專利名稱：一種雜交和牛的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種雜交和牛的培育方法。
背景技術(shù)：
日本和牛是日本神戶通過(guò)幾個(gè)世紀(jì)與外界隔絕，長(zhǎng)期培育的肉牛品種。日本和牛是世界上公認(rèn)的優(yōu)秀肉牛品種，利用該品種所生產(chǎn)的牛肉品質(zhì)也是獨(dú)一無(wú)二的，其特點(diǎn)為:質(zhì)地柔軟、細(xì)嫩多汁，具有濃厚的牛肉風(fēng)味，牛肉外觀表現(xiàn)出具有極強(qiáng)的大理石花紋，呈多星狀像雪花一樣均勻有致的分布在牛肉中，鮮嫩可口，富含鐵和不飽和脂肪酸，可顯著改善精力和耐力，并可延緩機(jī)體衰老。稱得上是牛肉產(chǎn)品中的極品。日本政府已經(jīng)將日本和牛被視為國(guó)寶級(jí)的牛，日本政府于上世紀(jì)九十年代頒布禁令“禁止和牛及其遺傳物質(zhì)的出口”，其中包括日本和?；钆！⒕?、胚胎，使日本和牛作為世界最好遺傳肉牛品系在日本以外國(guó)家的發(fā)展得到限制。追溯北美地區(qū)創(chuàng)建純系日本和牛歷史知道，1976年由于當(dāng)時(shí)日本政府與美國(guó)政府雙邊協(xié)議規(guī)定，日本政府以農(nóng)業(yè)技術(shù)交流與科學(xué)發(fā)展研究為目的同意4頭日本和牛的公牛進(jìn)口到美國(guó)；到在上世紀(jì)90年代又分別兩次引進(jìn)了 200多頭公牛和母牛。由于日本政府采取嚴(yán)禁日本和牛遺傳物質(zhì)出口，由于在上世紀(jì)日本和牛的這兩次引進(jìn)，讓美國(guó)和加拿大抓住機(jī)遇，繁衍出純?nèi)毡竞团Ｆ废?，成為除日本外，真正擁有日本和牛品系的?guó)家。美國(guó)和加拿大政府和相關(guān)組 織非常重視日本和牛的發(fā)展，制定出周密的日本和牛追蹤和評(píng)定方法。目前這些純系和牛的后代分布在美加為數(shù)不多的地區(qū)和農(nóng)場(chǎng)，有著完整的系譜并可進(jìn)行DNA親子鑒定的跟蹤。如今在北美日本和牛的基因相似純度達(dá)到99.9%以上，已經(jīng)真正擁有除日本以外，擁有日本和牛品系的國(guó)家。然而，日本和牛雖然是世界上公認(rèn)最好的肉牛之一，但是由于其體型小，出肉率低，后期育肥成本高等因素。除日本以外，日本和牛始終被排擠在主流世界肉牛行業(yè)之外。為了利用美國(guó)和加拿大的日本和牛資源，并且可以解決小型日本和牛的產(chǎn)肉量低和飼養(yǎng)成本高問(wèn)題，又能確保日本和牛最顯著的富含大理石花紋肉質(zhì)特性。通過(guò)分析美國(guó)加拿大盛產(chǎn)的各種牛品種，其中包括安格斯、海福特、夏洛萊、利木贊、西門塔爾和荷斯坦的肉質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，雖然荷斯坦牛肉質(zhì)等級(jí)低，但卻富含大理石花紋，是僅次日本和牛的牛品系。荷斯坦奶牛在美國(guó)和加拿大種群非常豐富，由于其產(chǎn)奶量高、牛奶品質(zhì)高等特點(diǎn)，是世界行業(yè)公認(rèn)具有世界最佳產(chǎn)奶基因種群。體外受精技術(shù)的開發(fā)與研究始于六十年代，在七十年代就有研究成果，在八十年代初體外胚胎研究從理論上、方法上得以充分的完善和迅速發(fā)展，成為動(dòng)物胚胎工程及細(xì)胞工程領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)基本和重要的研究分支。1982年美國(guó)科學(xué)家(Bracket等人)率先培育出世界第一胎體外受精牛犢，使家畜體外受精技術(shù)的研究取得了重大突破。日本科學(xué)家花田章等人(1985年)從屠宰母牛卵巢的卵母細(xì)胞，經(jīng)人工成熟培養(yǎng)，體外受精及細(xì)胞培養(yǎng)成胚胎后移植于受體牛，在日本國(guó)家畜牧研究所成功地產(chǎn)下試管牛犢，真正開創(chuàng)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)運(yùn)用的先河。
