皮膚鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生的基于多重pcr的測試及其區(qū)分方法
【專利摘要】使用KRT9和C15orf48區(qū)分生物樣品中的鱗狀細(xì)胞癌與假性上皮瘤樣增生的方法，使用差異表達基因作為鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)記物的方法，使用分子途徑作為鱗狀細(xì)胞癌的治療靶標(biāo)的方法，及其診斷試劑盒。
【專利說明】皮膚鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生的基于多重PCR的測
試及其區(qū)分方法
[0001]本發(fā)明涉及用于區(qū)分生物樣品中的皮膚鱗狀細(xì)胞癌與假性上皮瘤樣增生的方法，涉及使用差異表達基因作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)記物的方法，并且涉及使用分子途徑作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療祀標(biāo)的方法。
[0002]相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求于2011年10月14日提交的美國臨時專利申請序號61/547，272的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容出于所有目的通過引用并入本文。
[0003]發(fā)明背景
皮膚鱗狀細(xì)胞癌是第二最常見的皮膚惡性腫瘤，其每年診斷超過25萬例。參見M.Alam 和 D.Ratner, Cutaneous squamous cell carcinoma, 344 N Eng J Med975-83 (2001)。盡管其通常為直接的診斷，但有很多皮膚鱗狀細(xì)胞癌的臨床和組織學(xué)擬態(tài)(simulants)。一些可以是最難以區(qū)分的病變，例如光線性角化病和原位鱗狀細(xì)胞癌，顯示變化的不同程度的角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)育不良，并且通常被認(rèn)為是鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤前體。參 JAL B.R.Smoller, Squamous cell carcinoma: from precursor lesions tohigh-risk variants, 19 Suppl 2 Mod Pathol (S88-92) (2006)。
[0004]最難與鱗狀細(xì)胞癌區(qū)分的病變之一是假性上皮瘤樣增生。假性上皮瘤樣增生是通常與炎性或腫瘤過程相關(guān)的增生性鱗狀增殖。參見M.H.Grunwald等人，Pseudocarcinomatous hyperplasia, 10 Am J Dermatopathol 95—103 (1988) ；M.Zayour 矛口 R.Lazova, PseudoepitheIiomatous hyperplasia:a review, 33 Am JDermatopathol 112-22 (2011)。由于慢性潰瘍以及再上皮化、感染和紋身顏料，假性上皮瘤樣增生可見與炎性浸潤相關(guān)。參見M.H.Grunwa I d等人，Pseudocarcinoma toushyperplasia, 10 Am J Dermatopathol 95-103 (1988) ；M.Zayour 和 R.Lazova,PseudoepitheIiomatous hyperplasia: a review, 33 Am J Dermatopathol 112—22(2011) ；N.Kluger 等 A? Pseudoepi theIioma tous epidermal hyperplasia intattoos: a report of three cases, 9 Am J Clin Dermatol 337-40 (2008)。還已描述它與顆粒細(xì)胞瘤、皮膚纖維瘤、Spitz腫瘤和黑色素瘤相關(guān)。參見M.H.Grunwald等人，Pseudocarcinoma tous hyperplasia, 10 Am J Dermatopathol 95-103 (1988)；M.Zayour 矛口 R.Lazova, Pseudoepi theIioma tous hyperplasia: a review, 33 AmJ Dermatopathol 112-22 (2011)。 [0005]在組織學(xué)上，假性上皮瘤樣增生表征為通過鱗狀細(xì)胞的巢(nests)和鏈(strands)進入真皮的不規(guī)則延伸，和可以以缺少限制的方式增殖且展示核異型性和核分裂的鋸齒形邊緣。