新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物及其pcr鑒別方法
【專利摘要】一種新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物及其PCR鑒別方法，上游引物：5'-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3'；下游引物：5'-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3'。采用酚-氯仿-異戊醇抽提法提取新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭基因組DNA；反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系為25μL，成分為上、下游引物、10×Buffer、dNTP、rTaqDNA聚合酶，進行PCR擴增；在瓊脂糖凝膠上將PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，通過電泳圖譜判斷梅花鹿鹿鞭和新西蘭赤鹿鹿鞭真?zhèn)?。該鑒別方法分辨力強、重現(xiàn)性好，保障群眾用藥安全，彌補傳統(tǒng)中藥鑒定中動物類中藥鑒別的弱項，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物及其PCR鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物及其PCR鑒別方法。
技術(shù)背景
[0002]鹿鞭又名鹿腎，鹿沖，主要治療陽痿、腎虛耳鳴、婦人子宮寒冷、久不受孕、慢性睪丸發(fā)炎等疾病。梅花鹿鹿鞭藥用價值高但市場價格昂貴，新西蘭赤鹿鹿鞭與梅花鹿鹿鞭外觀和形狀相似而且價格低廉，但新西蘭赤鹿鹿鞭的藥用價值遠遠不及梅花鹿鹿鞭，由于梅花鹿鹿鞭和新西蘭赤鹿鹿鞭通過肉眼很難分辨，市場上一些不法商家為謀取更高的經(jīng)濟利益，以新西蘭赤鹿鹿鞭冒充梅花鹿鹿鞭進行銷售，嚴(yán)重影響了鹿鞭的藥效，并且造成患者健康受損以及經(jīng)濟損失。由于中成藥的組成及成分復(fù)雜，干擾因素多，用傳統(tǒng)生藥學(xué)方法鑒定其真?zhèn)渭凹兌扔休^大的難度，因此，目前還沒有一種比較快速靈敏、準(zhǔn)確可靠、分辨力強、重現(xiàn)性好的新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速靈敏、準(zhǔn)確可靠、分辨力強、重現(xiàn)性好的新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物及其PCR鑒別方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物，引物序列為:
上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
[0005]一種新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鑒別方法，其具體步驟如下:
1.1、新西蘭赤鹿鹿鞭與梅花鹿鹿鞭的基因組DNA提取方法
將新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分別用酒精處理干凈，采用酚-氯仿-異戊醇抽提法提取新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA ；
1.2、用于擴增的樣品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ；
1.3、用于擴增的PCR反應(yīng)體系和擴增條件
PCR反應(yīng)體系:取50ng/ μ L的新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA是2 μ L，IOX PCR 的 Buffer 是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 2 μ L，IOpM/ μ L 的上游引物和下游引物各I μ L,5U/y L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L,用滅菌去離子水補充至25 μ L ;
擴增條件:94.(TC預(yù)變性 8min ；94.(TC變性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35個循環(huán)；72.(TC延伸lOmin，得PCR擴增產(chǎn)物，4°C保存；
1.4、PCR擴增產(chǎn)物的檢測方法
在水平電泳槽中制備質(zhì)量百分比濃度為1.5%~1.8%的瓊脂糖凝膠；將步驟1.3中的PCR擴增產(chǎn)物5μ1加入點樣孔，在對比孔中加入5 μ? Marker DL 2000作為對比，其中，電泳電壓為120V，電泳時間為40 min~60min ；
1.5、通過電泳圖譜判斷梅花鹿鹿鞭和新西蘭赤鹿鹿鞭
PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有三條特異性條帶、在1000bp沒有特異性條帶、在IOObp~250bp有兩條特異性條帶的是梅花鹿鹿鞭；
PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有兩條特異性條帶、在1000bp有一條特異性條帶、在IOObp~250bp有一條特異性條帶的是新西蘭赤鹿鹿鞭。
[0006]本發(fā)明的有益效果:
用DNA分子標(biāo)記進行鑒別梅花鹿的鹿鞭與新西蘭赤鹿鹿鞭操作步驟簡單、快速靈敏，只需取極少量的樣品就能提得足夠用量的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增的DNA模板，然后進行鑒別判定。該鑒別方法分辨力強、重現(xiàn)性好，可以澄清梅花鹿鹿鞭及其粉劑的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，減少了偽劣的中藥材新西蘭赤鹿鹿鞭給患者造成的經(jīng)濟損失以及健康的不良后果，保障群眾用藥安全具有中藥意義，彌補傳統(tǒng)中藥鑒定中動物類中藥鑒別的弱項，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1是本發(fā)明梅花鹿鹿鞭和新西蘭赤鹿鹿鞭的電泳結(jié)果圖。
[0008]圖中:1-3為新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物，4-6為梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物，M-是Marker DL 2000。
【具體實施方式】
[0009]實施例1