以胚胎移植進(jìn)行畜牧產(chǎn)品品種改良，是1964年世界首例牛非手術(shù)胚胎移植在日本國(guó)家畜牧研究所獲得成功和1974年英國(guó)科學(xué)家發(fā)明了胚胎冷凍方法之后，胚胎移植作為種畜品種改良和優(yōu)良遺傳傳代手段才開始盛行于發(fā)達(dá)國(guó)家。關(guān)于胚胎玻璃化冷凍技術(shù)，1986年SchefTen等首先報(bào)道了利用25%甘油+25%1，2 —丙二醇玻璃化超快速冷凍牛?？芭咭荒遗咂谂咛?。解凍后一步法脫除冷凍保護(hù)劑，獲得了 53%的移植妊娠率，降低了玻璃化溶液的毒性。利用玻璃化方法冷凍體外胚胎具有操作簡(jiǎn)單、成本低、胚胎解凍后孵化率高等優(yōu)點(diǎn)，而缺點(diǎn)是要求操作者具有能夠掌握該方法的技巧本領(lǐng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雜交和牛的培育方法。本發(fā)明是以加拿大荷斯坦奶牛為母系，利用加拿大屠宰場(chǎng)荷斯坦奶牛卵巢資源而抽取得到卵母細(xì)胞，以具有99.9%日本和牛遺傳性狀的種公牛為父系，獲取父系精液，通過(guò)體外胚胎培養(yǎng)方法培育出具有日本和牛與荷斯坦奶牛遺傳特性的雜交后代肉牛品系。本發(fā)明的日本和牛精液購(gòu)自加拿大BC省本那比市精精遺傳公司(Jingjing Genetic Inc.；Burnaby, BC, Canada)。本發(fā)明提供的雜交和牛的培育方法包括雜交和牛胚胎的體外培養(yǎng)和胚胎移植入受體牛子宮內(nèi)繁育兩個(gè)步驟。其中，雜交和牛胚胎體外培養(yǎng)方法包括如下步驟:
I)以具有99.9%日本和牛遺傳性狀的公牛為父系，荷斯坦奶牛為母系，分別提取父系的精液和母系的卵母細(xì)胞；2)在卵母細(xì)胞成熟液中培育卵母細(xì)胞；3)將成熟的卵母細(xì)胞在體外受精培養(yǎng)液中進(jìn)行受精；4)將受精卵在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。本發(fā)明雜交和牛胚胎體外培養(yǎng)方法還包括步驟5)體外胚胎的玻璃化冷凍。該培養(yǎng)方法中步驟2)優(yōu)選將清洗干凈的卵母細(xì)胞以100枚/管移入裝有2mL卵母細(xì)胞成熟液的錐形管中進(jìn)行培養(yǎng)。該培養(yǎng)方法中所述步驟2)的卵母細(xì)胞成熟液的配制方法為:a)配制培養(yǎng)母液:氯化鈉5_7g，氯化鉀0.4-0.6g，磷酸二氫鉀0.1-0.3g，氯化鎂
0.08-0.14g,乳酸鈉 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氫鈉 l_4g,丙酮酸鈉 0.01-0.06g,氯化鈣0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為6.8，滅菌過(guò)濾得到
培養(yǎng)母液；b)卵母細(xì)胞成熟液:培養(yǎng)母液中分別加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸20_40mL，促卵泡素0.1-0.3mL，小牛血清白蛋白5-15g，酚紅0.01-0.02g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養(yǎng)母液至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為7.2。該培養(yǎng)方法中所述步驟2)的培養(yǎng)條件為5%C02，38.5_39°C，培養(yǎng)22_24h。該培養(yǎng)方法中所述步驟3)的體外受精包括:a)將精子數(shù)量約2000萬(wàn)個(gè)的精液放入加有3mL體外受精培養(yǎng)液的離心管中，用離心機(jī)1500g轉(zhuǎn)速離心，用400mL體外受精培養(yǎng)液稀釋離心得到的精子；若為冷凍精液，操作方法為從液氮中取出一支冷凍精液細(xì)管(0.22cc，其中精子數(shù)量約2000萬(wàn)個(gè))在30°C水浴中解凍10秒后，用消毒剪刀剪開后，將細(xì)管中的精液放入加有3mL體外受精培養(yǎng)液的離心管中，用離心機(jī)1500g轉(zhuǎn)速離心，用400mL體外受精培養(yǎng)液稀釋離心得到的精子；b)將成熟的卵母細(xì)胞以100枚/孔移入含體外受精培養(yǎng)液的受精盤中，加入稀釋后的精子液，使每孔精子密度為1-2 X IO6個(gè)/mL。該培養(yǎng)方法中所述步驟3)的體外受精培養(yǎng)液的配制方法為:a)配制培養(yǎng)母液:氯化鈉5_7g，氯化鉀0.4-0.6g，磷酸二氫鉀0.1-0.3g，氯化鎂0.08-0.14g,乳酸鈉 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氫鈉 l_4g,丙酮酸鈉 0.01-0.06g,氯化鈣0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為6.8，滅菌過(guò)濾得到培養(yǎng)母液；b)體外受精培養(yǎng)液:培養(yǎng)母液中加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸40_60mL，肝素0.4-0.8mL，果糖0.8-1.5g，乳酸5_15mL，小牛血清白蛋白5_8g，酚紅0.01-0.02g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養(yǎng)母液至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為7.2。