加強(qiáng)了toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種加強(qiáng)了toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與用途。它過量表達(dá)了生物合成豐加霉素的關(guān)鍵酶-腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628更高的豐加霉素合成能力。構(gòu)建過程如下：1）構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-toyG；?2）利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。利用pIB139載體上的啟動(dòng)子permE*啟動(dòng)toyG基因的表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139-toyG特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。與原始菌株相比，重組菌腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了至少1.2倍，豐加霉素產(chǎn)量至少提高27.1%。
【專利說明】加強(qiáng)了 toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與

用途【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及通過加強(qiáng)toyG基因在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的表達(dá)提高豐加霉素產(chǎn)量，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]豐加霉素是一種新型核苷類抗生素，分子式為C12H13N5O4,核糖C1連接類似鳥嘌呤的脫氮雜嘌呤環(huán)，核心結(jié)構(gòu)為吡咯嘧啶核苷類似物。作用機(jī)理主要是通過抑制微生物的轉(zhuǎn)錄而影響菌體的生長，其生物活性研究報(bào)道主要集中在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近期有研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素對多種植物疫病具有良好的防治效果，長期使用不會(huì)造成環(huán)境污染，而且對植物生長也具有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，豐加霉素在農(nóng)業(yè)植物病害防治領(lǐng)域具有的應(yīng)用潛力。相對于化學(xué)合成法，生物法合成豐加霉素以可再生資源為原料，具有反應(yīng)條件溫和、污染少以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此，生物合成法是目前豐加霉素工業(yè)化生產(chǎn)比較經(jīng)濟(jì)有效的方法。
[0003]豐加霉素屬于次級代謝產(chǎn)物，合成途徑復(fù)雜，受到多種因素的限制與調(diào)控，導(dǎo)致豐加霉素合成水平較低，難以規(guī)模化生產(chǎn)。解決該問題的現(xiàn)有辦法一般都是通過傳統(tǒng)的誘變育種作為主要手段篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生產(chǎn)菌株，但篩選到高效菌株的不確定因素多、周期長。
[0004]如何利用分子生物學(xué)等先進(jìn)的技術(shù)手段改良微生物進(jìn)一步提高豐加霉素的產(chǎn)量成為一條可行的思路。McCarty等人以一株合成豐加霉素菌株Streptomyces rimosus(ATCC14673)為起始研究對象，克隆了生物合成豐加霉素基因簇，闡明了豐加霉素的合成過程及調(diào)控機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素由GTP為前體，經(jīng)多步反應(yīng)合成豐加霉素，其中由toyG基因編碼的腺苷琥珀酸合成酶是代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。但是利用代謝工程技術(shù)通過增加豐加霉素代謝通量而進(jìn)一步提高豐加霉素產(chǎn)量因?yàn)樯婕氨磉_(dá)體系的建立等復(fù)雜問題未見相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種加強(qiáng)了 toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌及構(gòu)建方法與用途。
[0006]淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌iStreptomyces dias ta tochromogenes) 1628 是一株拮抗放線菌，其發(fā)酵液對多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，經(jīng)分離提取，確定其主要有效成分為豐加霉素，尚未見淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的代謝工程分子改造方面的的研究報(bào)道。
[0007]本發(fā)明首先從以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628(菌株的保藏編號為CGMCC N0.2060)中克隆出編碼腺苷琥珀酸合成酶的toyG基因，并將該基因與鏈霉菌整合型質(zhì)粒PIB139連接，成功構(gòu)建了攜帶基因的重組載體pIB139-1o_FG，并利用接合轉(zhuǎn)移法將其特異性的整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628染色體上。
[0008]一種淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的toyG基因，他的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]一種加強(qiáng)了 toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，它表達(dá)了生物合成豐加霉素的關(guān)鍵酶一腺苷琥拍酸合成酶編碼基因io_FG,具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌i^treptomycesdi as ta tochromogenes) 1628更高的豐加霉素表達(dá)能力。
[0010]所述的原始菌為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 16280
[0011]所述的腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG來自于待重組的原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S trep tomyces di as ta tochromogenes)。
