專利名稱：TCR Vα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于血液腫瘤中抗腫瘤免疫技術領域，特別涉及一種慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)相關抗原特異性 TCR ζ 嵌合型 TCR (Τ 細胞受體,T cellreceptor)基因相關的TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重組質粒及其構建方法與應用。
背景技術：
慢性粒細胞白血病(CML)是源自造血干細胞的惡性克隆性疾病，是發(fā)病率較高血液惡性腫瘤之一，嚴重威脅了人類的健康。目前，雖然CML分子靶向治療的緩解率很高，但發(fā)生耐藥且不能治愈CML是其主要缺陷；異基因造血干細胞移植是迄今治愈CML的最有效 的方法，但是受干細胞來源及患者年齡等因素限制僅有少部分患者能進行此治療；過繼性免疫治療如DLI在治療CML移植復發(fā)方面療效顯著，使得人們對CML相關抗原特異性免疫治療寄予厚望，然而目前還沒有有效的手段分離獲得足夠數(shù)量CML相關抗原特異性CTL?；赥CR基因的免疫治療是近些年發(fā)展起來的一種腫瘤過繼性免疫治療的新技術，它是將腫瘤抗原特異性的TCR基因轉染至正常的T細胞，賦予正常的T細胞特異性識別腫瘤細胞和殺傷腫瘤細胞的功能，然后輸注給患者達到治療腫瘤的效果，該技術已經(jīng)廣泛地用于抗腫瘤的研究，它可能是最有希望治愈腫瘤的方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種TCRV a 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重組質粒。該重組質粒轉染入細胞內(nèi)，能有效改善CML患者T細胞的免疫功能，同時外源性二聚體錯配發(fā)生很少。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的TCR Va 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重組質粒的構
建方法。本發(fā)明的再一目的在于提供所述的TCR Va 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重組質粒的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種TCR Va 13: C-IRES-VP 21: ζ重組質粒，為將TCR Va 13: ζ基因和TCR νβ21: ζ基因分別構建于pIRES質粒中IRES序列兩側的多克隆位點中得到；所述的多克隆位點由多克隆位點A和多克隆位點B組成；所述的TCRVa 13: ζ基因的序列如SEQ ID NO. I所示，其含有起始密碼子和終止密碼子，可通過任意的酶切位點克隆入多克隆位點A或多克隆位點B中；優(yōu)選通過Nhe I和EcoR I酶切位點克隆入多克隆位點A中；所述的TCRV β 21: ζ基因的序列如SEQ ID NO. 2所示，其含有起始密碼子和終止密碼子，可通過任意的酶切位點克隆入多克隆位點B或多克隆位點A中；優(yōu)選通過Xba I和Sal I酶切位點克隆入多克隆位點B中；
所述的TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重組質粒的構建方法，包括如下步驟(I)TCRC基因的獲得根據(jù)TCRC基因序列設計引物，利用帶有Xho I酶切位點的上游引物 ζ F :5’-GCCTCGAGGATCCCAAACTCTGCTACC-3'和帶有 EcoR I 和 Sal I 酶切位點的下游引物CR為5’-ATGTCGACGAATTCT TAGCGAGGGGGCAGGG-3';以健康人基因組為模板，PCR擴增得到TCR ζ基因；(2)TCR ζ -IRES2-EGFP重組質粒的構建將Xho I和EcoR I雙酶切后的TCR ζ基因和Xho I和EcoR I雙酶切后的真核表達載體PIRES2-EGFP連接，得到TCR ζ -IRES2-EGFP重組質粒；(3) Va 13: ζ-IRES-EGFP 和 Vβ 21: ζ-IRES-EGFP 基因真核載體構建①擴增TCR Va 13基因的引物為帶有Nhe I酶切位點序列的上游引物aF :5’_TCGGCTAGCGGAGCAAGAAGGCAAAGCATC-3’ 和帶有 Xho I 酶切位點的下游引物 a R :5’ -CGGCTCGAGATCACAGGAACT-TTCTGGGC-3';擴增TCR νβ 21基因引物為帶有Nhe I酶切位點的上游引 物 @F:5’ -TAAGCTAGCCTCCCATCCTTCCCTGACCCT-3’ 和帶有 Xho I 酶切位點下游引物 3R:5’ -AATCTCGAGGCCACAGTCTGCTCTACCC CA-3/ ;以 CML 患者外周血單個細胞的 cDNA 為模板，PCR擴增得到TCR Va 13和TCR V β 21亞家族基因PCR產(chǎn)物，其中，TCRV a 13基因的序列如上所示，TCRV β 21基因的序列如上所示；②利用Nhe I和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切步驟①得到的TCR Va 13基因、TCRνβ 21基因以及步驟(2)得到的TCR ζ -IRES2-EGFP重組質粒；將雙酶切后的TCR Va 13基因與雙酶切后的TCR ζ -IRES2-EGFP連接，將雙酶切后的TCR νβ 21基因與雙酶切后的TCR ζ -IRES2-EGFP 連接，得到 TCR Va 13: ζ -IRES-EGFP 和 TCR V β 21: ζ -IRES-EGFP 基因真核載體；(4) TCR Va 13: ζ-IRES真核載體構建利用Nhe I和EcoR I內(nèi)切酶雙酶切TCRVa 13: ζ-IRES-EGFP和pIRES質粒，取雙酶切后的TCRV a 13: ζ基因片段與雙酶切后的PlRES 連接，得至Ij TCR Va 13: ζ-IRES 質粒；(5) TCR Va 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 真核載體構建①以步驟(3)制備的TCRVP 21: ζ -IRES-EGFP基因真核載體為模板，利用含Xba I酶切位點的上游引物 Fl :5’-TTGTCTAGACTCCCATCCTTC CCTGACCCT-3’ 和含 Sal I 和 EcoR I酶切位點的下游引物Rl :5’-ATGTC GACGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGG-3’進行PCR擴增，得到νβ21: ζ基因PCR產(chǎn)物；②利用Xba I和Sal I限制性內(nèi)切酶雙酶切V β 21: ζ基因PCR產(chǎn)物和步驟(4)制備的TCRVa 13: ζ-IRES質粒，將雙酶切后的V β 21: ζ基因PCR產(chǎn)物與TCRV a 13: ζ -IRES連接，得到TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重組質粒。所述的連接的條件優(yōu)選如下37°C、16h ；所述的PCR 的條件為98°C 3min ；98°C 10sec、55°C 15sec、72°C lmin,30 個循環(huán)；72 °C 5min ；所述的TCRV a 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重組質粒在制備特異性抗CML細胞的細胞毒T細胞中的應用。一種抗CML的細胞毒T細胞，為將所述的TCR Va 13: ζ-IRES-V β 21: ζ重組質粒轉染到T細胞制備得到。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果將本發(fā)明CML相關抗原特異性細胞毒T細胞克隆相關的TCR Va 13: ζ-IRES-Vβ 21: ζ重組質粒轉導至外周血T細胞，可獲得特異性識別CML相關抗原的大量高效細胞毒T細胞，能夠特異性地殺傷CML細胞，同時還能夠降低TCR錯配和改善T細胞免疫功能，安全性高，對CML的治療有著較好的應用前景。


圖I是pIRES質粒示意圖。圖2是TCR Va 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ真核雙表達載體示意圖。圖3是TCRVa 13: ζ-IRES-Vβ 21: ζ真核雙表達載體酶切鑒定圖，其中M 為 Ikb DNA ladder。圖4是TCR基因重組質粒轉染正常人T細胞24h流式檢測結果，其中