該培養(yǎng)方法中所述步驟3)的培養(yǎng)條件為5%C02，38.5_39°C，培養(yǎng)20_22h。該培養(yǎng)方法中所述步驟4)的胚胎培養(yǎng)液的配制方法為:a)配制培養(yǎng)母液:氯化鈉5_7g，氯化鉀0.4-0.6g，磷酸二氫鉀0.1-0.3g，氯化鎂0.08-0.14g,乳酸鈉 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氫鈉 l_4g,丙酮酸鈉 0.01-0.06g,氯化鈣0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為6.8，滅菌過(guò)濾得到
培養(yǎng)母液；b)胚胎培養(yǎng)液:培養(yǎng)母液中分別加入非必需氨基酸10_15g,必需氨基酸15_25g,胎牛血清白蛋白50-70g，肌醇0.2-0.4g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養(yǎng)母液至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為7.2。該培養(yǎng)方法中所述步驟4的培養(yǎng)條件為5%C02，38.5-39.2 V，從卵母細(xì)胞受精到囊胚胚胎形成的培養(yǎng)時(shí)間為168-200h (受精后的第7和8天)。上述步驟5)所述的胚胎平衡液配方為:a)胚胎平衡液:小牛血清白蛋白10_12g，乙二醇180_220mL，青霉素60-80IU，鏈霉素60-80IU，加磷酸鹽緩沖液調(diào)至IOOOmL ；b)胚胎玻璃化液:小牛血清白蛋白10-12g，乙二醇300-400mL，聚蔗糖200_250g，蔗糖0.2-0.3mol/L，青霉素60-80IU，鏈霉素60-80IU，加磷酸鹽緩沖液調(diào)至IOOOmL ；c)胚胎玻璃化冷凍液:按照體積比60%胚胎平衡液+40%胚胎玻璃化液，混勻配置rfu 。該步驟5)的胚胎玻璃化冷凍方法具體為，取四孔盤，在每一孔中加入不等量的胚胎平衡液和胚胎玻璃化液，配置成有不同滲透性的溶液，39°C預(yù)熱lOmin，將囊胚胚胎分別放入各孔溶液中進(jìn)行平衡，平衡時(shí)間1-2分鐘，取玻璃管(直徑0.5mm),利用其虹吸將胚胎吸入管內(nèi)，每支玻璃管中的裝載胚胎數(shù)量不超過(guò)10枚，玻璃管內(nèi)冷凍液的高度應(yīng)控制在2-3mm，然后將由胚胎一端的玻璃管在液氮表面熏約3秒鐘，待玻管內(nèi)冷凍液凍住后再將整個(gè)玻璃管投入液氮中保存直至 使用。本發(fā)明還提供了一種雜交和牛的培育方法，采取子宮雙側(cè)內(nèi)壁胚胎移植法，將上述雜交和牛胚胎體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到雜交和牛胚胎移植入受體牛子宮內(nèi)，繁育得到的新生牛即為雜父和牛。上述雜交和牛的培育方法還包括胚胎移植前解凍玻璃化冷凍胚胎，解凍方法為:分別將胚胎玻璃化解凍液和胚胎解凍平衡液在39°C預(yù)熱lOmin，取出玻璃化冷凍胚胎保存玻管，在空氣中停留3秒后將凍有體外胚胎的一端浸入玻璃化解凍液中，使管內(nèi)液體連同胚胎一起排出到解凍液中；將胚胎移入新的胚胎玻璃化解凍液中平衡5min，再移入胚胎解凍平衡液中平衡5min取出，移入已經(jīng)平衡好的胚胎培養(yǎng)液中直至使用；其中胚胎玻璃化解凍液配方為:小牛血清白蛋白8-10g，乙二醇300_350mL，聚蔗糖150-200g，蔗糖0.4-0.5mol/L,青霉素60-80IU，鏈霉素60-80IU，加磷酸鹽緩沖液調(diào)至10OOmT,； 胚胎解凍平衡液配方為:小牛血清白蛋白8_12g，乙二醇180_220mL，蔗糖
