一種從福爾馬林固定石蠟包埋組織中共分離dna和rna的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從福爾馬林固定石蠟包埋組織中共分離DNA和RNA的試劑盒及方法。本發(fā)明所述試劑盒可用于FFPE樣本中DNA和RNA的同時(shí)提取，其優(yōu)點(diǎn)不僅在于可以同時(shí)進(jìn)行核酸提取，節(jié)省時(shí)間，經(jīng)濟(jì)，快速，而且本發(fā)明可節(jié)約樣本量，能有效解決試驗(yàn)中缺少樣本的難題，還可以保證研究中使用的DNA和RNA的來(lái)源完全相同。本發(fā)明操作簡(jiǎn)捷，重復(fù)性高，得率高，2～5片腫瘤組織切片即可同時(shí)獲得足夠的DNA和RNA；獲得的核酸純度高，對(duì)后續(xù)的檢測(cè)無(wú)干擾；與常用試劑盒相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】—種從福爾馬林固定石蠟包埋組織中共分離DNA和RNA的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種共分離福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本DNA和RNA的試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自20世紀(jì)50年代Watson和Crick提出DNA雙螺旋模型以來(lái)，核酸就成為了生物學(xué)的研究重點(diǎn)，并產(chǎn)生了以DNA和RNA為主要研究對(duì)象的分子生物學(xué)學(xué)科，分子生物學(xué)在廣度和深度上都獲得空前的發(fā)展。近10年來(lái)，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)越來(lái)越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領(lǐng)域，為了解病理狀態(tài)下基因組的變化積累了新資料。福爾馬林固定石蠟包埋組織(formalin fixed and paraffin embedded tissues,FFPE,以下簡(jiǎn)稱 FFPE)是醫(yī)療機(jī)構(gòu)最常用的保存病理組織的方法。醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個(gè)可靠的分子生物學(xué)研究的材料來(lái)源。由于新鮮標(biāo)本難以得到，為進(jìn)行實(shí)體腫瘤分子生物學(xué)研究，對(duì)已有病例進(jìn)行回顧性研究時(shí)，只能從石蠟包埋組織中進(jìn)行基因提取，因此石蠟包埋組織就成為來(lái)源最豐富的珍貴資源。從FFPE樣品中分離出高純度高質(zhì)量的核酸是下游試驗(yàn)順利進(jìn)行的最基本前提。傳統(tǒng)方法中DNA和RNA的分離純化絕大部分都是單獨(dú)進(jìn)行的，同時(shí)提取DNA和RNA的方法較少，純度也低，耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足下游試驗(yàn)的要求。文獻(xiàn)中報(bào)道的提取方法主要有酚氯仿抽提法，離子交換法，鹽析法，硅膠柱法等，但這些方法往往只能提取出其中一種核酸而浪費(fèi)另一種核酸，且需使用到一些有毒試劑，如苯酚、氯仿等，不利于實(shí)驗(yàn)人員的身體健康。臨床上的分子生物學(xué)研究往往需要同時(shí)提取DNA和RNA，當(dāng)樣本有限時(shí)，則可能影響下游試驗(yàn)的進(jìn)行。
[0003]因此，臨床上迫切需要一種能夠從FFPE樣本中共分離DNA和RNA的試劑盒及方法，所提DNA和RNA純度高、得率高，以保證即使在樣本量有限的情況下下游試驗(yàn)的正常進(jìn)行；并可以保證研究中使用的DNA 和RNA的來(lái)源完全相同。因?yàn)楝F(xiàn)在很多研究者想比較DNA和RNA用于檢測(cè)或者研究中的差別，但是由于腫瘤的異質(zhì)性等問題，結(jié)論并不能完全信服，也有所出入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種從FFPE樣本中共分離DNA和RNA的試劑盒，采用本試劑盒提取DNA和RNA含量高，純度高，操作簡(jiǎn)捷，重復(fù)性高，節(jié)省樣本量。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種從FFPE樣本中共分離DNA和RNA的方法，該方法所需樣本量少，所提取DNA和RNA的含量和純度高，不需要接觸酚、氯仿、異戊醇等有毒有害物質(zhì)，操作過(guò)程簡(jiǎn)便快捷。
[0006]本發(fā)明所述從FFPE樣本中共分離DNA和RNA的試劑盒包括:
[0007]①RNA分離所需的裂解液Buffer RTL、結(jié)合液Buffer RTB,DNase I工作混合液、漂洗液Buffer RTW和洗脫液Buffer RTE。所述 Buffer RTL包含 150 ~300mM 的 Tris.Cl,0.8 ~1.2M 的 NaCl,8 ~14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；所述Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris ?Cl, 150 ~250mM 的 EDTA，0.8 ~1.2M 的 KCl，0.4 ~
1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸鈉，8 ~16%(V/V)的 Tween20，4 ~6M 的異硫氰酸狐；所述DNase I工作混合液包含DNase I Magic Buffer(50~150mM的Tris.Cl,30 ~70mM 的 NaCl ；60 ~IOOmM 的 MgC12)及 DNase I (1-5U/ μ L);所述漂洗液 Buffer RTff包含 250 ~350mM 的 Tris ?Cl, 30 ~70mM 的 EDTA，0.5 ~1.5M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；所述洗脫液 Buffer RTE 包含 10 ~20mM 的 Tris.Cl，5 ~20mM 的 EDTA。
[0008]優(yōu)選地，所述Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V)Tween20,
0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；
[0009]優(yōu)選地，所述Buffer RTB 包含 IOOmM 的 Tris *Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的NaCl,0.2% (V/V)的十二烷基硫酸鈉，10% (V/V)的Tween20，6M的異硫氰酸胍；
[0010]優(yōu)選地，所述漂洗液Buffer RTff中，包含300mM的Tris.Cl,50mM的EDTA，IM的NaCl，80%的乙醇；