A為同型對照；B為PIRES質粒(陰性對照組);C為TCR Va 13: ζ -IRES-V β 21: ζ質粒(實驗組)；D為TCRVa 13-IRES-V0 21質粒(陽性對照組)。圖5是ELISP0T檢測各組細胞INF- Y分泌水平，其中A為pIRES質粒(陰性對照組)；B為TCR Va 13-IRES-V β 21質粒(陽性對照組)；C 為 TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 質粒(實驗組)；1 為 pEGFP_N3+K562 細胞；2 為HLA-A*1101+K562 細胞；3 為 HLA_A*1101+K293 細胞；4 為培養(yǎng)基(NC)。圖6為TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ -myc質粒轉染Jurkat細胞后免疫共沉淀結果，其中A 為 TCR Va 13: ζ-IRES-V β 21: ζ-myc 質粒組共沉淀；B 為 TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ -myc質粒組共沉淀后上清；C為pIRES質粒組共沉淀；D為pIRES質粒組共沉淀后上清。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例I(一)TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 重組質粒構建(I)TCRC基因的獲得根據(jù)TCRC基因序列設計引物，利用帶有Xho I酶切位點的上游引物 ζ F :5’ -GCCTCGAGGATCCCAAACTCTGCTACC-3’ 和帶有 EcoR I 和 Sal I 酶切位點的下游引物ζ R為5’ -ATGTCGACGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGG-3’。以來自健康人外周血T細胞RNA反轉錄的cDNA為模板，按PrimeSTARt5HS DNA Polymerase試劑盒(寶生物工程，大連)進行PCR反應=PCR總反應體系50 μ L，其中含SxPrimeSTAR Buffer 10 μ I、上下游引物各 O. 2 μ mol/L、dNTP MixtureO. 2mmol/L> PrimeSTAR HS DNA Polymerase25U/mL、I μ L cDNA模板，超純水補至50 μ L ;并以不加模板(超純水)設置陰性對照。反應條件980C 3min ；98°C 10sec、55°C 15sec、72°C lmin，30 個循環(huán)；72°C 5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用PCR清潔試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化，得到TCR ζ基因。(2)TCR ζ -IRES2-EGFP 重組質粒的構建將真核表達載體 pIRES2_EGFP (Clontech公司，USA)與步驟(I)制備的TCRC基因分別用Xho I和EcoR I酶切，37°C水浴3h ;酶切產(chǎn)物使用酶切產(chǎn)物純化試劑盒純化。雙酶切后PIRES2-EGFP與TCR(基因PCR產(chǎn)物進行連接反應體系為10XT4bufferl μ L、T4DNA酶I μ L、雙酶切后的pIRES2_EGFP載體2 μ L、雙酶切后的TCR ζ基因6 μ L ;混勻后置于16°C過夜；然后進行轉化①將連接產(chǎn)物(5 μ L)加入100 μ L感受態(tài)大腸桿菌TOPlO (天根，北京)中，置冰中30min 42°C熱休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入SOC培養(yǎng)基800 μ L，置干燥恒溫振蕩箱中37°C 180 200rpm振搖90min ;④菌液用玻璃推鋪于LB固體培養(yǎng)基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱過夜培養(yǎng)；挑選陽性菌落，擴增培養(yǎng)后抽提質粒DNA，用Xho I和EcoR I雙酶切鑒定，測序鑒定，證實序列正確后擴增陽性克隆并提取質粒，獲得TCR ζ -IRES2-EGFP重組質粒，_20°C凍存?zhèn)溆谩?3) Va 13: ζ -IRES-EGFP 和 νβ 21: ζ -IRES-EGFP 基因真核載體構建首先收集CML患者外周血單個核細胞，常規(guī)進行RNA提取、cDNA合成(按Invitrogen SuperScdptS III試劑盒說明書進行操作)(Invitrogen, USA),接著進行利用TCRVa和TCRVP亞家族引物進行PCR擴增，分析CML患者T細胞TCRV a和TCRVP亞家族克隆性優(yōu)勢表達情況，分別以如表I所示的29個TCRV a亞家族和24個TCRV β亞家族相應的特異性上游引物，并結合相應Ca和Ci3下游引物，分別進行Va I 29與Ca以及V β I 24與C β共53個PCR反應。