0.07-0.lmol/L，青霉素60-80IU，鏈霉素60-80IU，加磷酸鹽緩沖液調(diào)至lOOOmL。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中選用中國(guó)黃牛雜交牛作為受體牛，采取受體牛子宮雙側(cè)內(nèi)壁胚胎移植方法，培育出雜交和牛新品系。要求作為受體牛的中國(guó)黃牛雜交牛是健康無(wú)生殖疾病、營(yíng)養(yǎng)均衡、體況適中，18-24月齡，體重450kg以上的母牛。受體牛的發(fā)情為誘導(dǎo)同步發(fā)情方法，其具體方案為:第0天放陰道栓+2毫升R551 (雌二醇:促黃體生成素=1:1，體積比)，第5天打PG 0.4毫克，第7天取栓，第8天打I毫升R550 (雌二醇:孕酮=1:2，體積比)；在陰道栓同步發(fā)情方案實(shí)施后的第9天應(yīng)采取不間斷的受體牛發(fā)情觀察。受體牛胚胎移植時(shí)間是受體牛發(fā)情特征明顯，如有爬跨；牛卵巢上的黃體達(dá)到
`1.5厘米以上，尚未排卵。胚胎解凍方法為:取一四孔培養(yǎng)盤，加入胚胎培養(yǎng)液，放在5%C02，38.8-39.2°C培養(yǎng)箱中備用。取6厘米直徑的培養(yǎng)盤，分別加入胚胎玻璃化解凍液和胚胎解凍平衡液(表10和表11)，39°C預(yù)熱lOmin。將胚胎玻璃化解凍液盤放在實(shí)體顯微鏡下對(duì)好焦，從液氮罐中取出一支玻璃化冷凍胚胎的保存管，用拇指和食指夾住玻管，約在空氣中停留3秒后，將凍有體外胚胎的一端浸入玻璃化解凍液盤中，當(dāng)看到微玻管內(nèi)結(jié)晶解凍，玻管內(nèi)液面上升時(shí)立刻用食指封住玻管的上口，使管內(nèi)液體連同胚胎一起排出到解凍液中。立刻將胚胎移入新的胚胎玻璃化解凍液中平衡5分鐘后取出，再移入胚胎解凍平衡液盤中平衡5分鐘取出，移入已經(jīng)平衡好的胚胎培養(yǎng)液盤中直至使用。受體牛子宮雙側(cè)內(nèi)壁胚胎移植方法是，將解凍好的玻璃化冷凍胚胎放入胚胎移植槍中，將胚胎放入確定已經(jīng)發(fā)情的受體牛子宮雙側(cè)內(nèi)壁，最終培育出雜交和牛新品系。本發(fā)明對(duì)體外胚胎實(shí)施玻璃化冷凍方法，本發(fā)明中，“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降溫達(dá)到或低于-100°c -110°c的溫度范圍時(shí)，形成一種高黏度的介于液態(tài)和固態(tài)之間、非晶體的、透明的玻璃態(tài)。玻璃化冷凍法是根據(jù)物理學(xué)原理，將高濃度的低溫保護(hù)劑在超低溫環(huán)境下凝固，形成無(wú)規(guī)則的玻璃化固體，這種固態(tài)物質(zhì)能保持液態(tài)時(shí)的正常分子與離子分布，因而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生玻璃化起到保護(hù)作用。這種方法不僅大大簡(jiǎn)化了冷凍過(guò)程，而且減少了由于細(xì)胞冰晶形成所引起的一系列物理及化學(xué)損傷。細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)完全停止，從而能夠達(dá)到長(zhǎng)久保存的目的。本發(fā)明方法培育的雜交和牛品系的牛肉富含大理石花紋且質(zhì)地柔軟、鮮嫩可口，大大提高荷斯坦奶牛的肉質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，從原來(lái)的C級(jí)牛肉上升至B4級(jí)水平，增加了荷斯坦雜交牛的肉用生產(chǎn)效益。在本發(fā)明提供的培育方法中，卵母細(xì)胞成熟錐形管培養(yǎng)技術(shù)及其培養(yǎng)液，使卵母細(xì)胞的成熟率達(dá)99%以上；本發(fā)明提供的體外受精培養(yǎng)液能大幅度提高成熟卵母細(xì)胞的體外受精，使規(guī)?；w外受精的卵母細(xì)胞卵裂率高達(dá)86%以上；使用發(fā)明的受精卵體外培養(yǎng)方法和胚胎培養(yǎng)液，通過(guò)提高受精卵細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)展各階段的活力和健康性，使A和B級(jí)胚胎的規(guī)?；雠呗侍岣咧?6%以上；本發(fā)明提供的體外愛德和牛胚胎的玻璃化冷凍技術(shù)，比常規(guī)冷凍方法使體外胚胎的存活及孵化率提高20%，孵化率達(dá)到96%以上。本發(fā)明已經(jīng)達(dá)到具備產(chǎn)業(yè)化實(shí)際運(yùn)用之意義。本發(fā)明中采取對(duì)受體牛的選擇和發(fā)情要求，以及受體牛子宮雙側(cè)內(nèi)壁體外胚胎移植，使體外胚胎的懷孕率達(dá)到54%，而產(chǎn)犢率達(dá)到48%，其中雙胎率占產(chǎn)犢率的25%。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，實(shí)施例中所用生化試劑均為市售。