盡管已經(jīng)描述了用于區(qū)分鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，但它們之間的區(qū)分在某些環(huán)境中，特別是淺表的、有限的或定向不良的活檢樣品中，可能是困難的或幾乎不可能的。參見M.H.Grunwa I d等人，Pseudocarcinoma toushyperplasia, 10 Am J Dermatopathol 95-103 (1988) ；M.Zayour 和 R.Lazova,PseudoepitheIiomatous hyperplasia: a review, 33 Am J Dermatopathol 112—22(2011) ；N.Kluger 等 A? Pseudoepi theIioma tous epidermal hyperplasia intattoos: a report of three cases, 9 Am J Clin Dermatol 337-40 (2008)。
[0006]因為鱗狀細(xì)胞癌是最常診斷的皮膚惡性腫瘤之一，因為其準(zhǔn)確診斷通常是挑戰(zhàn)性的，并且因為患者的臨床管理在很大程度上依賴于病理診斷的準(zhǔn)確性，所以存在對于準(zhǔn)確區(qū)分鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生的可靠方法的需要，從而產(chǎn)生準(zhǔn)確的診斷和適當(dāng)?shù)闹委煛?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生的區(qū)別性基因表達譜現(xiàn)提供了利用DNA微陣列通過目標(biāo)分子測量在二者之間進行區(qū)分的能力。
[0008]本發(fā)明提供了通過從生物樣品分離總RNA，使用KRT9和C15orf48探針/引物和所述分離的RNA進行多重PCR，獲得KRT9的CT值并獲得C15orf48的CT值，而區(qū)分所述樣品中的皮膚鱗狀細(xì)胞癌與假性上皮 瘤樣增生的方法。如果C15orf48的CT值低于KRT9的CT值，則所述樣品是皮膚鱗狀細(xì)胞癌。如果C15orf48的CT值高于KRT9的CT值，則所述樣品是假性上皮瘤樣增生。
[0009]本發(fā)明還提供了使用差異表達基因作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)記物的方法。
[0010]本發(fā)明還提供了使用分子途徑，例如氧化磷酸化、結(jié)腸癌中的多胺調(diào)節(jié)，線粒體功能障礙，和蛋白泛素化，作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療靶標(biāo)的方法。
[0011]附圖簡述
本申請文件包含至少一副顏色繪制的附圖。在請求并繳納必要費用后，可由政府機構(gòu)提供帶有彩色附圖的本申請的副本。
[0012]圖1描述了利用y軸上的[-log (P-值)]，鱗狀細(xì)胞癌與假性上皮瘤樣增生相比較，最顯著富集的分子途徑(X軸)(Fe >2.0，P〈0.05)。水平線表示顯著性的閾值(Ρ〈0.05)。
[0013]圖2描述了使用展現(xiàn)鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和假性上皮瘤樣增生(PEH ；χ軸)的最顯著的差異表達基因(y軸)的層序聚類分析證實不同的基因特征。下調(diào)的基因是藍色的，且上調(diào)的基因是紅色的。
[0014]圖3描述了確認(rèn)鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生之間5個代表性基因的差異表達的QRT-PCR分析。Y軸表示變化倍數(shù)(鱗狀細(xì)胞癌相比于假性上皮瘤樣增生)。柱上的線表不標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0015]發(fā)明詳述
在本發(fā)明之前，有但僅有少數(shù)DNA微陣列研究，檢測皮膚鱗狀病變之間的差異基因表達。參見 Τ.Ρ.Dooley ^ Α? Biomarkers of human cutaneous squamous cellcarcinoma from tissues and cell lines identified by DNA microarraysand qRT-PCR, 11 Biochem Biophys Res Commun 1026-36 (2003) ；A.S.Haider等人，Genomic analysis defines a cancelspecific gene expressionsignature for human squamous cell carcinoma and distinguishesmalignant hyperproliferation from benign hyperplasia, 126 J InvestDermatol 869-81 (2006) ；V.P.Kathpalia 等Genome_wich transcriptionalprofiling in human squamous cell carcinoma of the skin identifiesunique tumor-associated signatures, 33 J Dermatol 309-18 (2006) ；1.NindlIdentification of differentally expressed genes in cutaneous
