專利名稱:桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于藥物篩選方法領(lǐng)域,涉及桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,尤其涉及應(yīng)用磁珠分離和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及核磁共振分析技術(shù)從桑葉中獲得具有α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,并在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病,其主要的干預(yù)方法是控制飲食、減少攝入性碳水化合物的含量、藥物治療等。人體攝入的碳水化合物經(jīng)過小腸上皮細胞的酶(如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)的水解作用生成葡萄糖之后,才被吸收進入血液循環(huán)。阿卡波糖等 α -葡萄糖苷酶抑制劑可以抑制α -葡萄糖苷酶,減少碳水化合物轉(zhuǎn)化成葡萄糖,是一類臨床常用的糖尿病治療藥物?,F(xiàn)有的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法主要采用體外酶活性抑制實驗,僅能對純化合物的活性進行評價,難以用于中藥等復(fù)雜混合物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選。親和選擇技術(shù)聯(lián)用質(zhì)譜分析方法可以快速分析與鑒定與特定蛋白或酶結(jié)合的配體化合物,如將特定蛋白或酶加入待篩選的樣品中使用超濾膜把蛋白結(jié)合物與未結(jié)合的化合物分離開,再進行質(zhì)譜檢測;或是把特定蛋白或酶固定在色譜固定相中,使用洗脫溶劑把化合物按照與蛋白的結(jié)合強弱依次洗脫下來,進行質(zhì)譜檢測;還可將特定蛋白或酶固定在某種合適的載體上,與配體化合物作用后,把不結(jié)合的部分洗脫掉,然后把結(jié)合配體洗脫出來,進行質(zhì)譜檢測。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種桑葉中具α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,該化合物通過以下步驟實現(xiàn)
(I)制備鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠
Ca)磁珠活化取磁珠使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入I-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液混合均勻,孵育活化30 min后移去上清液,并用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗;
(b)磁珠鍵合在活化的磁珠上,加入含α -葡萄糖苷酶的2- (N-嗎啡啉)乙磺酸溶液,震蕩混合均勻,在室溫孵育30 min進行包被,移去上清液,再用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗包被的磁珠4次,棄去清洗液,待用。(2)鍵合磁珠質(zhì)量考察將制備的鍵合磁珠分散在PBS溶液中,使用掃描式電子顯微鏡對α -葡萄糖苷酶鍵合磁珠的表面分別進行掃描成像,檢查磁珠鍵合情況,磁珠表面不粗糙、較光滑的表明鍵合情況良好。(3)篩選具α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物
(a)具潛在α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初篩取30 μ I桑葉提取物水溶液2份,分別加到Iml分散于醋酸銨溶液的鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠,放在振蕩器上混勻,孵育I h。棄去上清液,再加入Iml醋酸銨溶液清洗2次,棄去清洗液,最后使用含10%乙腈的醋酸銨溶液洗脫,吸取洗脫液備用,平行操作三份,取空白磁珠和酶鍵合磁珠的洗脫液進行液相分析及液質(zhì)鑒定,洗脫液濃縮后,用氘代二甲基亞砜(DMSO)溶解,做核磁共振氫譜分析;
(b)目標化合物獲取及活性驗證
采用常規(guī)柱色譜分離技術(shù)分離獲取目標化合物群,再采用制備液相色譜分離、純化目標化合物或購置相對應(yīng)的目標化合物;