[0011]優(yōu)選地，本發(fā)明所述DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer (IOOmM 的 Tris.Cl,50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2)與 10 μ L DNase I (3U/y L)的比例配制成的；
[0012]本發(fā)明所述結(jié)合液·Buffer RTB，其中十二烷基硫酸鈉、TWeen20能夠有效提高RNA得率。
[0013]②DNA分離所需的裂解液Buffer DTL、調(diào)節(jié)液Buffer DES、結(jié)合液Buffer DTB、漂洗液Buffer Dffl和DW2、洗脫液Buffer DTE。所述Buffer DTL包含80~150mM的Tris ?Cl, 40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫蘇糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸鈉，10 ~25% (V/V)的 Tween20 ;所述調(diào)節(jié)液 Buffer DES 包含所述 80 ~150mM 的 Tris.Cl,30 ~70mM 的 EDTA，0.4 ~1.5M 的(NH4)2SO4,0.8 ~1.5M 的 KCl ;所述結(jié)合液 Buffer DTB包含80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2M的KC1，4~6M的異硫氰酸胍；所述Buffer Dffl包含150~400mM的Tris ?Cl, 40~IOOmM的EDTA，2~5M的異硫氰酸胍,40~70%乙醇；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的Tris.Cl，0.8~1.2M的NaCl，70~90%乙醇；所述洗脫液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~IOmM的EDTA。
[0014]優(yōu)選地，所述Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫蘇糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸鈉，20% (V/V)的Tween20 ；
[0015]優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)液Buffer DES中包含IOOmM的Tris.Cl，50mM的EDTA，
0.8M (NH4)2SO4 ；
[0016]優(yōu)選地，所述結(jié)合液Buffer DTB中包含IOOmM的Tris *Cl,50mM的EDTA，0.8M的KCl，5M的異硫氰酸胍；
[0017]優(yōu)選地，所述洗滌液Buffer Dffl中包含300mM的Tris *Cl,50mM的EDTA，3M的異硫氰酸胍，56%的乙醇；
[0018]優(yōu)選地，所述漂洗液Buffer DW2中包含500mM的Tris.Cl, IM的NaCl，80%的乙醇；
[0019]本發(fā)明所述調(diào)節(jié)液Buffer DES的主要作用是進(jìn)一步減少DNA~蛋白的交聯(lián)作用，減少核酸的片段化，增加核酸的有效濃度。 0]本發(fā)明還提供了一種從FFPE樣本中共分離DNA和RNA的方法，包括以下步驟:
[0021]步驟1.脫蠟
[0022](I)根據(jù)FFPE切片組織面積的大小，刮取2~5片F(xiàn)FPE樣品至1.5mL離心管中；加入ImL 二甲苯,振蕩混勻5~30s ；
[0023](2)室溫10000~16000rpm離心2~IOmin,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0024](3)加入ImL無(wú)水乙醇，振蕩混勻5~30s ;室溫下10000~16000rpm離心2~IOmin,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0025](4)室溫開蓋放置IOmin或37°C下開蓋放置5min，使乙醇充分揮發(fā)。
[0026]步驟2.組織的裂解
[0027](I)加入 200 μ LBuffer RTL 及 25 μ L Proteinase K Solution，使用移液器吹打混勻，50~60°C消化10~30min ；
[0028](2) 10000~16000rpm離心2~IOmin,將180 μ L上清液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中用于分離RNA，剩余液體及沉淀用于分離DNA。
[0029]步驟3.DNA分離
[0030](I)加入 140 μ L Buffer DTL及 15 μ LProteinase K Solution 至剩余液體和沉淀中，使用移液器吹打混勻，50~60°C消化20min~12h ；
[0031](2)加入10 μ L Buffer DES，混勻后放入溫度已升至85~95°C的恒溫加熱器中，孵育I~3h ;
[0032](3)用掌式離心機(jī)離心5~10s。如有需要，可待液體溫度降至室溫，加入2 μ L100mg/mL RNase A,室溫放置 3 ~IOmin 以去除 RNA ；
[0033](4)加入200 μ L Buffer DTB和200 μ L無(wú)水乙醇，振蕩混勻后用掌式離心機(jī)離心5 ~IOs ；
[0034](5)將全部液體轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱中，6000~12000rpm離心30s~2min，倒掉收集管中的液體；
[0035](6)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW1，6000 ~12000rpm 離心 30s ~2min，
倒掉收集管中的液體；
[0036](7)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW2，6000 ~12000rpm 離心 30s ~2min，
丟棄收集管；
[0037](8)換用新的收集管，10000~16000rpm離心I~5min,丟棄收集管；
[0038](9)將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中；往DNA吸附膜中心滴加30~100 μ L Buffer DTE(勿碰到DNA吸附膜)，室溫靜置I~3min，10000~16000rpm離心30s~20min，收集樣品DNA并保存；注:適當(dāng)降低洗脫體積可以提高樣品核酸的濃度。
[0039](10)所分離的DNA建議馬上使用，如超過(guò)6h未使用，請(qǐng)于~20±5°C冷凍保存。
[0040]步驟4.RNA分離
[0041](I)將含180 μ L上清液的離心管轉(zhuǎn)移到溫度已升至75~85°C的恒溫加熱器中，孵育15min ；
[0042](2)待液體溫度降至室溫，用掌式離心機(jī)離心5~IOs ;
[0043](3)加入30 μ LDNase I工作混合液至樣品中，使用移液器吹打混勻，室溫靜置15min ；
[0044](4)加入340 μ L Buffer RTB和750 μ L無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻后用掌式離心機(jī)離心5~IOs ；
[0045](5)將650 μ L液體轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm離心10~60s,倒掉