squamous cell carcinoma by microarray expression profiling, 5 MolCancer 30 (2006) ; S.H.Ra 等人，Molecular discrimination of cutaneoussquamous cell carcinoma from actinic keratosis and normal skin, ModPathol (2011)(預(yù)先在線公開，2011年4月I日)。
[0016]本發(fā)明人檢測了差異表達基因和分子途徑，以比較鱗狀細(xì)胞癌與光線性角化病和正常皮膚。參見 S.H.Ra ^Jk,Molecular discrimination of cutaneous squamous
cell carcinoma from actinic keratosis and normal skin, Mod Pathol(2011)(預(yù)先在線公開，2011年4月I日)。本發(fā)明人確定了這些實體的每一種展示獨特的分子特征。如下文詳述，本發(fā)明人使用可得的最全面GeneChip微陣列之一(人U133 plus
2.0陣列)概要描述并檢測了超過47000個基因的基因表達，以在福爾馬林固定石蠟包埋組織中研究鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生之間的差異基因表達。
[0017]基于這些研究，本 發(fā)明人確定鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生的區(qū)別性基因表達譜現(xiàn)提供了利用DNA微陣列通過目標(biāo)分子測量在二者之間進行區(qū)分的能力。
[0018]本發(fā)明提供了通過從生物樣品(例如得自于人的生物樣品)分離總RNA，使用KRT9和C15orf48探針/引物和所述分離的RNA進行多重PCR，獲得KRT9的CT值并獲得C15orf48的CT值，而區(qū)分所述樣品中的皮膚鱗狀細(xì)胞癌與假性上皮瘤樣增生的方法。如果C15orf48的CT值低于KRT9的CT值，則所述樣品是皮膚鱗狀細(xì)胞癌。如果C15orf48的CT值高于KRT9的CT值，則所述樣品是假性上皮瘤樣增生。
[0019]本發(fā)明還提供了用于測定生物樣品，例如得自于人的那些樣品的診斷試劑盒。所述試劑盒包括用于檢測KRT9的試劑，用于檢測C15orf48的試劑，可用于促進所述檢測的一種或多種試劑，和使用所述試劑盒的說明。
[0020]本發(fā)明還提供了使用差異表達基因作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)記物的方法。
[0021]本發(fā)明還提供了使用分子途徑，例如氧化磷酸化、結(jié)腸癌中的多胺調(diào)節(jié)，線粒體功能障礙，和蛋白泛素化，作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療靶標(biāo)的方法。
[0022]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點體現(xiàn)在實施例和附圖中。
[0023]本發(fā)明更詳細(xì)地描述于以下說明性實施例中。盡管所述實施例可僅代表本發(fā)明的選擇的實施方式，但以下實施例僅為說明性的且絕非限制性的。
實施例
[0024]實施例1:鱗狀細(xì)胞癌和假性上皮瘤樣增生的分析
從Tamtron數(shù)據(jù)庫確定10例鱗狀細(xì)胞癌和10例炎癥型假性上皮瘤樣增生。找到載玻片和福爾馬林固定的石蠟包埋組織(時間〈6個月)。評述載玻片并確認(rèn)其診斷。使用無菌外科手術(shù)刀從石蠟塊取出目標(biāo)區(qū)域。
[0025]RNA分離和質(zhì)量控制
