人參與西洋參的特異性分子標(biāo)記及其鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及中藥材的鑒別方法，具體涉及人參與西洋參的特異性分子標(biāo)記及其鑒別方法。本發(fā)明提供了能夠特異性識(shí)別人參與西洋參的DNA分子標(biāo)記，所述的DNA分子標(biāo)記分別位于Seq.No.1～5的DNA序列中的（SSR）位點(diǎn)上，根據(jù)上述序列設(shè)計(jì)5對(duì)引物，對(duì)人參和西洋參的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每一對(duì)引物都能分別擴(kuò)增出特異性識(shí)別人參和西洋參的PCR產(chǎn)物，用聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)這些長度不一的產(chǎn)物，從而快速鑒別人參與西洋參。本方法所需樣品少，不受產(chǎn)品形態(tài)的限制，對(duì)樣品的DNA長度要求不高，PCR穩(wěn)定且重復(fù)性好。
【專利說明】人參與西洋參的特異性分子標(biāo)記及其鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及中藥材的鑒別方法。具體涉及人參與西洋參的特異性分子標(biāo)記及其鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人參(Panaxginseng C.A.Meyer)和西洋參(Panax quinquefolius L.)均為目前我國應(yīng)用最廣泛的重要中藥材，屬多年生宿根草本植物五加科(Araliaceae)人參。研究顯示，人參分布于我國東北、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)及朝鮮等地；西洋參原產(chǎn)于北美低山地區(qū)，我國引種成功后在東北、華北、華中和康滇四大栽培區(qū)均有栽種?，F(xiàn)有技術(shù)公開了人參和西洋參藥性差異較大，但形態(tài)相似，尤其是國內(nèi)栽培的人參與栽培西洋參很難根據(jù)形態(tài)特征準(zhǔn)確鑒別，兩者的粉末更是難以區(qū)別。因此市場(chǎng)需求一種不依賴于形態(tài)特征的鑒別人參與西洋參的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目 的在于提供重要中藥材的鑒別方法，具體涉及人參與西洋參的特異性分子標(biāo)記，及其鑒別方法，尤其是一種不依賴于形態(tài)特征的鑒別人參與西洋參的方法。
[0004]本發(fā)明提供了能夠特異性識(shí)別人參與西洋參的DNA分子標(biāo)記，所述的DNA分子標(biāo)記分別位于Seq.N0.1~5的DNA序列中的(SSR)位點(diǎn)上,所述的Seq.N0.1, Seq.N0.2, Seq.N0.3，Seq.N0.4和Seq.N0.5DNA序列上分別具有一個(gè)簡單重復(fù)序列(SSR)位點(diǎn)，通過該序列位點(diǎn)能夠特異性地識(shí)別人參和西洋參；
[0005]進(jìn)一步，本發(fā)明提供了基于上述DNA分子標(biāo)記的快速鑒別人參與西洋參的方法，其中，根據(jù)上述序列設(shè)計(jì)5對(duì)引物，對(duì)人參和西洋參的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每一對(duì)引物都能分別擴(kuò)增出特異性識(shí)別人參和西洋參的PCR產(chǎn)物，用聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)這些長度不一的產(chǎn)物，從而快速鑒別人參與西洋參。
[0006]更具體的，本發(fā)明的快速鑒別人參與西洋參的方法，其特征在于，其包括，
[0007]1，特異性擴(kuò)增人參與西洋參的簡單重復(fù)序列(simple repeat sequence,簡稱SSR)位點(diǎn)的引物序列；本發(fā)明從大量含有SSR位點(diǎn)的人參序列中篩選出含有SSR位點(diǎn)的5條 DNA 序列，分別為 Seq.N0.1，Seq.N0.2，Seq.N0.3，Seq.N0.4 和 Seq.N0.5，這些 SSR 位點(diǎn)用于特異性地區(qū)別人參與西洋參；
[0008]2，利用上述的引物鑒別人參與西洋參:
[0009]根據(jù)上述5條人參DNA序列，設(shè)計(jì)5對(duì)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,簡稱 PCR)引物，其序列分別為 Seq.N0.6 和 Seq.N0.7, Seq.N0.8 和 Seq.N0.9，Seq.N0.10 和 Seq.N0.11，Seq.N0.12 和 Seq.N0.13，Seq.N0.14 和 Seq.N0.15 ；
[0010]用Seq.N0.6+Seq.N0.7對(duì)人參與西洋參的DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR退火溫度52°C，結(jié)果顯示，人參能產(chǎn)生181bp長的PCR產(chǎn)物，而西洋參不能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物；