PCR總反應體系20 μ L，其中含O. 5 μ mol/L任一對Va 和 νβ 引物、O. Immol/LdNTPU. 25U 丁&9聚合酶、10父？0 緩沖液、1.5臟01/1 MgC12、超純水和IyL cDNA模板，同時設置陽性和陰性對照。反應在PCR擴增儀中進行，反應條件94°C lmin(首次為 3min)、60°C lmin、72°C lmin(末次為 lOmin)，共 40 個循環(huán)，PCR 產(chǎn)物保存于4°C中。取8 μ L PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳后用Gene genius凝膠成像分析系統(tǒng)分析結果，出現(xiàn)陽性條帶者進一步以熒光素標記的Ca -Fam引物或⑶-Fam引物進行不對稱擴增(10μ L的反應體系含2· 5μ L TCR亞家族基因的PCR產(chǎn)物、O. 15ymol/L Ca-Fam引物或 CP-Fam 引物、I. 5mmol/LMgC12、0. lmmol/L dNTP、0. 75U Taq 聚合酶、10XPCR 緩沖液和超純水。PCR 反應條件-MV 3min，94°C Imin、66O Imin、72。。Imin、35 個循環(huán)，72°C 6min ；得到熒光標記的單鏈PCR產(chǎn)物，再進行基因掃描分析，將去離子甲酰胺與GeneSCan-500LIZ分子量標準品按體積比20 : I比例配好IOyL的混合液，加入2 μ L熒光素Fam標記的PCR產(chǎn)物，經(jīng)94°C變性4min，立即放置冰上冷卻2min，然后加入96孔板，直接裝載到3100DNA序 列分析儀(ABI PRISM3100-Avant GeneticAnalyzer)上進行毛細管電泳，進行基因掃描分析)，確定其T細胞克隆性(涉及相關的引物序列如表I所示)。表I相關的引物序列
權利要求
1.一種TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重組質粒，其特征在于將如SEQ ID No. I所示的TCRV a 13: ζ基因和如SEQ ID No. 2所示的TCRV β 21: ζ基因分別構建于pIRES質粒中IRES序列兩側的多克隆位點中得到TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重組質粒。
2.根據(jù)權利要求I所述的TCRVa 13: ζ -IRES-V β 21: ζ重組質粒，其特征在于所述的多克隆位點由多克隆位點A和多克隆位點B組成。
3.根據(jù)權利要求I所述的TCRVa13: (-IRES-V0 21: ζ重組質粒，其特征在于將如SEQ ID No. I所示的TCR Va 13: ζ基因構建于pIRES質粒中的多克隆位點A和將如SEQ ID No. 2所示的TCRVP 21: ζ基因構建于pIRES質粒中的多克隆位點B得到TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 重組質粒。
4.權利要求I所述的TCRVa 13: ζ-IRES-Vβ 21: ζ重組質粒的構建方法，其特征在于包括如下步驟 (1)TCRC基因的獲得根據(jù)TCRC基因序列設計引物，利用帶有XhoI酶切位點的上游引物 ζ F :5’ -GCCTCGAGGATCCCAAACTCTGCTACC-3’ 和帶有 EcoR I 和 Sal I 酶切位點的下游引物 ζ R 為5’-ATGTCGACGAATTCT TAGCGAGGGGGCAGGG-3’ ；以健康人基因組為模板，PCR擴增得到TCR ζ基因； (2)TCRζ -IRES2-EGFP重組質粒的構建將Xho I和EcoR I雙酶切后的TCR ζ基因和Xho I和EcoR I雙酶切后的真核表達載體PIRES2-EGFP連接，得到TCR ζ -IRES2-EGFP重組質粒; (3)Va 13: ζ -IRES-EGFP 和 νβ21: ζ-IRES-EGFP 基因真核載體構建 ①擴增TCRVa 13基因的引物為帶有Nhe I酶切位點序列的上游引物aF:5’_TCGGCTAGCGGAGCAAGAAGGCAAAGCATC-3’ 和帶有 Xho I 酶切位點的下游引物 a R :5’ -CGGCTCGAGATCACAGGAACT-TTCTGGGC-3’ ；擴增TCRV β 21基因引物為帶有Nhe I酶切位點的上游引物 :5’-TAAGCTAGCCTCCCATCCTTCCCTGACCCT-3’ 和帶有 Xho I 酶切位點下游引物 3R:5’ -AATCTCGAGGCCACAGTCTGCTCTACCC CA-3’ ；以 CML 患者外周血單個細胞的 cDNA 為模板，PCR擴增得到TCR Va 13和TCR V β 21亞家族基因PCR產(chǎn)物，其中，TCRV a 13基因的序列如上所示，TCRV β 21基因的序列如上所示； ②利用NheI和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切步驟①得到的TCR Val3基因、TCRνβ 21基因以及步驟(2)得到的TCR ζ -IRES2-EGFP重組質粒；將雙酶切后的TCR Va 13基因與雙酶切后的TCR ζ -IRES2-EGFP連接，將雙酶切后的TCR νβ 21基因與雙酶切后的TCR ζ -IRES2-EGFP 連接，得到 TCR Va 13: ζ -IRES-EGFP 和 TCR V β 21: ζ -IRES-EGFP 基因真核載體； (4)TCR Va 13: ζ -IRES真核載體構建利用Nhe I和EcoR I內(nèi)切酶雙酶切TCRVa 13: ζ-IRES-EGFP和pIRES質粒，取雙酶切后的TCRV a 13: ζ基因片段與雙酶切后的PIRES 連接，得到 TCR Va 13: ζ -IRES 質粒； (5)TCR Va 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 真核載體構建 ①以步驟(3)制備的TCRVii 21: ζ-IRES-EGFP基因真核載體為模板，利用含Xba I酶切位點的上游引物 Fl :5’ -TTGTCTAGACTCCCATCCTTC CCTGACCCT-3’ 和含 Sal I 和 EcoR I酶切位點的下游引物Rl :5’-ATGTC GACGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGG-3’進行PCR擴增，得到Υβ21: ζ基因PCR產(chǎn)物；②利用Xba I和Sal I限制性內(nèi)切酶雙酶切V β 21: ζ基因PCR產(chǎn)物和步驟(4)制備的TCRVa 13: ζ-IRES質粒，將雙酶切后的V β 21: ζ基因PCR產(chǎn)物與TCRV a 13: ζ-IRES連接，得至IJ TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ 重組質粒。
5.根據(jù)權利要求4所述的TCRVa 13: ζ-IRES-V β 21: ζ重組質粒的構建方法，其特征在于所述的連接的條件為37°C、16h。
6.根據(jù)權利要求4所述的TCRVa13: (-IRES-Vi3 21: ζ重組質粒的構建方法，其特征在于所述的 PCR 的條件為98°C 3min ；98°C 10sec、55°C 15sec、72°C lmin,30 個循環(huán)；72 °C 5min。
7.權利要求I 3任一項所述的TCRVa 13: ζ-IRES-V β 21: ζ重組質粒在制備特異性抗CML細胞的細胞毒T細胞中的應用。
8.一種抗CML的細胞毒T細胞，為將權利要求I 3任一項所述的TCRVa 13: ζ -IRES-Vβ 21: ζ重組質粒轉染到T細胞制備得到。
全文摘要
本發(fā)明屬于血液腫瘤中抗腫瘤免疫技術領域，特別涉及一種慢性粒細胞白血病相關抗原特異性TCRζ嵌合型TCR基因相關的TCR Vα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒及其構建方法與應用。該重組質粒是將如SEQ ID No.1所示的TCR Vα13:ζ基因和如SEQ ID No.2所示的TCRVβ21:ζ基因分別構建于pIRES質粒中IRES序列兩側的多克隆位點中得到。將該重組質粒轉導至外周血T細胞，可獲得特異性識別CML相關抗原的大量高效細胞毒T細胞，能夠特異性地殺傷CML細胞，同時還能夠降低TCR錯配和改善T細胞免疫功能，安全性高，對CML的治療有著較好的應用前景。
文檔編號C12N15/66GK102816782SQ201210214549
公開日2012年12月12日 申請日期2012年6月27日 優(yōu)先權日2012年6月27日
發(fā)明者李揚秋, 查顯豐, 陳少華, 楊力建, 吳秀麗, 李萡 申請人:暨南大學