收集管中的液體；
[0046](6)將剩余液體全部轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm離心10~60s,倒掉
收集管中的液體；
[0047](7)往 RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 離心 10 ~60s，
倒掉收集管中的液體；
[0048](8)往 RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 離心 10 ~60s，
丟棄收集管；
[0049](9)換用新的收集管，10000~16000rpm離心3~IOmin,丟棄收集管；
[0050](10)將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中；往RNA吸附膜中心滴加30~80 μ L Buffer RTE(勿碰到RNA吸附膜)，室溫靜置I~3min，10000~16000rpm離心30s~20min，收集樣品RNA ;注:適當(dāng)降低洗脫體積可以提高樣品核酸的濃度。
[0051](11)所分離的RNA建議馬上使用，如超過(guò)2h未使用，請(qǐng)于~70°C以下保存。
[0052]其中，步驟2所述加入的Buffer RTL包含150~300mM的Tris.C1，0.8~1.2M的NaCl,8~14% (V/V) Tween20,0.2~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸鈉，作為優(yōu)選，采用的Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；
[0053]其中，步驟2所述加入的Buffer RTL與Proteinase K Solution比例為8:1,使用移液器吹打混勻；
[0054]其中，步驟3所述加入的Buffer DTL包含80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫蘇糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸鈉，10~25% (V/V)的Tween20，作為優(yōu)選，采用的 Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫蘇糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸鈉，20% (V/V)的Tween20 ;
[0055]其中，步驟3所述加入的調(diào)節(jié)液Buffer DES包含80~150mM的Tris.Cl，30~70mM 的 EDTA, 0.4 ~1.5M 的(NH4) 2S04,0.8 ~1.5M 的 KCl ;作為優(yōu)選，Buffer DES 包含 IOOmM的 Tris.Cl,50mM 的 EDTA，0.8M 的(NH4)2SO4, IM 的 KCl ；
[0056]其中，步驟3所述加入的結(jié)合液Buffer DTB包括80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2M的KC1，4~6M的異硫氰酸胍；作為優(yōu)選,Buffer DTB包括IOOmM的Tris.Cl，50mM的EDTA，0.8M的KCl，采用的異硫氰酸胍濃度為5M ；
[0057]其中，步驟3所述加入的Buffer DWl包含150~400mM的Tris.Cl，40~IOOmM的EDTA, 2~5M的異硫氰酸胍，40~70%乙醇；作為優(yōu)選，Buffer Dffl包含300mM的Tris ?Cl,50mM的EDTA，3M的異硫氰酸胍，采用的乙醇濃度為56% ；Buffer DW2包含300~700mM的 Tris.Cl，0.8 ~L 2M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；作為優(yōu)選，Buffer DW2 包含 500mM 的Tris.Cl，IM的NaCl，采用的乙醇濃度為80% ；
[0058]其中，步驟3所 述加入的漂洗液所述洗脫液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5 ~IOmM 的 EDTA。[0059]其中，步驟4所述加入的的DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer (IOOmM 的 Tris.Cl,50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2)與 10 μ L DNase I (3U/y L)的比例配制成的；
[0060]其中，步驟4所述加入的的Buffer RTB包含50~150mM的Tris.Cl，150~250mM的 EDTA,0.8 ~1.2M 的 KCl,0.4 ~1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸鈉，8 ~16% (V/V)的Tween20，4~6M的異硫氰酸胍；作為優(yōu)選，采用的Buffer RTB包含200mM的Tris.Cl，IM 的 NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；
[0061]其中，步驟4所述加入的Buffer RTB和無(wú)水乙醇的混合比例為50~60%，上下顛倒混勻；優(yōu)選地，混合比例為58% ； [0062]其中，步驟4所述加入的的漂洗液Buffer RTW包含250~350mM的Tris.Cl，30 ~70mM 的 EDTA，0.5 ~1.5M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；作為優(yōu)選，Buffer RTW 包含 300mM的Tris.Cl，50mM的EDTA，IM的NaCl，采用的乙醇濃度為80% ；
[0063]其中，步驟4所述加入的的洗脫液Buffer RTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~20mM 的 EDTA。
[0064]本發(fā)明采用高效核酸裂解系統(tǒng)，從少量樣品中快速高效的釋放DNA和RNA，通過(guò)高溫修復(fù)作用修復(fù)FFPE樣品中核酸的交聯(lián)化，采用硅膠膜吸附技術(shù)，4.5小時(shí)內(nèi)即可完成FFPE樣品中DNA和RNA的分離和純化工作，獲得高質(zhì)量的核酸。該方法操作簡(jiǎn)捷，重復(fù)性高，得率高，I~3片腫瘤組織切片即可同時(shí)獲得足夠的DNA和RNA ;獲得的核酸純度高，對(duì)后續(xù)的檢測(cè)無(wú)干擾。與常用試劑盒相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0065]圖1DNA檢測(cè)紫外吸收峰圖
[0066]圖2RNA檢測(cè)紫外吸收峰圖
[0067]圖3本發(fā)明試劑盒與常用試劑盒所提取核酸PCR對(duì)照?qǐng)D【具體實(shí)施方式】
[0068]依照本發(fā)明，所述從FFPE樣本中共分離DNA和RNA的試劑盒包括:
[0069]①RNA分離所需的裂解液Buffer RTL、結(jié)合液Buffer RTB,DNase I工作混合液、漂洗液Buffer RTW和洗脫液Buffer RTE。所述 Buffer RTL包含 150 ~300mM 的 Tris.Cl,
