固，離心機(jī)最好是進(jìn)口的。5.取樣
所要分離的肺癌細(xì)胞由于體積略大比重略重位于離心管近中間界面，形成灰白色細(xì)胞層；其它細(xì)胞和碎片較小沉入管底，如果是血性胸水可見管底的紅色細(xì)胞團(tuán)。所要分離的細(xì)胞位于兩層界面，小心地吸取中間細(xì)胞層，1% PBS清洗I遍，1500rpm離心5min，棄上清，收獲管底的灰白色肺癌細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。6.細(xì)胞培養(yǎng)
由于胸水中經(jīng)過密度梯度離心后分離純化的肺癌細(xì)胞惡性度(晚期才出現(xiàn)胸水)和純度(極少有其它細(xì)胞)均比手術(shù)標(biāo)本(一般早期考慮手術(shù)治療，標(biāo)本中除腫瘤細(xì)胞外，還有較多的正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和組織碎片)要好，是細(xì)胞培養(yǎng)的良好材料。分離的原代細(xì)胞可以用10%FBS的DMEM進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)?；蛘吒鶕?jù)需要連續(xù)培養(yǎng)傳代建立相應(yīng)的肺癌細(xì)胞系。獲得的細(xì)胞用10%FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)。胸水肺癌細(xì)胞分離情況，詳細(xì)結(jié)果見表I。表1為胸水肺癌細(xì)胞分離情況
權(quán)利要求
1.一種胸水分離肺癌細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)不同濃度Percoll溶液的制備先用9份Percoll與I份8.5% NaCl或I. 5M PBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液稀釋到6(T70%Wt、4(T50%Wt ； (2)胸水懸液的制備胸水樣本1500rpm離心5分鐘，棄上清，1% PBS清洗一遍，1500rpm離心5分鐘，棄上清，1%PBS重懸；此時胸水懸液中含多種細(xì)胞成分以及細(xì)胞組織碎片; (3)不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備 6(T70%Wt、4(T50%Wt、胸水懸液按照I :1 1的比例由高密度向低密度逐層配置，形成3個密度梯度； (4)離心2800-3200rpm離心 25_40min ； (5)取樣所要分離的細(xì)胞位于兩層界面，小心地吸取中間細(xì)胞層，1%PBS清洗I遍，1500rpm離心5min,棄上清，收獲細(xì)胞；以及 (6)細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞用10%FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述的生理溶液為0.85% WTNaCl 或 0. 15M PBS。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述Percoll溶液的濃度為60%wt、40%wto
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)中每個梯度3ml，共9ml，由下至上加入IOml離心管，根據(jù)胸水懸液的多少確定多少離心管。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述的離心為3000rpm離心30mino
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胸水分離肺癌細(xì)胞的方法，包括(1)不同濃度Percoll溶液的制備、(2)胸水懸液的制備、(3)不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備、(4)離心、(5)取樣以及(6)細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明的方法具有簡單、穩(wěn)定、成本低、效果好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N5/09GK102676456SQ20121014377
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者劉蕾, 姚明, 孫磊, 李榕, 顧愛琴 申請人:上海市胸科醫(yī)院