實(shí)施例1卵母細(xì)胞的獲取與成熟培養(yǎng)從加拿大屠宰場(chǎng)收集加拿大荷斯坦奶牛卵巢，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室處理后抽取得到的卵母細(xì)胞。其操作規(guī)程如下:(a)采集及裝運(yùn)卵巢的器械必須預(yù)先清洗干凈；(b)預(yù)先準(zhǔn)備經(jīng)高壓無(wú)菌后的生理鹽水，使 用前加入1%抗菌素，并保溫在28°C的水浴箱中直至使用；(c)采集沒有明顯病變和沒經(jīng)糞便污染的母牛卵巢，卵巢放入預(yù)先裝好的生理鹽水的保溫瓶中；Cd)從卵巢采集離體至被利用的時(shí)間不超過(guò)10小時(shí)。卵母細(xì)胞的抽取操作程序是:(a)將卵巢轉(zhuǎn)換到廣口保溫瓶中，倒入約30°C加有1%抗菌素生理鹽水至浸沒卵巢，清洗好卵巢后用；(b)10mL注射器套上18G注射針頭，吸取少量601液(配方見表I，本實(shí)施例采用的具體配方為:氯化鈉6g，氯化鉀0.5g，磷酸二氫鉀
0.2g,氯化鎂0.1g,乳酸鈉0.5mL,葡萄糖0.3g,碳酸氫鈉2g,丙酮酸鈉0.03g,氯化I丐0.3g,谷氨酰胺0.15g，加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為6.8，滅菌過(guò)濾得到)潤(rùn)滑針，然后在距離卵泡約3mm位置插入針頭，逐個(gè)抽取卵巢表面直徑2飛毫米的卵泡中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs) ; (c)將抽出的卵泡液注射到60_培養(yǎng)皿中，用顯微鏡鏡檢挑取卵母細(xì)胞。在抽取卵母細(xì)胞前2小時(shí)將卵母細(xì)胞成熟液(本發(fā)明中簡(jiǎn)稱為602液，配方見表2，本實(shí)施例中采用的具體配方為:在800mL的培養(yǎng)母液中分別加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸30mL，促卵泡素0.2mL，小牛血清白蛋白10g，酚紅0.0lg，青霉素50IU，鏈霉素50IU，混勻后再加培養(yǎng)母液至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為7.2)，放入CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱平衡。檢卵前在卵母細(xì)胞成熟母液中加入1%抗菌素，混勻后取2毫升上述卵母細(xì)胞成熟液放入15毫升錐形管中，然后放回CO2培養(yǎng)箱待用。將在顯微鏡下找到的符合要求的100個(gè)卵母細(xì)胞為一組，放入加有602成熟液的60mm培養(yǎng)皿中清洗，然后將清洗過(guò)的100個(gè)卵母細(xì)胞移入裝有2毫升上述602成熟液的15毫升錐形管中，放入5%C02培養(yǎng)箱進(jìn)行成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5°C、5%二氧化碳的空氣、培養(yǎng)時(shí)間為23小時(shí)。602卵母細(xì)胞成熟液的配置是在601培養(yǎng)母液(配方見表I)基礎(chǔ)上進(jìn)行配制，經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾后放在4°C中保存，備用。本發(fā)明利用錐形管使卵母細(xì)胞自然緊密集聚，因?yàn)槁亚鸺?xì)胞的緊密有助于卵母細(xì)胞的體外成熟和體外受精。而在促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的602成熟液中成分使卵母細(xì)胞處在更為接近動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境條件，促性腺激素有利于改變卵丘細(xì)胞的代謝機(jī)能，并阻斷由卵丘細(xì)胞通過(guò)胞間連接向卵子分泌減數(shù)分裂抑制因子的途徑，從而使卵母細(xì)胞恢復(fù)成熟分裂過(guò)程，大大提高卵母細(xì)胞的成熟率。本實(shí)例培養(yǎng)結(jié)果顯示，采用本發(fā)明的方法可使其卵母細(xì)胞成熟率到達(dá)98%，這一結(jié)果比普通方法的卵母細(xì)胞成熟率高出10%。表I培養(yǎng)母液(601)的配方(pH6.8)
權(quán)利要求