0.8 ~1.2M 的 NaCl，8 ~14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；所述Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris ?Cl, 150 ~250mM 的 EDTA，0.8 ~1.2M 的 KCl，0.4 ~
1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸鈉，8 ~16%(V/V)的 Tween20，4 ~6M 的異硫氰酸狐；所述DNase I工作混合液包含DNase I Magic Buffer(50~150mM的Tris.Cl,30 ~70mM 的 NaCl ；60 ~IOOmM 的 MgCl2)及 DNase I (3U/ μ L);所述漂洗液 Buffer RTff包含 300mM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IM 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；所述洗脫液 Buffer RTE包含 IOmM 的 Tris.Cl，5mM 的 EDTA。
[0070]優(yōu)選地，所述Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V)Tween20,
0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；
[0071]優(yōu)選地，所述Buffer RTB 包括 IOOmM 的 Tris *Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的NaCl,0.2% (V/V)的十二烷基硫酸鈉，10% (V/V)的Tween20，6M的異硫氰酸胍；
[0072]優(yōu)選地，所述漂洗液Buffer RTff中，包含300mM的Tris.Cl,50mM的EDTA，IM的NaCl，乙醇濃度為80%
[0073]優(yōu)選地，本發(fā)明所述DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer er (IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 NaCl ;80mM 的 MgCl2)與 10 μ L DNase I (3U/y L)的比例配制成的；
[0074]本發(fā)明所述結(jié)合液Buffer RTB，其中十二烷基硫酸鈉、TWeen20能夠有效提高RNA得率。
[0075]②DNA分離所需的裂解液Buffer DTL、調(diào)節(jié)液Buffer DES、結(jié)合液Buffer DTB、漂洗液Buffer Dffl和DW2、洗脫液Buffer DTE。所述Buffer DTL包含80~150mM的Tris ?Cl, 40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫蘇糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸鈉，10 ~25% (V/V)的 Tween20 ;所述調(diào)節(jié)液 Buffer DES 包含所述 80 ~150mM 的 Tris.Cl,30 ~70mM 的 EDTA，0.4 ~1.5M 的(NH4)2SO4,0.8 ~1.5M 的 KCl ;所述結(jié)合液 Buffer DTB包括80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2M的KC1，3~6M的異硫氰酸胍；所述Buffer Dffl包含150~400mM的Tris ?Cl, 40~IOOmM的EDTA，2~5M的異硫氰酸胍,40~70%乙醇；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的Tris.Cl,0.8~1.2M的NaCl，70~90%乙醇；所述洗脫液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~20mM的EDTA。
[0076]優(yōu)選地，所述Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫蘇糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸鈉，20% (V/V)的Tween20 ；
[0077]優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)液Buffer DES中包含IOOmM的Tris.Cl，50mM的EDTA，IM的KCl，(NH4)2SO4 濃度為 0.8M;
[0078]優(yōu)選地，所述結(jié)合液Buffer DTB中包含IOOmM的Tris *Cl,50mM的EDTA，0.8M的KCl，異硫氰酸胍濃度為5M ；
[0079]優(yōu)選地，所述洗滌液Buffer Dffl中包含300mM的Tris *Cl,50mM的EDTA，3M的異硫氰酸胍，乙醇體積比為56% ；
[0080]優(yōu)選地，所述漂洗液Buffer Dff2中包含500mM的Tris.Cl, IM的NaCl,乙醇體積比為80% ；
[0081]本發(fā)明所述調(diào)節(jié)液Buffer DES的主要作用是進(jìn)一步減少DNA~蛋白的交聯(lián)作用，減少核酸的片段化，增加核酸的有效濃度。
[0082]本發(fā)明還提供了一種從FFPE樣本中共分離DNA和RNA的方法，包括以下步驟:
[0083]步驟1.脫蠟
[0084](I)根據(jù)FFPE切片組織面積的大小，刮取2~5片F(xiàn)FPE樣品至1.5mL離心管中；加入ImL 二甲苯,振蕩混勻5~30s ；
[0085](2)室溫10000~16000rpm離心2~IOmin,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0086](3)加入ImL無(wú)水乙醇，振蕩混勻5~30s ;室溫下10000~16000rpm離心2~IOmin,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0087](4)室溫開蓋放置IOmin或37°C下開蓋放置5min，使乙醇充分揮發(fā)。
[0088]步驟2.組織的裂解[0089](I)加入 200 μ L Buffer RTL 及 25 μ L Proteinase K Solution，使用移液器吹打混勻，50~60°C消化10~30min ；
[0090](2) 10000~16000rpm離心2min，將180 μ L上清液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中用于分離RNA，剩余液體及沉淀用于分離DNA。
[0091]步驟3.DNA分離
[0092](I)加入 140 μ L Buffer DTL 及 15 μ L Proteinase K Solution 至剩余液體和沉淀中，使用移液器吹打混勻，50~60°C消化20min~12h ；
[0093](2)加入10 μ L Buffer DES，混勻后放入溫度已升至85~95°C的恒溫加熱器中，孵育I~3h ;
[0094](3)用掌式離心機(jī)離心5~10s。如有需要，可待液體溫度降至室溫，加入2 μ L100mg/mL RNase A,室溫放置 3 ~IOmin 以去除 RNA ；
