專利名稱：靶向raf1抗乙腦病毒寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是一種靶向RAFl蛋白激酶(RAF1，c-Raf, v-raf-leukemia viral oncogene I)治療流行性乙型腦炎病毒(簡秤乙腦病毒，JEV)感染的反義寡核苷酸(ASODN,antisense oligodexynucleotide)的序列、結(jié)構(gòu)及其治療藥物。
背景技術(shù)：
乙腦病毒在分類上屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員。流行性乙型腦炎(簡稱乙腦)國際上稱為日本腦炎(Japanese encephalitis)。本病是由日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)經(jīng)蚊蟲媒介盯咬傳播而引起的一種中樞神·經(jīng)系統(tǒng)感染的急性傳染病，也是一種人獸共患的自然疫源性疾病。臨床上以高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激征為特征。病死率較高，而且后遺癥嚴(yán)重，本病對人類健康危害較大。乙腦主要在亞洲以及東南亞熱帶和亞熱帶地區(qū)的一些國家流行，我國除少數(shù)省，自治區(qū)外，大部分地區(qū)都有乙腦流行。據(jù)統(tǒng)計(jì)，乙型腦炎病毒每年至少造成至少50000例臨床病例，其中多數(shù)為十歲以下兒童，導(dǎo)致約10000人死亡，有15000人左右留有嚴(yán)重的永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷。由于乙腦是一種人畜共患的自然疫源性疾病，在一般情況下乙腦病毒在蚊-豬-蚊中循環(huán)，一旦自然條件適宜，人群免疫力下降，就有可能發(fā)生人間乙腦流行或爆發(fā)，因此必須加強(qiáng)乙腦的預(yù)防與控制。但是目前臨床上還沒有針對乙腦的特異性治療方法和特效的治療藥物，接種疫苗仍是唯一最重要的控制措施。目前用于免疫預(yù)防的滅活疫苗主要有鼠腦純化滅活疫苗和地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗，它們已廣泛使用多年，對乙腦發(fā)病率的下降起到了非常重要的，但是副反應(yīng)大，價(jià)格較高?；钜呙绾蜏p毒活疫苗的作用比滅活更有優(yōu)勢，但是國際上對該疫苗安全性和生產(chǎn)過程質(zhì)量控制方面還沒有認(rèn)可，因此其安全性等方面還需積累更多資料。因此，研究特異性高、毒副作用小的新型抗乙腦病毒感染的藥物對治療與預(yù)防病毒感染及其相關(guān)性疾病具有重要現(xiàn)實(shí)意義。病毒是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。病毒感染致病涉及病毒與機(jī)體兩個(gè)復(fù)雜生物系統(tǒng)及其二者間的相互作用。一方面，宿主表現(xiàn)出對病毒感染的主動(dòng)限制；另一方面，病毒會(huì)主動(dòng)地通過對宿主細(xì)胞的生物大分子進(jìn)行修飾，以使宿主細(xì)胞為它的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等提供必需的細(xì)胞機(jī)器。在短時(shí)間內(nèi)不影響細(xì)胞存活且能為宿主細(xì)胞所能容忍的前提下，增強(qiáng)抗病毒信號或者阻斷病毒復(fù)制所需的宿主細(xì)胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐藥毒株產(chǎn)生的頻率。經(jīng)研究已經(jīng)證明，RAFl蛋白激酶作為重要的轉(zhuǎn)錄因子參與了細(xì)胞增殖與分化、凋亡、周期調(diào)控和細(xì)胞能量代謝等多個(gè)生物過程，而且該基因的抑制物有抗腫瘤作用已經(jīng)得到廣泛的研究。根據(jù)本發(fā)明，與人RAFl基因的mRNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸能有效的抑制乙腦病毒并保護(hù)細(xì)胞使其免于乙腦病毒所致細(xì)胞病變，針對RAFl的反義寡核苷酸能特異性抑制乙腦病毒的感染復(fù)制。因此，設(shè)想其可能具有抗乙腦病毒感染的作用，從而對乙腦病毒感染相關(guān)疾病的治療起到良好的效果。有可能成為治療及預(yù)防乙腦病毒感染相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。核酸藥物是一類全新的基因靶向創(chuàng)新藥物，長期以來一直是國際研究的熱點(diǎn)，特別是近幾年小核酸的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步將核酸藥物的研究推向一個(gè)前所未有的發(fā)展高潮。反義寡核苷酸是一類經(jīng)過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15 30個(gè)核苷酸。通過堿基互補(bǔ)的原理，干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者整個(gè)基因組的復(fù)制，其優(yōu)點(diǎn)在于其理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于反義寡核苷酸作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點(diǎn)方向之一