根據(jù)制造商的說明，使用 Ambion? RecoverAlI? (Applied Biosystems/Ambion, ?Austin, TX, USA)分離總RNA。簡言之，使用一系列二甲苯和乙醇清洗，將福爾馬林固定且石蠟包埋的樣品脫石蠟，并且隨后在50°C進行蛋白酶K降解16小時，以從交聯(lián)蛋白釋放RNA0最后，通過在玻璃纖維濾器上捕獲純化總RNA。在清洗后，將總RNA洗脫。使用Agilent2100 生物分析儀(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)評估 RNA 完整性,并使用 NanoDrop? 8000 (NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA)測定純度 / 濃度。選擇RNA完整性數(shù)值(RIN)≥5且260/280比例≥1.7的RNA樣品用于微陣列。
[0026]靶標(biāo)制備和微陣列雜交
使用NuGEN WT-Ovatione福爾馬林固定且石蠟包埋的RNA擴增系統(tǒng)V2制備微陣列靶標(biāo)。這個系統(tǒng)提供由Ribo-SPIA?技術(shù)支持的有效cDNA擴增。因此，它對于使用來自福爾馬林固定且石蠟包埋樣品的小量的降解RNA進行全面基因表達分析是理想的。使用50納克的總RNA用于第一鏈合成。在第二鏈cDNA合成后，使用WT-Ovation試劑盒提供的Agencourt? RNAClean?珠子純化雙鏈cDNA，隨后進行SPIA cDNA擴增。將5微克的擴增cDNA 片段化，并根據(jù)說明(NuGEN? Technologies, San Carlos, CA, USA),使用 NuGEN’sFL-Ovation? cDNA生物素模塊V2標(biāo)記，并且隨后根據(jù)制造商的說明雜交至AffymetrixGeneChip? U133plus 2.0 陣列(Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)。將所述陣列清洗，并使用 Affymetrix GeneChip? 方案在 Affymetrix Fluidics Station 450 中使用鏈霉親和素藻紅蛋白染色，并使用Affymetrix GeneChip?掃描儀3000掃描。
[0027]數(shù)據(jù)分析
使用AGCC軟件(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)進行陣列圖像的獲得和初步量化。使用Partek?基因組學(xué)套裝6.4版(Partek? Inc., St.Louis, MO, USA)進行隨后的數(shù)據(jù)分析。首先，進行單因素ANOVA以確定在p〈0.05的組之間的基因，并且隨后計算組之間以變化倍數(shù)計的相對差異。認(rèn)為≥2倍且p〈0.05的基因是在組之間差異表達的。使用Partek?默認(rèn)設(shè)置進行聚類分析。使用Ingenuity途徑分析7.6版(Ingenuity Systems?,Redwood City, CA, USA)進行經(jīng)典途徑分析。簡言之，首先，將包含基因標(biāo)示符和相應(yīng)的倍數(shù)變化的差異表達基因列表作為Excel數(shù)據(jù)表上傳到所述軟件。每個基因標(biāo)示符映射到Ingenuity途徑知識庫中的其對應(yīng)基因目標(biāo)。隨后，將這些基因用作途徑分析的起點。經(jīng)典途徑分析從經(jīng)典途徑的Ingenuity途徑分析文庫確定對數(shù)據(jù)集最顯著的途徑。數(shù)據(jù)集與經(jīng)典途徑之間的關(guān)聯(lián)的顯著性以2種方式測量:1)展示映射到途徑的來自數(shù)據(jù)集的基因的數(shù)量除以映射到經(jīng)典途徑的基因的總數(shù)的比例；和2)使用Fischer的精密試驗計算P值，確定僅通過偶然性解釋數(shù)據(jù)集中的基因和經(jīng)典途徑之間的關(guān)聯(lián)的可能性。
[0028]定量實時PCR分析
根據(jù)制造商的說明，使用SYBR Green實時RT-PCR試劑盒(Applied Biosystems)進行QRT-PCR確認(rèn)。使用與用于微陣列雜交相同的RNA進行QRT-PCR確認(rèn)。使用kppliedBiosystems 7500實時PCR系統(tǒng)，用于使用以下引物的分析:
S100A7:左 tgctgacgatgatgaaggag ;右 atgtctcccagcaaggacag
S100A8:左 gagctggagaaagccttgaa ;右 agacgtctgcaccctttttc
H0XC10:左 gctggtgtgtgtgtcaaacc ;右 aacgattctgcctgtgctct
C15orf48:?Ε aagggtgaccaaatgacgag ；/{Ei tgcagttattgctgcactcc
KRT9:左 gcctgcttattggatcctga ;右 caggccagagagaggaaaga
使用GAPDH作為用于標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部控制。[0029]數(shù)據(jù)