1.一種雜交和牛胚胎體外培養(yǎng)方法，包括如下步驟: 1)以具有99.9%日本和牛遺傳性狀的公牛為父系，荷斯坦奶牛為母系，分別提取父系的精液和母系的卵母細(xì)胞； 2)在卵母細(xì)胞成熟液中培育卵母細(xì)胞； 3)將成熟的卵母細(xì)胞在體外受精培養(yǎng)液中進(jìn)行受精； 4)將受精卵在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟5)體外胚胎的玻璃化冷凍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)是將清洗干凈的卵母細(xì)胞以100枚/管移入裝有2mL卵母細(xì)胞成熟液的錐形管中進(jìn)行培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)的卵母細(xì)胞成熟液的配制方法為: a)配制培養(yǎng)母液:氯化鈉5-7g，氯化鉀0.4-0.6g，磷酸二氫鉀0.1-0.3g，氯化鎂0.08-0.14g,乳酸鈉 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氫鈉 l_4g,丙酮酸鈉 0.01-0.06g,氯化鈣0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為6.8，滅菌過(guò)濾得到培養(yǎng)母液； b)卵母細(xì)胞成熟液:培養(yǎng)母液中分別加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸20-40mL，促卵泡素0.1-0.3mL，小牛血清白蛋白5-15g，酚紅0.01-0.02g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養(yǎng)母液至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為7.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)的培養(yǎng)條件為5%C02，38.5-39 °C，培養(yǎng) 22-24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)的體外受精包括: a)將精子數(shù)量約2000萬(wàn)個(gè)的精液放入加有3mL體外受精培養(yǎng)液的離心管中，用離心機(jī)1500g轉(zhuǎn)速離心，用400mL體外受精培養(yǎng)液稀釋離心得到的精子； b)將成熟的卵母細(xì)胞以100枚/孔移入含體外受精培養(yǎng)液的受精盤中，加入稀釋后的精子液，使每孔精子密度為1-2 X IO6個(gè)/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)的體外受精培養(yǎng)液的配制方法為: a)配制培養(yǎng)母液:氯化鈉5-7g，氯化鉀0.4-0.6g，磷酸二氫鉀0.1-0.3g，氯化鎂0.08-0.14g,乳酸鈉 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氫鈉 l_4g,丙酮酸鈉 0.01-0.06g,氯化鈣0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為6.8，滅菌過(guò)濾得到培養(yǎng)母液； b)體外受精培養(yǎng)液:培養(yǎng)母液中分別加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸40-60mL，肝素0.4-0.8mL，果糖0.8-1.5g，乳酸5_15mL，小牛血清白蛋白5_8g，酚紅0.01-0.02g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養(yǎng)母液至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為7.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)的培養(yǎng)條件為5%C02，38.5-39 °C，培養(yǎng) 20-22h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)的胚胎培養(yǎng)液的配制方法為: a)配制培養(yǎng)母液:氯化鈉5-7g，氯化鉀0.4-0.6g，磷酸二氫鉀0.1-0.3g，氯化鎂.0.08-0.14g,乳酸鈉 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氫鈉 l_4g,丙酮酸鈉 0.01-0.06g,氯化鈣0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為6.8，滅菌過(guò)濾得到培養(yǎng)母液； b)胚胎培養(yǎng)液:培養(yǎng)母液中分別加入非必需氨基酸10-15g，必需氨基酸15-25g，胎牛血清白蛋白50-70g，肌醇0.2-0.4g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養(yǎng)母液至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH值為7.2。