[0095](4)加入200 μ L Buffer DTB和200 μ L無(wú)水乙醇，振蕩混勻后用掌式離心機(jī)離心5 ~IOs ；
[0096](5)將全部液體轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱中，6000~12000rpm離心30s~2min，倒掉收集管中的液體；
[0097](6)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW1，6000 ~12000rpm 離心 30s ~2min，
倒掉收集管中的液體；
[0098](7)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW2，6000 ~12000rpm 離心 30s ~2min，
丟棄收集管；
[0099](8)換用新的收集管，10000~16000rpm離心I~5min,丟棄收集管；
[0100](9)將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中；往DNA吸附膜中心滴加30~100 μ L Buffer DTE(勿碰到DNA吸附膜)，室溫靜置I~3min，10000~16000rpm離心30s~20min，收集樣品DNA并保存；注:適當(dāng)降低洗脫體積可以提高樣品核酸的濃度。
[0101](10)所分離的DNA建議馬上使用，如超過(guò)6h未使用，請(qǐng)于~20±5°C冷凍保存。
[0102]步驟4.RNA分離
[0103](I)將含180 μ L上清液的離心管轉(zhuǎn)移到溫度已升至75~85°C的恒溫加熱器中，孵育15min ；
[0104](2)待液體溫度 降至室溫，用掌式離心機(jī)離心5~IOs ;
[0105](3)加入30 μ LDNase I工作混合液至樣品中，使用移液器吹打混勻，室溫靜置15min ；
[0106](4)加入340 μ L Buffer RTB和750 μ L無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻后用掌式離心機(jī)離心5~IOs ；
[0107](5)將650 μ L液體轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm離心10~60s,倒掉
收集管中的液體；
[0108](6)將剩余液體全部轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm離心10~60s,倒掉
收集管中的液體；
[0109](7)往 RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 離心 10 ~60s，
倒掉收集管中的液體；
[0110](8)往 RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 離心 10 ~60s，丟棄收集管；
[0111](9)換用新的收集管，10000~16000rpm離心3~1Omin,丟棄收集管；
[0112](10)將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中；往RNA吸附膜中心滴加30~80 μ L Buffer RTE(勿碰到RNA吸附膜)，室溫靜置1~3min，10000~16000rpm離心30s~20min，收集樣品RNA ;注:適當(dāng)降低洗脫體積可以提高樣品核酸的濃度。
[0113](11)所分離的RNA建議馬上使用，如超過(guò)2h未使用，請(qǐng)于~70°C以下保存。
[0114]其中，步驟2所述加入的Buffer RTL包含150~300mM的Tris.Cl，0.8~1.2M的NaCl,8~14% (V/V) Tween20,0.2~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸鈉，作為優(yōu)選，采用的Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；
[0115]其中，步驟2所述加入的Buffer RTL與Proteinase K Solution比例為8:1,使用移液器吹打混勻；
[0116]其中，步驟3所述加入的Buffer DTL包含80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫蘇糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸鈉，10~25% (V/V)的Tween20，作為優(yōu)選，采用的 Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫蘇糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸鈉，20% (V/V)的Tween20 ;
[0117]其中，步驟3所述加入的調(diào)節(jié)液Buffer DES包含80~150mM的Tris.Cl，30~70mM 的 EDTA，0.4 ~1.5M 的(NH4)2SO4,0.8 ~1.5M 的 KCl ;作為優(yōu)選，采用的 Buffer DES包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IM 的 KCl，(NH4)2SO4 濃度為 0.8M ；
[0118]其中，步驟3所述加入的結(jié)合液Buffer DTB包括80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2mM的KC1，4~6M的異硫氰酸胍；作為優(yōu)選，采用的Buffer DTB包括IOOmM的Tris.Cl,50mM的EDTA，800mM的KC1，異硫氰酸胍濃度為5M ；
[0119]其中，步驟3所述加入的Buffer Dffl包含150~400mM的Tris.Cl，40~IOOmM的EDTA，2~5M的異硫氰酸胍，40~70%乙醇；作為優(yōu)選，采用的Buffer Dffl包含300mM的Tris.Cl，50mM的EDTA，3M的異硫氰酸胍，乙醇濃度為56% ；Buffer DW2包含300~700mM的Tris ?Cl, 0.8~1.2M的NaCl，70~90%乙醇；作為優(yōu)選，采用的Buffer DW2包含500mM的Tris.Cl，IM的NaCl，乙醇濃度為80% ；
[0120]其中，步驟3所述加入的漂洗液所述洗脫液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5 ~IOmM 的 EDTA。
[0121]其中，步驟4所述加入的的DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer (IOOmM 的 Tris.α，50πm 的 NaCl ;80mM 的 MgC12)與 10 μ L DNase I (3U/yL)的比例配制成的；
[0122]其中，步驟4所述加入的的Buffer RTB包含50~150mM的Tris.Cl，150~250mM的 EDTA,0.8 ~1.2M 的 KCl,0.4 ~1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸鈉，8 ~16% (V/V)的Tween20，4~6M的異硫氰酸胍；作為優(yōu)選，采用的Buffer RTB包含200mM的Tris.Cl，IM 的 NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；
