OsCIPK23蛋白在培育耐低鉀脅迫植物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了OsCIPK23蛋白在培育耐低鉀脅迫植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將OsCIPK23蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮玫睫D(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物對低鉀逆境脅迫的耐受能力高于所述目的植物和/或所述轉(zhuǎn)基因植物吸收鉀離子的能力高于所述目的植物。本發(fā)明可用于提高植物耐低鉀能力，為培育適用于鉀貧瘠土壤的水稻新品種提供了保障。
【專利說明】0sCIPK23蛋白在培育耐低鉀脅迫植物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及0sCIPK23蛋白在培育耐低鉀脅迫植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鉀是植物生長發(fā)育所必需的三大營養(yǎng)元素(氮、磷、鉀)之一，也是植物體內(nèi)含量最豐富的一價陽離子。許多植物對鉀的需求量都很大，有些植物體內(nèi)鉀含量可高達5%-10%。鉀以可溶性無機鹽或離子形式存在于植物體內(nèi)，具有分布廣、含量高、移動性強等特點，主要集中在生命活動最旺盛的部位(通常優(yōu)先分布于芽、幼葉、上部莖和根尖等生長活動旺盛的器官與組織中)。
[0003]鉀并不直接參與任何有機物質(zhì)的形成，但參與調(diào)節(jié)酶的活性，具有促進氮吸收和蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)韌皮部溶質(zhì)運輸、影響光合作用、調(diào)節(jié)細胞膨壓和滲透勢、維持細胞電荷平衡等作用，對植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量形成具有重要影響。
[0004]植物主要通過根從土壤中以離子的形式吸收鉀，隨著人們逐年累月的耕作，土壤中的鉀離子逐漸匱乏。我國鉀鹽資源少，主要依靠進口，價格昂貴，作物不能充分吸收環(huán)境中的鉀時又會造成嚴重的環(huán)境危害。植物通過一系列的低鉀脅迫信號物質(zhì)、鉀通道和鉀轉(zhuǎn)運體以及它們的調(diào)控因子響應(yīng)對鉀營養(yǎng)的需求。
[0005]水稻作為全球重要的糧食作物，生產(chǎn)中面臨很嚴重的鉀缺乏問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供0sCIPK23蛋白在培育耐低鉀脅迫植物中的應(yīng)用。
`[0007]本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將0sCIPK23蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物對低鉀逆境脅迫的耐受能力高于所述目的植物和/或所述轉(zhuǎn)基因植物吸收鉀離子的能力高于所述目的植物；所述0sCIPK23蛋白是如下(a)或(b)或(c): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)；(C)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物鉀離子吸收能力相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
[0008]所述0sCIPK23蛋白的編碼基因可為如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)的DNA分子:(I)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子；(4)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植株鉀離子吸收相關(guān)蛋白的DNA分子；(5)與(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物鉀離子吸收相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC,
0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC、0.1%SDS各洗膜一次。[0009]所述0sCIPK23蛋白的編碼基因可通過重組表達載體導(dǎo)入所述目的植物?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述編碼基因構(gòu)建重組表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用所述編碼基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學(xué)試劑標記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達載體具體可為在1301-Ubiq質(zhì)粒的Bam HI和Kpn I酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙 子葉植物具體可為擬南芥，如cipk23突變體。
[0010]所述低鉀具體可為K+濃度為100 μ M以下。
[0011]所述低鉀逆境脅迫具體可為下低鉀培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述低鉀培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基的差異僅在于:去除 1.9g ΚΝ03、1.65g NH4NO3、0.332g CaCl2 和 0.17g KH2PO4,加入706mgCa (NO3) 2 和 IMmg NH4H2PO4。