新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物，引物的設(shè)計是根據(jù)梅花鹿的ISSrRNA基因序列(GenBank登錄號是AY225108)來設(shè)計出引物，引物序列為:
上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
[0010]新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鑒別方法，其具體步驟如下:
1.1、新西蘭赤鹿鹿鞭與梅花鹿鹿鞭的基因組DNA提取方法
將新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分別用酒精處理干凈，取梅花鹿鹿鞭組織2g，取新西蘭赤鹿鞭組織2g，采用酚-氯仿-異戊醇抽提法提取新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA;
1.2、用于擴增的樣品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ；
1.3、用于擴增的PCR反應(yīng)體系和擴增條件
PCR反應(yīng)體系:取50ng/ μ L的新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA是2 μ L，10 X PCR 的 BuffeK 10 倍的 PCR 的 Buffer)是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 2 μ L，IOpM/μ L的上游引物和下游引物各I μ L，5U/ μ L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L，用滅菌去離子水補充至25yL；擴增條件:94.(TC預(yù)變性 8min ；94.(TC變性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35個循環(huán)；72.(TC延伸lOmin，得PCR擴增產(chǎn)物，4°C保存；
1.4、PCR擴增產(chǎn)物的檢測方法
在水平電泳槽中制備質(zhì)量百分比濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠；將步驟1.3中的PCR擴增產(chǎn)物5μ1加入點樣孔，在對比孔中加入5 μ? Marker DL2000作為對比，其中，電泳電壓為120V,電泳時間為40 min ；
1.5、通過電泳圖譜判斷梅花鹿鹿鞭和新西蘭赤鹿鹿鞭 電泳結(jié)果如圖1所示，梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有三條特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有兩條特異性條帶；
梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在1000bp沒有特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在1000bp有一條特異性條帶；
梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在IOObp~250bp有兩條特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在IOObp~250bp有一條特異性條帶。
[0011]實施例2
新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物，引物序列為:
上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
[0012]新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鑒別方法，其具體步驟如下:
1.1、新西蘭赤鹿鹿鞭與梅花鹿鹿鞭的基因組DNA提取方法
將新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分別用酒精處理干凈，取梅花鹿鹿鞭組織2g，取新西蘭赤鹿鞭組織2g，采用酚-氯仿-異戊醇抽提法提取新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA ；
1.2、用于擴增的樣品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ；
1.3、用于擴增的PCR反應(yīng)體系和擴增條件
PCR反應(yīng)體系:取50ng/ μ L的新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA是2 μ L，IOX PCR 的 Buffer 是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 2 μ L，IOpM/ μ L 的上游引物和下游引物各I μ L, 5U/ μ L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L,用滅菌去離子水補充至25 μ L ;
擴增條件:94.(TC預(yù)變性 8min ;94.(TC變性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35個循環(huán)；72.(TC延伸lOmin，得PCR擴增產(chǎn)物，4°C保存；
1.4、PCR擴增產(chǎn)物的檢測方法
在水平電泳槽中制備質(zhì)量百分比濃度為1.8%的瓊脂糖凝膠；將步驟1.3中的PCR擴增產(chǎn)物5μ1加入點樣孔，在對比孔中加入5 μ? Marker DL 2000作為對比，其中，電泳電壓為120V,電泳時間為50min ；
1.5、通過電泳圖譜判斷梅花鹿鹿鞭和新西蘭赤鹿鹿鞭
梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有三條特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有兩條特異性條帶；梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在1000bp沒有特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在1000bp有一條特異性條帶；
梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在IOObp~250bp有兩條特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在IOObp~250bp有一條特異性條帶。
[0013]實施例3