[0123]其中步驟4所述加入的Buffer RTB和無(wú)水乙醇的混合比例為50~60%，上下顛倒混勻；優(yōu)選地，混合比例為58% ；
[0124]其中，步驟4所述加入的的漂洗液Buffer RTW包含250~350mM的Tris.Cl，30~70mM的EDTA，0.5~1.5M的NaCl，70~85%乙醇；作為優(yōu)選，采用的Buffer RTff包含300mM的Tris.Cl，50mM的EDTA，IM的NaCl，乙醇濃度為80% ;其中，步驟4所述加入的的洗脫液 Buffer RTE 包含 10 ~20mM 的 Tris.Cl，5 ~20mM 的 EDTA。
[0125]采用本試劑盒所述方法，其提取過(guò)程應(yīng)使用一次性無(wú)DNase和RNase的移液器槍頭和離心管；用于核酸分離的FFPE樣本的組織面積應(yīng)介于0.5~1cm2，厚度應(yīng)介于5~10 μ m ；
[0126]本發(fā)明所述方法可用于所有FFPE樣本，4.5小時(shí)內(nèi)即可完成FFPE樣品中DNA和RNA的分離和純化工作，獲得高質(zhì)量的核酸。相比常見的離心柱提取法，提取時(shí)間縮短，獲得的核酸得率高、純度高。
[0127]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義或說(shuō)明，本專利所述的科學(xué)技術(shù)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解具有相同的含義。
[0128]實(shí)施例1:本發(fā)明所述試劑盒
[0129]所述從FFPE樣本中共分離DNA和RNA的試劑盒包括:
[0130]①RNA分離所需的裂解液Buffer RTL、結(jié)合液Buffer RTB,DNase I工作混合液、漂洗液Buffer RTW和洗脫液Buffer RTE。所述 Buffer RTL包含 150 ~300mM 的 Tris.Cl,
0.8 ~1.2M 的 NaCl，8 ~14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；所述Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris ?Cl, 150 ~250mM 的 EDTA，0.8 ~1.2M 的 KCl，0.4 ~
1.2M 的 NaCl,0.1 ~0.5%(V/V)的十二烷基硫酸鈉，8 ~16%(V/V)的 Tween20，4 ~6M 的異硫氰酸狐；所述DNase I工作混合液包含DNase I Magic Buffer(80~120mM的Tris.Cl,30 ~70mM 的 NaCl ；60 ~IOOmM 的 MgCl2)及 DNase I (3U/ μ L);所述漂洗液 Buffer RTff包含 250 ~350mM 的 Tris ?Cl, 30 ~70mM 的 EDTA，0.5 ~1.5M 的 NaCl，70 ~85% 乙醇；所述洗脫液 Buffer RTE 包含 10 ~20mM 的 Tris.Cl，5 ~20mM 的 EDTA。
[0131]優(yōu)選地，所述Buffer RTL 包含 200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10% (V/V)Tween20,
0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；
[0132]優(yōu)選地，所述Buffer RTB 包括 IOOmM 的 Tris *Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的NaCl,0.2% (V/V)的十二烷基硫酸鈉，10% (V/V)的Tween20，6M的異硫氰酸胍；
[0133]優(yōu)選地，所述漂洗液Buffer RTff中，包含300mM的Tris.Cl,50mM的EDTA，IM的NaCl，乙醇濃度為80% ；
[0134]優(yōu)選地，本發(fā)明所述DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I MagicBuffer (IOOmM 的 Tris.Cl,50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2)與 10 μ L DNase I (3U/y L)的比例配制成的；
[0135] 本發(fā)明所述結(jié)合液Buffer RTB，其中十二烷基硫酸鈉、TWeen20能夠有效提高RNA
得率
[0136]②DNA分離所需的裂解液Buffer DTL、調(diào)節(jié)液Buffer DES、結(jié)合液Buffer DTB、漂洗液Buffer Dffl和DW2、洗脫液Buffer DTE。所述Buffer DTL包含80~150mM的Tris ?Cl, 40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫蘇糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸鈉，10 ~25% (V/V)的 Tween20 ;所述調(diào)節(jié)液 Buffer DES 包含所述 80 ~150mM 的 Tris.Cl,30 ~70mM 的 EDTA，0.4 ~1.5M 的(NH4)2SO4,0.8 ~1.5M 的 KCl ;所述結(jié)合液 Buffer DTB包含80~150mM的Tris.Cl，40~70mM的EDTA，0.6~1.2M的KC1，4~6M的異硫氰酸胍；所述Buffer Dffl包含150~450mM的Tris ?Cl, 40~IOOmM的EDTA，2~5M的異硫氰酸胍,40~70%乙醇；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的Tris.Cl,0.8~1.2M的NaCl，70~90%乙醇；所述洗脫液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~IOmM的EDTA。
[0137]優(yōu)選地，所述Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫蘇糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸鈉，20% (V/V)的Tween20 ；
[0138]優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)液Buffer DES中包含IOOmM的Tris.Cl,50mM的EDTA，IM的KCl，(NH4)2SO4 濃度為 0.8M;
[0139]優(yōu)選地，所述結(jié)合液Buffer DTB中包含IOOmM的Tris *Cl,50mM的EDTA，0.8M的KCl異硫氰酸胍濃度為5M ；
[0140]優(yōu)選地，所述洗滌液Buffer Dffl中包含300mM的Tris *Cl,50mM的EDTA，3M的異硫氰酸胍，乙醇體積比為56% ； [0141]優(yōu)選地，所述漂洗液Buffer Dff2中包含500mM的Tris.Cl, IM的NaCl,乙醇體積比為80% ；
[0142]本發(fā)明所述調(diào)節(jié)液Buffer DES的主要作用是進(jìn)一步減少DNA~蛋白的交聯(lián)作用，減少核酸的片段化，增加核酸的有效濃度。