[0012]本發(fā)明還保護一種培育轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括如下步驟:將抑制水稻中所述0sCIPK23蛋白的編碼基因表達的物質(zhì)導(dǎo)入出發(fā)水稻，得到轉(zhuǎn)基因水稻；所述轉(zhuǎn)基因水稻對低鉀逆境脅迫耐受能力低于所述出發(fā)水稻和/或所述轉(zhuǎn)基因水稻吸收鉀離子的能力低于所述出發(fā)水稻。
[0013]所述“抑制水稻中所述0sCIPK23蛋白的編碼基因表達的物質(zhì)”具體可為RNAi干擾載體。所述RNAi干擾載體可為含有DNA分子甲和DNA分子乙的重組質(zhì)粒；所述DNA分子甲如序列2自5’末端第365-826位核苷酸所示，所述DNA分子乙與所述DNA分子甲反向互補。所述RNAi干擾載體具體可為如下重組質(zhì)粒:以PTCK303質(zhì)粒為骨架載體，其SpeI和SacI酶切位點之間具有所述DNA分子甲，其KpnI和BamHI酶切位點之間具有所述DNA分子乙。
[0014]所述出發(fā)水稻具體可為水稻品種日本晴。
[0015]所述低鉀具體可為K+濃度為100 μ M以下。
[0016]本發(fā)明還保護所述0sCIPK23蛋白或其編碼基因在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥，如cipk23突變體。
[0017]本發(fā)明還保護所述0sCIPK23蛋白或其編碼基因在培育吸收鉀離子的能力增高的植物中的應(yīng)用。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥,如cipk23突變體。
[0018]本發(fā)明還保護所述0sCIPK23蛋白、所述0sCIPK23蛋白的編碼基因或以上任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明還保護所述0sCIPK23蛋白在調(diào)節(jié)OsAKTl蛋白活性中的應(yīng)用。所述OsAKTl蛋白具體可為序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子編碼的蛋白質(zhì)。所述應(yīng)用中，所述調(diào)節(jié)作用是在OsCBLl蛋白存在的條件下進行的。所述OsCBLl蛋白具體可為序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子編碼的蛋白質(zhì)，
[0020]本發(fā)明公開了水稻0sCIPK23蛋白及其編碼基因的工程應(yīng)用，特別公開了其在提高植物對土壤中有效鉀利用效率方面的應(yīng)用。0sCIPK23蛋白在水稻中負責(zé)調(diào)控從土壤中吸收K+。0sCIPK23基因的敲除突變體導(dǎo)致水稻對K+的吸收顯著減少，并出現(xiàn)明顯的缺鉀褐斑。0sCIPK23基因過表達植物對K+的吸收能力大大增加。本發(fā)明可用于提高植物耐低鉀能力，為培育適用于鉀貧瘠土壤的水稻新品種提供了保障。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ]圖1為實施例2的步驟四中的PCR擴增產(chǎn)物的0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0022]圖2為實施例2的步驟五中的照片。
[0023]圖3為實施例2的步驟五中的冠部的K+含量。
[0024]圖4為實施例3的步驟四中的分子鑒定結(jié)果。
[0025]圖5為實施例3的步驟四中的照片。
[0026]圖6為實施例3的步驟四中的`冠部的K+含量。
[0027]圖7為實施例4中的單個細胞電流圖。
[0028]圖8為實施例4中的1-V曲線。
【具體實施方式】
[0029]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0030]哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-O):TAIR 網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.0rg/)0
[0031]cipk23突變體(即文獻中的“l(fā)ksl-3T_DNA插入突變體”):參考文獻:Xu J，LiHD, Chen LQ, Wang Y, Liu LL, Wu WH.(2006)A protein kinase, interacting with twocalcineurin B-1ike proteins, regulates K+transporter AKTlin Arabidopsis.Cell,125:1347-1360 ;該突變體植株的出發(fā)植株為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。
[0032]1301-Ubiq 質(zhì)粒:參考文獻:Baisheng Yu, Zhongwei Linl, Haixia Li, XiaojiaoLi, Jiayang Li, Yonghong Wang, Xia Zhang, Zuofeng Zhu, Wenxue Zhai, Xiangkun Wang,Daoxin Xie and Chuanqing Sun.(2007)TACl, a major quantitative trait locuscontrolling tiller angle in rice.The Plant Journal52,891 - 898 ;1301_Ubiq質(zhì)粒是將ubiquitin啟動子插入pCAMBIA1301的Pst I酶切位點得到的質(zhì)粒。