新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物，引物序列為:
上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
[0014]新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鑒別方法，其具體步驟如下:
1.1、新西蘭赤鹿鹿鞭與梅花鹿鹿鞭的基因組DNA提取方法
將新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分別用酒精處理干凈，取梅花鹿鹿鞭組織2g，取新西蘭赤鹿鞭組織2g，采用酚-氯仿-異戊醇抽提法提取新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA ；
1.2、用于擴增的樣品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ；
下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ；
1.3、用于擴增的PCR反應(yīng)體系和擴增條件
PCR反應(yīng)體系:取50ng/ μ L的新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA是2 μ L，IOX PCR 的 Buffer 是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 2 μ L，IOpM/ μ L 的上游引物和下游引物各I μ L, 5U/ μ L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L,用滅菌去離子水補充至25 μ L ;
擴增條件:94.(TC預(yù)變性 8min ;94.(TC變性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35個循環(huán)；72.(TC延伸lOmin，得PCR擴增產(chǎn)物，4°C保存；
1.4、PCR擴增產(chǎn)物的檢測方法
在水平電泳槽中制備質(zhì)量百分比濃度為1.6%的瓊脂糖凝膠；將步驟1.3中的PCR擴增產(chǎn)物5μ1加入點樣孔，在對比孔中加入5 μ? Marker DL2000作為對比，其中，電泳電壓為120V,電泳時間為50min ；
1.5、通過電泳圖譜判斷梅花鹿鹿鞭和新西蘭赤鹿鹿鞭
梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有三條特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有兩條特異性條帶；
梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在1000bp沒有特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在1000bp有一條特異性條帶；
梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在IOObp~250bp有兩條特異性條帶，新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在IOObp~250bp有一條特異性條帶。
[0015]梅花鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果和新西蘭赤鹿鹿鞭PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果無論從帶型和片段的大小上，樣品之間都存在著差異，這是鑒定樣品真?zhèn)魏头N屬的多態(tài)性依據(jù)。
【權(quán)利要求】
1.一種新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的鑒別引物，其特征是: 引物序列為: 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ； 下游引物:5’ -CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’。
2.一種新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭的PCR鑒別方法，其特征是: 具體步驟如下:· 1.1、新西蘭赤鹿鹿鞭與梅花鹿鹿鞭的基因組DNA提取方法 將新西蘭赤鹿鹿鞭和梅花鹿鹿鞭分別用酒精處理干凈，采用酚-氯仿-異戊醇抽提法提取新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA ； · 1.2、用于擴增的樣品的PCR引物 上游引物:5’-TCTTTGCCGATGGTATAGGT-3’ ； 下游引物:5’-CGGACGAAACTTTGTGAGATTAA-3’ ； · 1.3、用于擴增的PCR反應(yīng)體系和擴增條件 PCR反應(yīng)體系:取50ng/ μ L的新西蘭赤鹿鹿鞭基因組DNA和梅花鹿鹿鞭基因組DNA是·2 μ L，IOX PCR 的 Buffer 是 2 μ L，2.5mM 的 dNTP 是 ·2 μ L，IOpM/ μ L 的上游引物和下游引物各I μ L,5U/y L的rTaqDNA聚合酶是0.2 μ L,用滅菌去離子水補充至25 μ L ; 擴增條件:94.0℃預(yù)變性 8min ;94.(TC變性 lmin，56.2°C延伸 lmin，72.(TC退火2min，共35個循環(huán)；72.(TC延伸lOmin，得PCR擴增產(chǎn)物，4°C保存； ·1.4、PCR擴增產(chǎn)物的檢測方法 在水平電泳槽中制備質(zhì)量百分比濃度為1.5%~1.8%的瓊脂糖凝膠；將步驟1.3中的PCR擴增產(chǎn)物5μ1加入點樣孔，在對比孔中加入5 μ? Marker DL 2000作為對比，其中，電泳電壓為120V，電泳時間為40 min~60min ； · 1.5、通過電泳圖譜判斷梅花鹿鹿鞭和新西蘭赤鹿鹿鞭 PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有三條特異性條帶、在1000bp沒有特異性條帶、在IOObp~250bp有兩條特異性條帶的是梅花鹿鹿鞭； PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果在250bp~500bp有兩條特異性條帶、在1000bp有一條特異性條帶、在IOObp~250bp有一條特異性條帶的是新西蘭赤鹿鹿鞭。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525935SQ201310495476
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】張敏, 蘇玉虹, 田玉民 申請人:張敏