[0143]實(shí)施例2
[0144]采用實(shí)施例1所述試劑盒，對(duì)120例樣品共分離DNA和RNA，并與常用試劑盒進(jìn)行平行對(duì)比，樣品為3年內(nèi)的石蠟包埋臨床樣本，包括肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等。
[0145]1、提取試劑
[0146](I) RNA 分離
[0147]裂解液Buffer RTL:200mM 的 Tris ?Cl, IM 的 EDTA，200mM 的二硫蘇糖醇，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；
[0148]結(jié)合液Buffer RTB:100mM 的 Tris.Cl，200mM 的 EDTA，IM 的 KC1，IM 的 NaCl，0.2%(V/V)的十二烷基硫酸鈉，10% (V/V)的Tween20，6M的異硫氰酸胍；
[0149]DNase I 工作混合液:DNase I Magic Buffer (IOOmM 的 Tris.Cl, 50mM 的 NaCl,80mM 的 MgCl2), DNase I (3U/y L)；
[0150]漂洗液Buffer RTff:300mM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IM 的 NaCl，10% 乙醇；
[0151]洗脫液Buffer RTE:10mM 的 Tris.Cl，5mM 的 EDTA。
[0152](2) DNA 分離
[0153]裂解液Buffer DTL:100mM 的 Tris *Cl,50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫蘇糖醇，5%(V/V)十二烷基硫酸鈉，20% (V/V)的Tween20 ；
[0154]調(diào)節(jié)液Buffer DES: IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，800mM 的(NH4) 2S04, IM 的KCl ；
[0155]結(jié)合液Buffer DTB:100mM 的 Tris.Cl,50mM 的 EDTA，800mM 的 KCl，5M 的異硫氰
酸胍；
[0156]漂洗液Buffer Dffl:300mM 的 Tris *Cl,50mM 的 EDTA，3M 的異硫氰酸胍，56% 乙醇；
[0157]漂洗液Buffer DW2:500mM 的 Tris.Cl，IM 的 NaCl，80% 乙醇；[0158]洗脫液Buffer DTE:10mM 的 Tris.Cl，5mM 的 EDTA。
[0159]2、提取方法
[0160]步驟1.脫蠟
[0161](I)根據(jù)FFPE切片組織面積的大小，刮取2~5片F(xiàn)FPE樣品至1.5mL離心管中；加入ImL 二甲苯,振蕩混勻IOs ；
[0162](2)室溫HOOOrpm離心2min，小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0163](3)加入ImL無(wú)水乙醇,振蕩混勻IOs ;室溫下14000rpm離心2min,小心去除上清(勿吸到沉淀)；
[0164](4)室溫開蓋放置IOmin或37°C下開蓋放置5min，使乙醇充分揮發(fā)。
[0165]步驟2.組織的裂解
[0166](I)加入 200 μ L Buffer RTL 及 25 μ L Proteinase K Solution，使用移液器吹打混勻，56 °C消化15min ；
[0167](2) 14000rpm離心2min，將180 μ L上清液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中用于分離RNA，剩余液體及沉淀用于分離DNA。
[0168]步驟3.DNA分離
[0169](I)加入 140 μ L Buffer DTL 及 15 μ L Proteinase K Solution 至剩余液體和沉淀中，使用移液器吹打混勻，56 V消化Ih ;
[0170](2)加入IOyL Buffer DES，混勻后放入溫度已升至90°C的恒溫加熱器中，孵育2h ；
[0171](3)用掌式離心機(jī)離心5~10s。如有需要，可待液體溫度降至室溫，加入2 μ L100mg/mL RNase A,室溫放置 5min 以去除 RNA ；
[0172](4)加入200 μ L Buffer DTB和200 μ L無(wú)水乙醇，振蕩混勻后用掌式離心機(jī)離心5 ~IOs ；
[0173](5)將全部液體轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱中，8000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體；
[0174](6)往DNA吸附柱中加入600 μ L Buffer DW1，8000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體；
[0175](7)往DNA吸附柱中加入600 μ L Buffer DW2,8000rpm離心lmin,丟棄收集管；
[0176](8)換用新的收集管，14000rpm離心3min,丟棄收集管；
[0177](9)將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中；往DNA吸附膜中心滴加30~100 μ L Buffer DTE (勿碰到DNA吸附膜),室溫靜置I~3min, 14000rpm離心lmin,收集樣品DNA并保存；注:適當(dāng)降低洗脫體積可以提高樣品核酸的濃度。
[0178](10)所分離的DNA建議馬上使用，如超過(guò)6h未使用，請(qǐng)于~20±5°C冷凍保存。步驟4.RNA分離
[0179](I)將含ISOyL上清液的離心管轉(zhuǎn)移到溫度已升至80°C的恒溫加熱器中，孵育15min ；
[0180](2)待液體溫度降至室溫，用掌式離心機(jī)離心5~IOs ;
[0181](3)加入30 μ LDNase I工作混合液至樣品中，使用移液器吹打混勻，室溫靜置15min ；
[0182](4)加入340 μ L Buffer RTB和750 μ L無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻后用掌式離心機(jī)離心5~IOs ；
[0183](5)將650 μ L液體轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，HOOOrpm離心30s，倒掉收集管中的液體；
[0184](6)將剩余液體全部轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，14000rpm離心30s,倒掉收集管中的液體；
[0185](7)往RNA吸附柱中加入600 μ L Buffer RTW，14000rpm離心30s，倒掉收集管中的液體；
[0186](8)往RNA吸附柱中加入600 μ L Buffer RTff, 14000rpm離心30s，丟棄收集管；
[0187](9)換用新的收集管，14000rpm離心5min,丟棄收集管；
[0188](10)將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中；往RNA吸附膜中心滴加30~80 μ L Buffer RTE (勿碰到RNA吸附膜)，室溫靜置I~3min, 14000rpm離心lmin,收集樣品RNA ;注:適當(dāng)降低洗脫體積可以提高樣品核酸的濃度。