[0033]農(nóng)桿菌菌株GV3101:參考文獻:R.Berres，L.0tten，B.Tinland，E.Malgarin1-Clog, B.Walter.(1992)Transformation of vitis tissue by differentstrains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant CellReportslI,192-195。
[0034]水稻品種日本晴:購買自RiceGE韓國突變體種子庫(http://signal.salk.edu/cg1-bin/RiceGE)。
[0035]PTCK3O3質(zhì)粒:參考文獻:Wenqiang Yang, Zhaosheng Kong,Edith Omo-1kerodah,Wenying Xu, Qun Li, Yongbiao Xue.(2008)Calcineurin B-1ike interacting proteinkinase 0sCIPK23functions in pollination and drought stress responses inrice(Oryza sativa L.).Journal of Genetics and Genomics35,531-543。
[0036]農(nóng)桿菌菌株EHA105:參考文獻:Jeroen S.C.van Roekel, Brigitte Damm, LeoS.Melchers,and Andr6Hoekema.(1993)Factors influencing transformation frequencyof tomato(Lycopersicon esculentum).Plant Cell Reports,12:644-647。
[0037]實施例1、0sCI PK23蛋白及其編碼基因的獲得
[0038]在TIGR 網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu)上得到一段 DNA 序列(來源自水稻品種“Nipponbare”),該DNA序列編碼序列表的序列I所不的蛋白質(zhì)。
[0039]將序列表的序列I所不的蛋白質(zhì)命名為0sCIPK23蛋白(由450個氣基酸殘基組成)。將編碼0sCIPK23蛋白的基因命名為0sCIPK23基因，其基因組序列中具有14個外顯子和13個內(nèi)含子，其cDNA序列中的開放閱讀框如序列表的序列2所示。
[0040]實施例2、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型檢測
[0041]一、過表達載體構(gòu)建
[0042]1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0043]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用0sCIPK23_UN1301F和0sCIPK23-UN1301R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0044]0sCIPK23-UN1301F:5’ - TTGGATCCATGAGCGTGTCGGGCGGGA-3?；
[0045]0sCIPK23-UN1301R:5’ - TTGGTACCTCACGGTGACCTCCGATGCT-3’。
[0046]3、用限制性內(nèi)切酶Bam HI和Kpn I雙酶切步驟2的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0047]4、用限制性內(nèi)切酶Bam HI和Kpn I雙酶切1301-Ubiq質(zhì)粒，回收載體骨架(約11800bp)。
[0048]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒進行結(jié)構(gòu)描述如下:在1301-Ubiq質(zhì)粒的Bam HI和Kpn I酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0049]二、過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥
[0050]1、將步驟一得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。
[0051]2、將步驟I得到的重組農(nóng)桿菌采用花浸泡法(Clough and Bent.(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J16:735-743.)轉(zhuǎn)化侵染 cipk23 突變體，收獲 T1 代種子。
[0052]3、將T1代植株自交并收獲種子(T2代種子)，將T2代種子培育為T2代植株。
[0053]4、將T2代植株在含50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行抗性篩選，對于某一 T1代植株，如果其T2代植株在抗性篩選中顯示3:1的分離比，該T1代植株為單拷貝的0sCIPK23基因過表達植株。
[0054]5、將單拷貝的0sCIPK23基因過表達植株的T2代植株自交并收獲種子(T3代種子)，將T3代種子培育為T3代植株。
[0055]6、將隨機抽樣的T3代植株在含50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行抗性篩選，對于某一 T2代植株，如果其T3代植株均為抗性植株，該T2代植株為純合的0SCIPK23基因過表達植株，該植株及其自交后代為一個0sCIPK23基因過表達株系。
[0056]隨機選取的2個0sCIPK23基因過表達株系(株系1、株系2)進行后續(xù)試驗。
[0057]三、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的獲得