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靶向RAFl阻斷乙腦病毒復(fù)制、抑制這些病毒致病的寡核苷酸序列、結(jié)構(gòu)及其藥物。本研究的內(nèi)容是針對RAFlmRNA (NM_002880)，利用網(wǎng)上服務(wù)器Soligo設(shè)計(jì)了 20條針對RAFl的反義寡核苷酸，從設(shè)計(jì)的這20個(gè)堿基長度的反義寡核苷酸序列中進(jìn)行初步篩選。結(jié)果顯示RAF1-19和RAFl-IO抑制病毒所致細(xì)胞病變作用最佳。在BHK21細(xì)胞系中以RAF1-19為代表進(jìn)一步評價(jià)了抑制乙腦病毒致CPE及抑制乙腦病毒復(fù)制的特異性、劑量依賴性。表I反義寡核苷酸的分子設(shè)計(jì)
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1RAFl-I反義GTCTTCC AAGCTCCCTGTAT
2RAFI-2反義GCTGATAGCCAAACTGCTGA
3RAFI-3反義AAGTCTGACATCGAAATCCA
4RAFI-4反義GTCTG AC ATCGA A ATCC ATT
5RAFI-5反義GCATCCTCAATCATCCTGCT
6RAFI-6反義AGGGCTGAAGGTGAGGCTGA
7RAFI-7反義CCACG AGGCCTAATTTTGTT
8RAFI-8反義GACATGCAGGTGTTTGTAGA
權(quán)利要求
1.與人RAFlmRNA互補(bǔ)的寡核苷酸，分布在5’非編碼區(qū)、編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)，其長度是10_30個(gè)喊基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)選自下列之一1)GTCTTC CAA GCT CCC TGTAT ；2)GCTGATAGC CAAACT GCT GA ；3)AAGTCT GAC ATC GAAATC CA ；4)GTCTGA CAT CGAAAT CCA TT ；5)GCATCC TC A ATC ATC CTG CT ；6)AGGGCT GAA GGT GAG GCT GA ；7)CCACGA GGC CTA ATT TTG TT ；8)GACATG CAG GTG TTT GTA GA ；9)CGGGCA ATG TCA ATT AGC TG ；10)TGGAAG ACA GGA TCT GGG GA ；11)CGCTGA TAG CCA AAC TGC TG ；12)GGAGAA GTC TGA ACA CTG CA ；13)CACAAG TCT GAC ATC GAA AT ；14)CAGGGT GGT GCT GAC CAT GT ；15)GCTGAA GGT GAG GCT GAT TC ；16)GGGCTG AAG GTG AGG CTG AT ；17)ACCTTT AGG ATC TTT ACT GC ；18)GCCAGG TTG TCC TTT GTC AT ；19)GGGCAA TGT CAA TTA GCT GG ；20)AAATAG TCC ATT CCC TGA GC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)選自下列之1)TGGAAG ACA GGA TCT GGG GA ；2)GGAGAA GTC TGA ACA CTG CA ；3)CAGGGT GGT GCT GAC CAT GT ；4)GGGCTG AAG GTG AGG CTG AT ；5)GGGCAA TGT CAA TTA GCT GG。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)如下1)TGGAAG ACA GGA TCT GGG GA ；2)GGGCAA TGT CAA TTA GCT GG。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的寡核苷酸，其特征是所述的寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)如下I)GGG CAA TGT CAA TTA GCT GG。
6.根據(jù)權(quán)利要5所述的寡核苷酸，其特征為所述的寡核苷酸包含了與GGGCM TGT CAATTA GCTGG具有60%及其以上連續(xù)相同序列的任何長度寡核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述寡核苷酸，其特征是該寡核苷酸經(jīng)過不同化學(xué)修飾。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述寡核苷酸，其化學(xué)修飾為硫代修飾。
9.權(quán)利要求1-8中所述的任一寡核苷酸或其組合在制備治療和預(yù)防乙腦病毒感染及其相關(guān)性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種反義寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。具體說是發(fā)現(xiàn)靶向RAF1蛋白激酶(RAF1，c-Raf，v-raf-leukemia viral oncogene 1)的反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)以及這些反義寡核苷酸在制備治療乙腦病毒感染及其相關(guān)性疾病的藥物中的用途。
文檔編號C12N15/113GK102776188SQ201210187109
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者伯曉晨, 何麗娜, 張莉, 李康, 楊靜, 王升啟, 韓明明 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所