采用酶抑制活性實驗驗證純化的目標化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,計算其半數(shù)抑制濃度。所述化合物為異槲皮素和紫云英苷。本發(fā)明的另一個目的是提供從桑葉中篩選獲得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明通過一種快速篩選桑葉中具α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的方法,提供一種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。與傳統(tǒng)方法相比,初篩無須制備分離化合物,顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時間,減少了標的化合物制備分離步驟。此外,本篩選方法具有快速、準確、重現(xiàn)性好等特點??赏茝V用于天然藥物或中藥混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速篩選。本發(fā)明方法獲得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制備抗糖尿病藥物中應(yīng)用。
圖I磁珠電鏡圖,A :空白磁珠,B: α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠。圖2桑葉磁珠結(jié)合洗脫液液相色譜圖。圖3桑葉磁珠結(jié)合洗脫液液相色譜-質(zhì)譜圖,其中圖3-1和圖3-2分別為峰8的光譜圖與質(zhì)譜圖,圖3-3和圖3-4分別為峰10的光譜圖與質(zhì)譜圖。圖4桑葉磁珠結(jié)合洗脫液核磁共振氫譜圖。
具體實施例方式下面將結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容及有益效果,該實施例僅用于說明本發(fā)明而非對本發(fā)明的限制。實施例所用儀器Finnigan LCQ Deca XPplus液質(zhì)聯(lián)用儀器(Finnigan公司);Bruker Avance III 500MHz 核磁共振儀(Bruker 公司);F200 酶標儀(Tecan 公司)
實施例I鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠制備 I.試劑及溶液配制
α_ 葡萄糖苷酶(Saccharomyces cerevisiae, simga 公司);竣基磁珠Dynabeads®MyOne Carboxylic Acid,規(guī)格10 mg/ml (invitrogen 公司);I-乙基 _3_ (3_ 二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC, sigma公司);2_(N_嗎啡啉)乙磺酸(MES, sigma公司);N_輕基琥拍酰亞胺(NHS, sigma公司)。25 mmol/L的MES溶液配制稱取MES適量,加水溶解,加lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6,制成濃度為25mmol/L的MES溶液。
50 mg/ml EDC溶液配制稱取EDC適量,快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中,制成濃度為50mg/ml的EDC溶液。臨用時新鮮配制。50 mg/ml NHS溶液配制稱取NHS適量,快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中,制成濃度為50mg/ml的NHS溶液。臨用時新鮮配制。lmg/ml α -葡萄糖苷酶溶液配制稱取α -葡萄糖苷酶lmg,快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中,制成濃度為I mg/ml的α -葡萄糖苷酶溶液。臨用時新鮮配制。2.鍵合α -葡萄糖苷酶的磁珠的制備
磁珠活化取300 “1磁珠,加入等體積25臟01/1的2-0-嗎啡啉)乙磺酸(?!16)溶液清洗兩次,每次10 min,棄去清洗液,加入50 μ I新鮮配置50 mg/ml EDC溶液和50μ I的50 mg/ml NHS溶液,混合均勻,在室溫下緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)孵育30 min。孵育后,把管子放于磁鐵上4 min,移除上清液,使用300 μ I 25 mmol/L MES溶液清洗兩次。
磁珠鍵合在活化磁珠中,加入I mg/ml α -葡萄糖苷酶溶液60 μ 1,再加入25mmol/L MES溶液40 μ 1,震蕩混合均勻,在室溫孵育30 min,或4°C緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)孵育2 h,孵育后,把管子放于磁鐵上4 min,移除上清液。加10 mmol/L PBS溶液300 μ I沖洗包被的磁珠4次,加質(zhì)量分數(shù)為O. 1-0. 5 %的牛血清白蛋白PBS溶液300 μ I,震蕩混合均勻,棄去上清液。3.鍵合磁珠質(zhì)量考察將制備的鍵合磁珠分散在10 mmol/L PBS溶液中,使用掃描式電子顯微鏡對空白磁珠、α -葡萄糖苷酶鍵合磁珠的表面分別進行掃描成像,檢查磁珠鍵合情況。見圖1,從圖I可以看出,空白磁珠(A)表面非常粗糙,α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠(B)表面比較光滑,表明α-葡萄糖苷酶已鍵合于磁珠表面。實施例2桑葉水溶性提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物篩選 I. 藥品、試劑及溶液配制;