[0058]用1301-Ubiq質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒進行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體植株。
[0059]四、轉(zhuǎn)基因擬南芥材料PCR鑒定
[0060]將株系I的T3代植株、株系2的T3代植株、cipk23突變體、哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的一周齡苗分別進行如下操作:取整株幼苗，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用0sCIPK23-UN1301F和0sCIPK23_UN1301R組成的引物對(靶序列約為1400bp)鑒定0sCIPK23基因的表達量，采用Primerl和Primer2組成的引物對(靶序列約為600bp)鑒定AtEF基因(看家基因)的表達量，采用Primer3和Primer4組成的引物對(靶序列約為1500bp)鑒定AtCIPK23的表達量。
[0061]Primerl:5，-ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3，；
[0062]Primer2:5， -TTGGCGGCACCCTTACGTGGATCA-3，。
[0063]Primerf:5’ -ATGGCTTC`TCGAACAACGCCTT-3，；
[0064]Primer4:5，-TTATGTCGACTGTTTTGCAATT-3，。
[0065]PCR擴增產(chǎn)物的0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1，泳道I為株系2，泳道2為株系I，泳道3為cipk23突變體，泳道4為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。
[0066]五、耐逆性鑒定
[0067]將株系I的T3代種子、株系2的T3代種子、轉(zhuǎn)空載體植株的T3代種子、cipk23突變體的種子和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子分別進行如下鑒定:將種子放置于MS培養(yǎng)基，22°C光照(光強60 μ mol.m_2.s—1)培養(yǎng)4天；然后將幼苗等分為兩組，分別移至MS培養(yǎng)基和低鉀培養(yǎng)基，繼續(xù)22°C光照(光強60 μ mol.m_2.s—1)，從分組開始第7天檢測K+含量，第10天觀察表型并拍照。
[0068]MS 培養(yǎng)基:將 1.65g NH4NO3'1.9g ΚΝ03、0.17g KH2PO4、0.37g MgSO4.7H20、
0.332gCaCl2>22.3mg MnSO4.4H20、8.6mg ZnSO4.7H20、0.025mg CoCl2.6H20、0.025mgCuSO4.5Η20、0.025mg Na2MoO4.2Η20、0.83mg K1、6.2mg H3BO3, 27.8mg FeSO4.7Η20 和 37.3mg
Na2EDTA溶于水并用水定容至1L。
[0069]低鉀培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基的差異僅在于:去除1.9g KN03、1.65g NH4NO3'0.332gCaCl2 和 0.17g KH2PO4，加入 706mg Ca(NO3)2 和 144mg NH4H2PO4。
[0070]K+含量的測定的方法如下:
[0071](I)將全植株用雙蒸水清洗干凈，將地上部分放置于80°C烘箱中烘干一天，至其重量恒定；
[0072](2)將烘干的地上部分在分析天平上稱量并記錄干重，然后分別放入坩堝內(nèi)；
[0073](3)將坩堝放入馬弗爐中，300°C烘烤I小時，然后調(diào)至575°C再烘烤7小時，關(guān)閉馬弗爐，待其冷卻至200°C以下后取出坩堝；
[0074](4)每個坩堝中加IOmL0.1M HCl水溶液，以溶解剩余物；
[0075](5)將步驟(4)得到的溶液用0.1M HCl水溶液稀釋后作為待測溶液；
[0076](6)用Z2000型原子吸收分光光度計面積法(采用KCl制作標準曲線)測定待測溶液中的K+濃度；
[0077](7)換算每g干重的植物材料中含有多少mmol鉀離子。
[0078]進行三次重復(fù)實驗，每次重復(fù)實驗中MS培養(yǎng)基上取60株植株，低鉀培養(yǎng)基上取120株植株，結(jié)果取平均值。
[0079]照片見圖2 (低鉀培養(yǎng)基中，各個株系的位置與MS培養(yǎng)基中的標注相同)。在MS培養(yǎng)基中，各個株系的表型均沒有顯著差異。在低鉀培養(yǎng)基中，株系1、株系2和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的生長狀態(tài)均顯著優(yōu)于cipk23突變體，株系1、株系2和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的表型無顯著差異，轉(zhuǎn)空載體植株和cipk23突變體的表型沒有顯著差異。
[0080]冠部的K+濃度見圖3。根部的K+濃度見圖4。在MS培養(yǎng)基中，株系1、株系2和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥冠部的K+含量均高于cipk23突變體，轉(zhuǎn)空載體植株和cipk23突變體冠部的K+含量沒有顯著差異。在低鉀培養(yǎng)基中，株系1、株系2和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥冠部的K+含量均高于cipk23突變體，轉(zhuǎn)空載體植株和cipk23突變體冠部的K+含量沒有顯著差異。