[0012]所述的腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG整合入原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體。
[0013]所述的加強(qiáng)了 toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu)建方法，過程如下:
1)構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-toyG；
2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。
[0014]利用PIB139載體上的啟動(dòng)子permE*啟動(dòng)toyG基因的表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139_toyG特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌^Streptomycesdi as ta tochromogenes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。
[0015]所述的加強(qiáng)了 toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的用途，與原始菌株相比，重組菌腺苷琥珀酸合成酶酶活至少提高了 1.2倍，豐加霉素產(chǎn)量至少提高了 27.1%。
[0016]本發(fā)明的有益 效果:
本發(fā)明加強(qiáng)豐加霉素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因toyG在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中過量表達(dá)后，重組菌腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了 1.2倍，合成豐加霉素的能力比原始菌提高了
27.1%。為進(jìn)一步提高豐加霉素產(chǎn)量，早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是重組質(zhì)粒pIB139-toyG的構(gòu)建示意圖。
[0018]圖2是重組質(zhì)粒pMD18-T_toyG的酶切驗(yàn)證圖。
[0019]1.toyG 基因；2.pMD18-T_toyG/M/e l+Not I ；3.DNA Marker DL2000。
[0020]圖3是toyG基因在厶coli BL21的SDS-PAGE分析圖。
[0021]1.\>K[2Sa-toyG/E.coli BL21 誘導(dǎo)；2.Protein Marker ;3.pET28a-1oj^6,/￡'.coliBL21未誘導(dǎo)。
[0022]圖4是重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pIB139_toyG的酶切電泳驗(yàn)證圖。
[0023]1.toyG gene ；2.pIB139-toyG/M/e l+Not I ；3.pIB139/M/e l+Not I ；4.λ DNA/Η?η? III Marker。
[0024]圖5是重組菌1628-T0YG的PCR電泳驗(yàn)證圖。
[0025]1.原始菌株；2-5.基因工程菌株；6.DL2000 Marker。
[0026]具體實(shí)施方法
以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0027]實(shí)施例1:目的基因的擴(kuò)增及重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu)建
以 51 di as ta tochromogenes 1628 染色體基因組為模板，以 PtoyG F Nde I 和 PtoyGR Not I為引物，PCR擴(kuò)增獲得含有Λ汝I和Afoi I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的toyG基因，與pMD18_TVector 連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-toyG0We I + Not I )，將克隆載體pMD18-T_toyG0WeI + Not I)轉(zhuǎn)化至受體大腸桿菌中，涂布于含氨芐抗性的LB瓊脂平板上，37 1:培養(yǎng)過夜后，隨機(jī)挑取陽性轉(zhuǎn)化子酶切鑒定后送上海生工測序并進(jìn)行序列分析，用I和Not I雙酶切得到含有I和Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)的toyG基因，與同樣雙酶切的鏈霉菌整合型穿梭表達(dá)載體PIB139連接，得到重組穿梭表達(dá)載體pIB139-toyG經(jīng)酶切驗(yàn)證后，將其轉(zhuǎn)XE.co7iET12567(pUZ8002)，在卡那抗性和阿泊拉霉素抗性的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子B.co7iET12567(pUZ8002, pIB139_toyG)，VX B.co7iET12567 (pUZ8002, pIB139-toyG)為供體，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌為受體，利用接合轉(zhuǎn)移法將pIB139-toyG特異性的整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌X diastatochromogenes 1628染色體上,在阿泊拉霉素抗性MS平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，即得到重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-T0YG。
[0028]以51 di as ta tochromogenes 1628染色體為模板，設(shè)計(jì)兩條引物，PCR擴(kuò)增toyG,引物設(shè)計(jì)如下:
toyG F Nde 1:5’ -CGCCATATGGTGCCCGCACTTGTGCTG -3’
toyG R Not 1:5’ -CGCGCGGCCGCCTACAGGAAGGAGTTGATC-3>