紫云英苷和異槲皮素標準品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)。桑葉水溶性提取物將桑葉500g用8倍量50%乙醇回流提取2次,每次I h。將提取液濃縮后用石油醚脫脂,將水層用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2,用乙酸乙酯萃取,回收溶劑至干,得桑葉水溶性提取物。10 mmol/L的醋酸銨溶液配制稱取醋酸銨適量,加水溶解,制成濃度為10 mmol/L的醋酸銨溶液。α -葡萄糖苷酶鍵合磁珠溶液配制取上述用0. 5 mg空白磁珠制備的鍵合α -葡萄糖苷酶的磁珠,加入10 mmol/L的醋酸銨溶液I ml,震蕩混合均勻??瞻状胖槿芤号渲迫?0 μ I空白磁珠(含空白磁珠0.5 mg),活化后加入10mmol/L的醋酸銨溶液I ml,震蕩混合均勻。2.α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選系統(tǒng)由環(huán)形磁鐵、鍵合α -葡萄糖苷酶的磁珠、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀與核磁共振儀組成。3.桑葉水溶性提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物篩選
稱取10 mg桑葉水溶性提取物于I ml離心管中,加入Iml純水,超聲15 min, 10000rpm離心5 min,吸取上清液備用。取30 μ I上清液,分別加到I ml的α -葡萄糖苷酶鍵合磁珠和空白磁珠溶液中,放在振蕩器上混勻,孵育I h。然后放于磁鐵上,使磁珠與溶液分開,棄去溶液,在磁珠上再加入10 mmol/L醋酸銨溶液1ml,重復(fù)上述操作,洗脫2次,棄去洗脫液。最后一次清洗使用含10%乙腈的醋酸銨溶液,吸取洗脫液備用,平行操作三份。洗脫液進行液質(zhì)分析。液質(zhì)分析條件色譜柱Agilent Zorbax 38_(18柱250X4.6 mm, 5μ m,流動相為O. 05%甲酸-水A和乙腈B ;梯度洗脫程序如下0 min, 10%B ;25 min, 45%B ;35 min, 100%B ;流速0. 5 ml/min,進樣量60 μ 1,柱溫30°C,檢測器二極管陣列檢測器,波長掃描范圍19(T400 nm;檢測波長254 nm。質(zhì)譜參數(shù)離子源電噴霧(ESI)源,正負離子掃描模式,質(zhì)量掃描范圍m/z 100 - 2000,碰撞氣高純氦,霧化氣高純氮,電噴霧電壓4. 5 kV,鞘氣流速30 arb,輔助氣流速10 arb,毛細管溫度350°C ;毛細管電壓15 V。α -葡萄糖苷酶鍵合磁珠洗脫液的液相色譜圖參見圖2,其中A圖為桑葉水提物色譜圖,B圖為α -葡萄糖苷酶鍵合磁珠的洗脫液色譜圖,酶鍵合磁珠的洗脫液有兩個明顯的色譜峰。經(jīng)紫外光譜和質(zhì)譜鑒定推測色譜峰8 (Μ8)為異槲皮素,色譜峰10 (MlO)為紫云英苷。(參見圖3,其中圖3-1和圖3-2分別為峰8的光譜圖與質(zhì)譜圖,圖3-3和圖3_4分別為峰10的光譜圖與質(zhì)譜圖)。將α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠的洗脫液及空白磁珠的洗脫液濃縮至干,用氘代DMSO溶解,另取異槲皮素和紫云英苷標準品用氘代DMSO溶解,測鍵合磁珠的洗脫液、空白磁珠的洗脫液及標準品核磁共振氫譜。核磁共振氫譜參數(shù)脈沖序列zg30,譜寬10330. 57Hz,掃描次數(shù)32 (參見圖4,圖中可以看出桑葉磁珠洗脫液及兩個標準品的 核磁共振圖譜(1H譜)。α -葡萄糖苷酶鍵合磁珠洗脫液的氫譜中有異槲皮素和紫云英苷兩個化合物的氫信號。進一步驗證桑葉酶鍵合磁珠洗脫液中含有異槲皮素和紫云英苷,空白磁珠洗脫液中無異槲皮素、紫云英苷。再通過與購置的異槲皮素和紫云英苷標準品比較,最終鑒定為Μ8為異槲皮素,MlO為紫云英苷。說明桑葉水提物中異槲皮素和紫云英苷對α-葡萄糖苷酶有潛在抑制活性。4.異槲皮素、紫云英苷α-葡萄糖苷酶抑制活性驗證
取異槲皮素、紫云英苷標準品配制成濃度為O. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、20 mmol/L的待測品溶液,各取20 μ I加入20 μ I濃度為O. I U/ml的α -葡萄糖苷酶溶液,置于在96孔板中,在37°C震蕩混勻孵育10 min后,加5 mmol/L對硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷溶液20μ 1,在37 °C震蕩混勻孵育30 min后,再加入0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液80 μ I停止反應(yīng),在37°C震蕩10 min,于405 nm波長處測定吸收值,計算α -葡萄糖苷酶抑制抑制活性。測試結(jié)果表明,異槲皮素、紫云英苷均具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中異槲皮素的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)為462. I μ mol/L,紫云英苷的半數(shù)抑制濃度(IC5tl)為662.9 μmol/L。