[0081]實施例3、轉(zhuǎn)基因水稻植株表型檢測
[0082]一、RNAi載體構(gòu)建
[0083]1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0084]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用0sCIPK23_pTCK303F和0sCIPK23-pTCK303R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0085]0sCIPK23-pTCK303F:5’ -GGGGTACCACTAGTACGCTGTCGATTACTGTCA-3> ；
[0086]0sCIPK23-pTCK303R: 5，-CGGGATCCGAGCTCTTGGAGGCTGATATCCC-3，。
[0087]3、用限制性內(nèi)切酶SpeI和SacI雙酶切步驟2的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0088]4、用限制性內(nèi)切酶SpeI和SacI雙酶切pTCK303質(zhì)粒，回收載體骨架(約11800bp)。
[0089]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。
[0090]6、用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI雙酶切步驟2的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0091]7、用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI雙酶切步驟5得到的重組質(zhì)粒，回收載體骨架(約 12300bp)o
[0092]8、將步驟6的酶切產(chǎn)物和步驟7的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒進行結(jié)構(gòu)描述如下:以PTCK303質(zhì)粒為骨架載體，其SpeI和SacI酶切位點之間具有序列表的序列2自5’末端第365-826位核苷酸所示的雙鏈DNA分子甲，其KpnI和BamHI酶切位點之間具有與所述雙鏈DNA分子甲反向互補的雙鏈DNA分子乙。
[0093]二、RNAi載體轉(zhuǎn)化水稻
[0094]1、將步驟一得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105，得到重組農(nóng)桿菌。
[0095]2、將步驟 I 得到的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(Kong，Z.S.，Li，Μ.N.，Yang, ff.Q.，Xu,ff.Y., and Xue, Y.B.(2006).A novel nucIear-localized CCCH-type zinc fingerprotein， OsDOS， is involved in delaying leaf senescence in rice.PlantPhysiol.141:1376-1388.)水稻品種日本晴的愈傷組織，收獲T1代種子。
[0096]3、將T1代植株自交并收獲種子(T2代種子)，將T2代種子培育為T2代植株。
[0097]4、將T2代植株在含50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上進行抗性篩選，對于某一 T1代植株，如果其T2代植株在抗性篩選中顯示3:1的分離比，該T1代植株為單拷貝的0sCIPK23基因RNAi植株。
[0098]5、將單拷貝的0sCIPK23基因RNAi植株的T2代植株自交并收獲種子(T3代種子)，將T3代種子培育為T3代植株。
[0099]6、將T3代植株在含50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上進行抗性篩選，對于某一 T2代植株，如果其T3代植株均為抗性植株，該T2代植株為純合的0SCIPK23基因RNAi植株，該植株及其自交后代為一個0sCIPK23基因RNAi株系。
[0100]隨機選取的2個0SCIPK23基因RNAi株系(株系3、株系4)進行后續(xù)試驗。
[0101]三、轉(zhuǎn)空載體水稻的獲得
[0102]用PTCK303質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒進行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體植株。
[0103]四、耐逆性鑒定
[0104]將株系3的T3代種子、株系4的T3代種子、轉(zhuǎn)空載體植株的T3代種子和水稻品種日本晴的種子分別進行如下鑒定:將種子放置于玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙上，12h光照(28°C )/12h黑暗(25°C)的條件下培養(yǎng)7天，然后移苗至正常水培液中在相同條件下培養(yǎng)一周；然后將幼苗等分為兩組，分別移苗至正常水培液和低鉀水培液，在相同條件下培養(yǎng)7天；然后觀察表型并拍照，分子鑒定，檢測K+含量。
[0105]正常水培液的配制方法:114.25mg NH4NO3>50.38mg NaH2PO4.2Η20、89.25mg K2SO4,110.75mg CaCl2、405mg MgSO4.7Η20、1.88mg MnCl2.4Η20、92.5 μ g(NH4)6Mo7024.4Η20、1.17mgΗ3Β03、437μ g ZnSO4.7Η20、388μ g CuSO4.5Η20、34.75mg FeSO4.7Η20、46.53mgNa2EDTA，用去離子水定容至1L，用NaOH調(diào)節(jié)pH為5.70-5.80。