重組質(zhì)粒pMD18-T-toyG以限制性內(nèi)切酶I和Not I雙酶切驗(yàn)證如圖2所示，重組質(zhì)粒pMD18-T- toyG雙酶切獲得約1.3kb和2.7kb的DNA片段，分別與toyG基因片段和質(zhì)粒pMD18-T的大小一致，說明重組克隆載體連接正確。對重組質(zhì)粒pMD18-T-toyG進(jìn)行測序，序列分析表明插入片段為1284 bp的序列，編碼427個(gè)氨基酸，相對分子量大小分別約為47 kDa，與已報(bào)道的許多鏈霉菌屬的腺苷琥珀酸合成酶基因具有較高的同源性，其中最高為89%。toyG核酸序列如SEQ ID NO:1所示。將toyG基因連入pET28a載體，構(gòu)建pET28a-toyG重組載體，并將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于IOmL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，如圖3所示，誘導(dǎo)后重組菌有明顯的特征性條帶出現(xiàn)，測得腺苷琥珀酸合成酶酶活力為23 U/mg總蛋白，表明toyG基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。
[0029]整合型重組穿梭 表達(dá)質(zhì)粒pIB139_toyG的酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示，重組質(zhì)粒pIB139-toyG經(jīng)Λ汝I和Not I雙酶切釋放1.3 kb的片段與toyG基因大小一致，說明質(zhì)粒pIB139-toyG構(gòu)建正確，以接合轉(zhuǎn)移法將其特異性的整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌5:di as ta tochromogenes 1628染色體上,在阿泊拉霉素抗性平板上隨機(jī)挑取若干單菌落于CP培養(yǎng)基中培養(yǎng)多次后，提取染色體。PCR實(shí)驗(yàn)均能擴(kuò)增出阿泊拉霉素抗性基因a/ττ (圖
5)，證明重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-T0YG構(gòu)建成功，且遺傳穩(wěn)定。
[0030]實(shí)施例2:淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌原始菌及重組菌的發(fā)酵性能驗(yàn)證
與原始菌株相比，重組菌的腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了 1.2倍；對重組菌1628-T0YG以及原始菌di as ta tochromogenes 1628進(jìn)行250 mL搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),從發(fā)酵角度對淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中腺苷琥珀酸合成酶酶活的增強(qiáng)對豐加霉素產(chǎn)量的提高作用進(jìn)行驗(yàn)證。往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min, 28°C，發(fā)酵96h，對照組為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌出發(fā)株。如表1所示，重組菌豐加霉素的產(chǎn)量高于原始菌，重組菌豐加霉素最終產(chǎn)量達(dá)到171.54 mg/L，較原始菌提高了約27.1%,且重復(fù)性良好。說明在豐加霉素生產(chǎn)菌株51 di as ta tochromogenes 1628中增強(qiáng)生物合成途徑的關(guān)鍵酶腺苷琥珀酸合成酶一ToyG的表達(dá)有助于提高發(fā)酵過程中豐加霉素的產(chǎn)量。
[0031]表1重組菌與原始菌最終豐加霉素產(chǎn)量的比較
【權(quán)利要求】
1.一種淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的toyG基因，其特征在于:他的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種加強(qiáng)了 toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于:它表達(dá)了生物合成豐加霉素的關(guān)鍵酶一腺苷琥珀酸合成酶編碼基因to_FG，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628 更高的豐加霉素表達(dá)能力。
3.如權(quán)利要求2所述的加強(qiáng)了toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于:所述的原始菌為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌iStreptomyces diastatochromogenes) \<62私。
4.如權(quán)利要求2所述的加強(qiáng)了toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于:所述的腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG來自于待重組的原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(S trep tomyces di as ta tochromogenes)。
5.如權(quán)利要求2所述的加強(qiáng)了toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于:所述的腺苷琥珀酸合成酶編碼基因toyG整合入原始菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體。
6.一種如權(quán)利要求2所述的加強(qiáng)了 toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu)建方法，其特征在于，過程如下: 1)構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-toyG； 2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，利用PIB139載體上的啟動(dòng)子permE*啟動(dòng)toyG基因的表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139-toyG特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌{Streptomyces di as ta tochromogenes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。
8.一種利用 如權(quán)利要求2所述的加強(qiáng)了 toyG表達(dá)的重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的用途，其特征在于，與原始菌株相比，重組菌腺苷琥珀酸合成酶酶活至少提高了 1.2倍，豐加霉素產(chǎn)量至少提高了 27.1%。
【文檔編號】C12P19/40GK103820473SQ201310168048
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月8日
【發(fā)明者】馬正, 俞曉平, 陶立彬, 申屠旭萍, 邊亞琳, 郝培應(yīng), 許益鵬 申請人:中國計(jì)量學(xué)院