在SCC和PHl之間鑒定出703個差異表達基因，其中657個上調(diào)且46個下調(diào)。途徑分析揭示，在這703個基因之間最顯著富集的分子途徑是氧化磷酸化、結(jié)腸癌中的多胺調(diào)節(jié)，線粒體功能障礙，和蛋白泛素化。參見圖1。
[0030]最顯著上調(diào)的基因包括C15orf48、KLK6、CARD18、MMPl、LHX2，和鈣結(jié)合蛋白:S100A7、S100A7A、S100A8、S100A9 和 SlOOP。最顯著下調(diào)的基因包括Λ7?7Ρ、KRT2、SNX2UH0XC6、VHL、CD36、MFAP5、H0XC10、ZIC1 和 NPR3。參見表 I。
【權(quán)利要求】
1.用于區(qū)分生物樣品中的皮膚鱗狀細(xì)胞癌與假性上皮瘤樣增生的方法，包括: (a)從所述樣品分離總RNA; (b)使用KRT9和C15orf48探針/引物和所述分離的RNA進行多重PCR； (c)獲得KRT9的CT值；和 (d)獲得C15orf48 的 CT 值， 其中，如果C15orf48的CT值低于KRT9的CT值，則所述樣品是皮膚鱗狀細(xì)胞癌，和 其中，如果C15orf48的CT值高于KRT9的CT值，則所述樣品是假性上皮瘤樣增生。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品得自于人。
3.用于測定生物樣品的診斷試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測KRT9的試劑，用于檢測C15orf48的試劑，可用于 促進所述檢測的一種或多種試劑，和使用所述試劑盒的說明。
4.用于區(qū)分皮膚鱗狀細(xì)胞癌與假性上皮瘤樣增生的方法，包括獲得待測定的樣品，和對所述樣品進行基因表達微陣列分析。
5.使用差異表達基因作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)記物的方法。
6.使用分子途徑作為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療祀標(biāo)的方法。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述分子途徑選自氧化磷酸化、結(jié)腸癌中的多胺調(diào)節(jié)，線粒體功能障礙和蛋白泛素化組成的列表。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述基因表達微陣列通過實時PCR測量KRT9和C15orf48mRNA的水平。
9.權(quán)利要求4的方法，其中，當(dāng)通過測量KRT9和C15orf48的水平，對C15orf48獲得的CT值低于對KRT9獲得的CT值時，確定皮膚鱗狀細(xì)胞癌。
10.權(quán)利要求4的方法，其中，當(dāng)通過測量KRT9和C15orf48的水平，對C15orf48獲得的CT值高于對KRT9獲得的CT值時，確定假性上皮瘤樣增生。
11.用于確定生物樣品中的鱗狀細(xì)胞癌的方法，包括: (a)獲得所述生物樣品； (b)從所述樣品分離總RNA; (c)使用KRT9和C15orf48探針/引物和所述分離的RNA進行多重PCR； (d)獲得KRT9的CT值， (e)獲得C15orf48的CT值；和 (f)使用所述CT值確定鱗狀細(xì)胞癌，其中C15orf48的CT值低于KRT9的CT值。
12.用于確定生物樣品中的假性上皮瘤樣增生的方法，包括: (a)獲得所述生物樣品； (b)從所述樣品分離總RNA; (c)使用KRT9和C15orf48探針/引物和所述分離的RNA進行多重PCR； (d)獲得KRT9的CT值， (e)獲得C15orf48的CT值；和 (f)使用所述CT值確定鱗狀細(xì)胞癌，其中C15orf48的CT值高于KRT9的CT值。
13.權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品得自于人。
14.用于區(qū)分生物樣品中的鱗狀細(xì)胞癌與假性上皮瘤樣增生的方法，包括: (a)從所述樣品分離總RNA;(b)使用KRT9和C15orf48探針/引物和所述分離的RNA進行多重PCR；(c)獲得KRT9的CT值；和(d)獲得C15orf48 的 CT 值，其中，如果C15orf48的CT值低于KRT9的CT值，則所述樣品是鱗狀細(xì)胞癌，和其中，如果C15orf48的CT值高于KRT9的CT值，則所述樣品是假性上皮瘤樣增生。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述樣品得自于人。
【文檔編號】C12N15/11GK103987861SQ201280061618
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月14日
【發(fā)明者】X.李, J.周, S.W.賓德, S.拉 申請人:加州大學(xué)評議會