[0011]用Seq.N0.8+Se q.N0.9對(duì)人參與西洋參的DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度55°C，結(jié)果顯示，人參只能產(chǎn)生一條203bp長的PCR產(chǎn)物，而西洋參則能產(chǎn)生191bp和203bp長的兩條PCR產(chǎn)物；
[0012]用Seq.N0.10+Seq.N0.11對(duì)人參與西洋參的DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度57°C，結(jié)果顯示，人參能產(chǎn)生一條243bp長的PCR產(chǎn)物，而西洋參則產(chǎn)生235bp長的PCR產(chǎn)物；
[0013]用Seq.N0.12+Seq.N0.13對(duì)人參與西洋參的DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度57°C，結(jié)果顯示，人參只能產(chǎn)生一條184bp長的PCR產(chǎn)物，而西洋參則能產(chǎn)生166bp和157bp長的兩條PCR產(chǎn)物；
[0014]用Seq.N0.14+Seq.N0.15對(duì)人參與西洋參的DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度57°C，結(jié)果顯示，人參能產(chǎn)生251bp和273bp兩條PCR產(chǎn)物，而西洋參則不能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。
[0015]本發(fā)明的實(shí)施例中，對(duì)人參與西洋參進(jìn)行鑒定:
[0016]I)取待鑒定樣品0.05克，用高鹽低PH法提取樣品的總DNA ；
[0017]2)取25~50ng待檢樣品的DNA，從上述的5對(duì)引物中任選3對(duì)，按
[0018]各對(duì)引物特定的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每一對(duì)引物設(shè)置3次重復(fù)和空白對(duì)照；
[0019]3)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物的大??；
[0020]4)根據(jù)所選引物對(duì)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的大小和表1所提出的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)樣品的屬性做出判斷。
[0021]本發(fā)明的上述鑒定中，
[0022]選擇引物對(duì)(Seq.N0.6+Seq.N0.7)、引物對(duì)(Seq.N0.14+Seq.N0.15)和其它任何一個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示，采用前兩個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增西洋參的DNA，不能獲得任何產(chǎn)物，而擴(kuò)增人參的DNA，將獲得表1所示的產(chǎn)物；用其它3對(duì)引物分別擴(kuò)增人參和西洋參的DNA均將獲得如表1所示的大小不一的產(chǎn)物；
[0023]表1.用于人參、西洋參鑒定的5對(duì)PCR引物及產(chǎn)物大小
【權(quán)利要求】
1.含有人參與西洋參的特異性分子標(biāo)記位點(diǎn)的如Seq.N0.1，Seq.N0.2，Seq.N0.3，Seq.N0.4 和 Seq.N0.5 所不的 DNA 序列。
2.基于權(quán)利要求1所述的DNA序列的PCR引物對(duì)，其序列組合為:Seq.N0.6和Seq.N0.7，Seq.N0.8 和 Seq.N0.9，Seq.N0.10 和 Seq.N0.11，Seq.N0.12 和 Seq.N0.13，Seq.N0.14和 Seq.N0.15。
3.一種鑒別人參與西洋參的方法，其特征在于，包括:特異性擴(kuò)增人參與西洋參的簡單重復(fù)序列位點(diǎn)的如權(quán)利要求2所述的引物序列，利用所述的引物鑒別人參與西洋參，其包括步驟: 1)取待鑒定樣品，用高鹽低PH法提取樣品的總DNA； 2)取待檢樣品的DNA，從所述的引物對(duì)中任選其中3對(duì)，按各對(duì)引物特定的 退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每一對(duì)引物設(shè)置3次重復(fù)和空白對(duì)照； 3)根據(jù)所選引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小對(duì)樣品的屬性做出判斷。
4.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述各引物對(duì)的判斷標(biāo)準(zhǔn)如表1所示: 表1.用于人參、西洋參鑒定的5對(duì)PCR引物及產(chǎn)物大小
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103923909SQ201310014700
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月15日
【發(fā)明者】張文駒, 陳子易, 程舟, 陳家寬 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)