權(quán)利要求
1.一種桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,其特征在于,通過以下步驟實現(xiàn) (1)制備鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠 Ca)磁珠活化取磁珠使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入I-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液和N-羥基琥珀酰亞胺溶液混合均勻,孵育活化30 min后移去上清液,并用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液清洗; (b)磁珠鍵合在活化的磁珠上,加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸溶液,震蕩混合均勻在室溫孵育30 min進行包被,移去上清液,再用磷酸鹽緩沖液清洗包被的磁珠,棄去清洗液,待用; (2)鍵合磁珠質(zhì)量考察將制備的鍵合磁珠分散在磷酸鹽緩沖液中,使用掃描式電子顯微鏡對α -葡萄糖苷酶鍵合磁珠的表面分別進行掃描成像,檢查磁珠鍵合情況,磁珠表面不粗糙、較光滑的表明鍵合情況良好; (3)篩選具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物 (a)具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初篩取30 μ I桑葉提取物水溶液2份,分別加到已分散在醋酸胺溶液的鍵合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠中,放在振蕩器上混勻,孵育I h,棄去上清液,再加入醋酸胺溶液清洗,棄去清洗液,最后使用含10%乙腈的醋酸胺溶液洗脫,取空白磁珠和酶鍵合磁珠的洗脫液進行液相分析及液質(zhì)鑒定,洗脫液濃縮后,用氘代二甲基亞砜溶解,做核磁共振氫譜分析; (b)目標化合物獲取及活性驗證采用常規(guī)柱色譜分離技術(shù)分離獲取目標化合物群,再采用制備液相色譜分離、純化目標化合物或購置相對應(yīng)的目標化合物;采用酶抑制活性實驗驗證純化的目標化合物是否具有α -葡萄糖苷酶抑制活性,計算其半數(shù)抑制濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,其特征在于,所述具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物為異槲皮素和紫云英苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制備抗糖尿病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種桑葉中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,通過磁珠分離和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及核磁共振分析方法從桑葉中初步篩選,再制備分離或購置目標化合物,進行α-葡萄糖苷酶抑制活性驗證,從而獲取具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。與傳統(tǒng)方法相比,本發(fā)明方法初篩無須制備分離化合物,顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時間,減少了標的化合物制備分離步驟。此外,本發(fā)明篩選方法具有快速、準確、重現(xiàn)性好等特點??赏茝V用于天然藥物或中藥混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速篩選。本發(fā)明方法獲得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制備抗糖尿病藥物中應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/34GK102816832SQ20121030483
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月25日
發(fā)明者程翼宇, 王毅 申請人:浙江大學