[0106]正常水培液中的K+濃度約為ImM。
[0107]低鉀水培液的配制方法:改變K2SO4的加入量，其它均同正常水培液。
[0108]低鉀水培液中的K+濃度為100 μ M0
[0109]分子鑒定中，提取幼苗根部的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，采用0sCIPK23-UN1301F和0sCIPK23_UN1301R組成的引物對鑒定0sCIPK23基因的表達量，采用Primer5和Primer6組成的引物對靶序列約為600bp)鑒定OsACTIN基因(看家基因)的表達量。
[0110]Primer5:5’ -TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’ ；
[0111]Primer6:5’ -GTACCCGCATCAGGCATCTG-3’。
[0112]K+含量的測定的方法的測定方法同實施例2。
[0113]分子鑒定結(jié)果見圖4。
[0114]照片見圖5。無論采用正常水培液還是采用低鉀水培液，水稻品種日本晴的長勢均優(yōu)于株系3和株系4，水稻品種日本晴的長勢與轉(zhuǎn)空載體植株沒有顯著差異。
[0115]冠部的K+濃度見圖6。無論采用正常水培液還是采用低鉀水培液，水稻品種日本晴的冠部的K+濃度均高于株系3和株系4。[0116]實施例4、0sCIPK23蛋白在哺乳動物細胞中能夠增大OsAKTl的內(nèi)向鉀電流
[0117]一、轉(zhuǎn)染載體構(gòu)建
[0118]1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子并作為模板，用0sCIPK23_F和0sCIPK23-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(0sCIPK23)。
[0119]0sCIPK23-F:5’ -AAGCTTATGAGCGTGT CGGGCG-3’ ；
[0120]0sCIPK23-R:5’ -TCTAGATCACGGTGAC CTCCGATGC-3’。
[0121]2、合成序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子并模板，用OsCBLl-F和OsCBLl-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(OsCBLl)。
[0122]OsCBLl-F:5，-CTCGAGATGGGGTGCT TCCAGTCGAC-3，；
[0123]OsCBLl-R:5，-CGAATTCTGTGACG AGATCATCAACCTC-3，。
[0124]3、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子并模板，用OsAKTl-F和OsAKTl-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(OsAKTl)。
[0125]OsAKTl-F:5’ -GAATTCATGGCGAGGT GGGGCGC-3’ ；
[0126]OsAKT1-R: 5 ’ -TCTAGACTAGCTCTTGCCTTTCATCTTCTCTG-3，。
[0127]4、用限制性內(nèi)切酶Hind III和Xba I雙酶切0sCIPK23，用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR I雙酶切OsCBLl，將其依次連入pBudCE4.1載體，得到重組質(zhì)粒A。
[0128]5、用限制性內(nèi)切酶EcoR` I和Hind III雙酶切OsAKTl以及pCDNA3.1質(zhì)粒，將兩種回收產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒B。
[0129]二、細胞復(fù)蘇
[0130]1、凍存的HEK293細胞于37°C水浴鍋中解凍Imin (使大部分化凍，少部分保留冰晶)。
[0131]2、吸取細胞到15mL離心管，緩慢加入5_7mL DMEM培養(yǎng)液，混勻。
[0132]3、900r/min 離心 5min。
[0133]4、棄上清，用2mL預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)液吹吸均勻，轉(zhuǎn)入相應(yīng)的培養(yǎng)皿(一般I傳I或I傳2)，畫十字搖勻，放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱。
[0134]三、細胞傳代
[0135]1、吸棄培養(yǎng)皿中的上清，用無鈣鎂的PBS緩沖液洗2-3次，貼壁加液。
[0136]2、加入胰蛋白酶消化液，37°C消化l_2min，用手指輕彈皿底以幫助分散細胞。
[0137]3、加入含有血清的DMEM培養(yǎng)液，以終止反應(yīng)。
[0138]4、輕輕吹起細胞，吹散，轉(zhuǎn)移至離心管。
[0139]5、900r/m離心5min，棄上清，加入適量DEME培養(yǎng)液，輕輕吹散細胞團，分入3至6個培養(yǎng)皿中，前后左右搖勻細胞，使其均勻散開，放入溫箱。
[0140]四、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細胞
[0141]1、轉(zhuǎn)染前24小時，進行細胞傳代，至轉(zhuǎn)染前細胞匯合度達到60%以上，以80%為且。
[0142]2、轉(zhuǎn)染前I小時，為細胞更換新鮮培養(yǎng)液，注意要盡量輕柔。
[0143]3、將質(zhì)粒DNA (重組質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒B)和轉(zhuǎn)染試劑lipfection2000分別用不含血清的培養(yǎng)液稀釋至一定體積，輕輕混勻。