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)的培養(yǎng)條件為5%C02，38.8-39.2°C，從卵母細(xì)胞受精到囊胚胚胎形成培養(yǎng)時(shí)間為168-200h。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟5)的胚胎玻璃化冷凍方法為: a)胚胎平衡液:小牛血清白蛋白10-12g，乙二醇180-220mL，青霉素60-80IU，鏈霉素60-80IU，加磷酸鹽緩沖液調(diào)至IOOOmL ； b)胚胎玻璃化液:小牛血清白蛋白10-12g，乙二醇300-400mL，聚蔗糖200_250g，蔗糖0.2-0.3mol/L，青霉素60-80IU，鏈霉素60-80IU，加磷酸鹽緩沖液調(diào)至IOOOmL ； c)胚胎玻璃化冷凍液:按照體積比60%胚胎平衡液+40%胚胎玻璃化液，混勻配置而成。
12.—種雜交和牛的培育方法,其特征在于,應(yīng)用權(quán)利要求1-11任一所述的方法體外培養(yǎng)雜交和牛胚胎后，采取子宮雙側(cè)內(nèi)壁胚胎移植法將胚胎移植入受體牛子宮內(nèi)，繁育得到的新生牛即為雜交和牛。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，還包括胚胎移植前解凍玻璃化冷凍胚胎，解凍方法為:分別將胚胎玻璃化解凍液和胚胎解凍平衡液在39°C預(yù)熱lOmin，取出玻璃化冷凍胚胎保存玻管，在空氣中停留3秒后將凍有體外胚胎的一端浸入玻璃化解凍液中，使管內(nèi)液體連同胚胎一起排出到解凍液中；將胚胎移入新的胚胎玻璃化解凍液中平衡5min，再移入胚胎解凍平衡液中平衡5min取出，移入已經(jīng)平衡好的胚胎培養(yǎng)液中直至使用； 所述胚胎玻璃化解凍液配方為:小牛血清白蛋白8-10g，乙二醇300-350mL，聚蔗糖150-200g,蔗糖0.4-0.5mol/L,青霉素60-80IU，鏈霉素60-80IU，加磷酸緩沖液調(diào)至.10OOmT,； 所述胚胎解凍平衡液配方為:小牛血清白蛋白8-12g，乙二醇180-220mL，蔗糖.0.07-0.lmol/L，青霉素60-80IU，鏈霉素60-80IU，加磷酸緩沖液調(diào)至IOOOmL ； 所述胚胎培養(yǎng)液IL配方為:培養(yǎng)母液中分別加入非必需氨基酸10-15g，必需氨基酸.15-25g，胎牛血清白蛋白50-70g，肌醇 0.2 -0.4g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養(yǎng)母液至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH值為7.2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雜交和牛的培育方法，包括雜交和牛胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植入受體牛子宮內(nèi)繁育，其中胚胎體外培養(yǎng)方法包括如下步驟(1)以具有99.9%日本和牛遺傳性狀的公牛為父系，荷斯坦奶牛為母系，分別提取父系的精液和母系的卵母細(xì)胞；(2)在卵母細(xì)胞成熟液中培育卵母細(xì)胞；(3)將成熟的卵母細(xì)胞在體外受精培養(yǎng)液中進(jìn)行體外受精；(4)將受精卵在胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)；(5)體外胚胎的玻璃化冷凍。將體外培養(yǎng)的胚胎移植入受體牛子宮內(nèi)，采用子宮雙側(cè)內(nèi)壁胚胎移植法，最終培育出具有日本和牛和加拿大荷斯坦奶牛性狀的雜交子一代和牛新品系，其具有肉用價(jià)值高、生產(chǎn)性能好的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/073GK103184189SQ20121036965
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
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