[0144]4、室溫放置5min，將含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液逐滴加入含有質(zhì)粒DNA的培養(yǎng)液，輕混勻，室溫放置20分鐘-30分鐘
[0145]5、輕混勻，將混合的培養(yǎng)液逐滴加入細胞培養(yǎng)皿中，放回溫箱。
[0146]6、4至6小時后更換為新鮮完全培養(yǎng)液。
[0147]五、膜片鉗記錄
[0148]1、轉(zhuǎn)染后的細胞用胰蛋白酶處理后，于160g離心5min，置于冰上。
[0149]2、挑選具有綠色 GFP 突光的細胞，用 Axopatch200B amplifier (AxonInstruments)進行全細胞模式記錄。
[0150]單個細胞電流圖見圖7，1-V曲線見圖8。0sCIPK23在OsCBLl存在的情況下，可以顯著增大OsAKTl的內(nèi)向鉀電流，說明0sCIPK23對鉀通道OsAKTl的活性具有一定的調(diào)節(jié)作
用。·
【權(quán)利要求】
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將0SCIPK23蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物對低鉀逆境脅迫的耐受能力高于所述目的植物和/或所述轉(zhuǎn)基因植物吸收鉀離子的能力高于所述目的植物； 所述OsCIPK23蛋白是如下(a)或(b)或(c): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； (C)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物鉀離子吸收能力相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述OsCIPK23蛋白的編碼基因為如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子； (4)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植株鉀離子吸收相關(guān)蛋白的DNA分子; (5)與(1)限定的DNA序列具 有90%以上同源性且編碼植物鉀離子吸收相關(guān)蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
4.一種培育轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括如下步驟:將抑制水稻中OsCIPK23蛋白的編碼基因表達的物質(zhì)導(dǎo)入出發(fā)水稻，得到轉(zhuǎn)基因水稻；所述轉(zhuǎn)基因水稻對低鉀逆境脅迫耐受能力低于所述出發(fā)水稻和/或所述轉(zhuǎn)基因水稻吸收鉀離子的能力低于所述出發(fā)水稻； 所述OsCIPK23蛋白是如下(a)或(b)或(c): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； (C)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物鉀離子吸收能力相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述OsCIPK23蛋白的編碼基因為如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子； (4)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植株鉀離子吸收相關(guān)蛋白的DNA分子; (5)與(1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物鉀離子吸收相關(guān)蛋白的DNA分子。
6.0sCIPK23蛋白或其編碼基因在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用； 所述OsCIPK23蛋白是如下Ca)或(b)或(c): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； (C)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物鉀離子吸收能力相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述OsCIPK23蛋白的編碼基因為如下(I)或(2)或(3)或(4)或(5)的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子； (4)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植株鉀離子吸收相關(guān)蛋白的DNA分子; (5)與(I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物鉀離子吸收相關(guān)蛋白的DNA分子。
8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.權(quán)利要求1至5中任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。
10. 0sCIPK23在調(diào)節(jié)OsAKTl蛋白活性中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/84GK103451227SQ201310392165
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】王毅, 武維華, 李娟 , 龍雨 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)