[0189](11)所分離的RNA建議馬上使用，如超過(guò)2h未使用，請(qǐng)于~70°C以下保存。
[0190]3、所提 DNA、RNA 含量及 0D260/280、0D260/230 值檢測(cè)
[0191]采用分光光度計(jì)對(duì)本發(fā)明試劑盒提取的DNA、RNA進(jìn)行含量及0D260/280、0D260/230值檢測(cè)，結(jié)果如表1:
[0192]表1DNA、RNA 含量及 0D260/280、0D260/230 檢測(cè)值
[0193]
【權(quán)利要求】
1.一種從福爾馬林固定石蠟包埋組織中共分離DNA和RNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: ①RNA分離所需的: 裂解液 Buffer RTL:所述 Buffer RTL 包含 150 ~300mM 的 Tris.Cl，0.8 ~1.2M 的NaCl,8 ~ 14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸鈉； 結(jié)合液 Buffer RTB:所述 Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris.Cl, 150 ~250mM 的EDTA,0.8 ~1.2M 的 KCl, 0.4 ~1.2M 的 NaCl, 0.1 ~0.5% (V/V)的十二烷基硫酸，8 ~16%(V/V)的Tween20，4~6M的異硫氰酸胍； DNase I工作混合液:所述DNase I工作混合液包含DNase I Magic Buffer:80~120mM 的 Tris.Cl，30 ~70mM 的 NaCl ；60 ~IOOmM 的 MgCl2 及 DNase Il-5U/y L ； 漂洗液 Buffer RTff:所述漂洗液 Buffer RTW包含 250 ~350mM 的 Tris ?Cl, 30 ~70mM的 EDTA，0.5 ~L 5M 的 NaCl，70 ~90% 的乙醇； 洗脫液Buffer RTE:所述洗脫液Buffer RTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~20mM的EDTA ； ②DNA分離所需的: 裂解液Buffer DTL:所述Buffer DTL包含 80 ~150mM 的 Tris.Cl，40 ~70mM 的 EDTA，80~150mM的二硫蘇糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸鈉，10~25% (V/V)的Tween20 ；調(diào)節(jié)液 Buffer DES:所述調(diào)節(jié)液 Buffer DES 包含 80 ~150mM 的 Tris ?Cl, 30 ~70mM的 EDTA, 0.4 ~1.5M 的(NH4) 2S04,0.8 ~1.5M 的 KCl ；` 結(jié)合液 Buffer DTB:所述結(jié)合液 Buffer DTB 包含 80 ~150mM 的 Tris ?Cl, 40 ~70mM的EDTA，06~1.2M的KC1，4~6M的異硫氰酸胍； 漂洗液Buffer DWl 和 DW2:所述Buffer DWl 包含 150 ~400mM 的 Tris.Cl，40 ~IOOmM的EDTA，2~5M的異硫氰酸胍，40~70%乙醇；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的 Tris.C1，0.8 ~1.2M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇； 洗脫液Buffer DTE:所述洗脫液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~IOmM的EDTA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述BufferRTL包含200mM的Tris ?Cl,IM的NaCl，10% (V/V) Tween20,0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉；所述DNase I工作混合液是按每人份20μ? DNase I Magic Buffer與ΙΟμ? DNase I的比例配制成的；所述BufferRTB 包含 IOOmM 的 Tris.Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的 NaCl，0.2% (V/V)的十二烷基硫酸鈉，10% (V/V)的Tween20，6M的異硫氰酸胍；所述漂洗液Buffer RTff中包含300mM的Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IM 的 NaCl，乙醇濃度為 80%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒,其特征在于,所述DNaseI工作混合液中，DNase IMagic Buffer 包括 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2, DNase I 濃度為 3U/μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述BufferDTL包含IOOmM的Tris.ClSOmM 的 EDTA，IOOmM 的二硫蘇糖醇，5%(V/V)十二烷基硫酸鈉，20%(V/V)的 Tween20 ；所述Buffer DES 中包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA, IM 的 KCl，(MM)2SO4濃度為 0.8M ；所述Buffer DTB中包含IOOmM的Tris.Cl，50mM的EDTA，0.8M的KCl，異硫氰酸胍濃度為.5M ;所述Buffer Dffl中包含300mM的Tris.Cl，50mM的EDTA，3M的異硫氰酸胍，乙醇體積比為56%, Buffer DW2中包含500mM的Tris.Cl，IM的NaCl，乙醇體積比為80%。
5.一種利用權(quán)利要求1所述試劑盒從福爾馬林固定石蠟包埋組織中共分離DNA和RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1.脫蠟 (1)根據(jù)FFPE切片組織面積的大小，刮取2~5片F(xiàn)FPE樣品至1.5mL離心管中；加入.1mL 二甲苯,振蕩混勻5~30s ； (2)室溫10000~16000rpm離心2~1Omin,小心去除上清； (3)加入1mL無(wú)水乙醇,振蕩混勻5~30s;室溫下10000~16000rpm離心2~1Omin,小心去除上清； (4)室溫開蓋放置或37°C下開蓋放置，使乙醇充分揮發(fā)； 步驟2.組織的裂解 (1)加入200yL Buffer RTL 及 25yL Proteinase K Solution，使用移液器吹打混勻，.50 ~60°C消化 10 ~30min ;所述 Buffer RTL 包含 150 ~300mM 的 Tris.C1，0.8 ~1.2M的 NaCl,8 ~ 14% (V/V) Tween20,0.2 ~0.8% (V/V)的十二烷基硫酸鈉； (2)10000~16000rpm離心2~IOmin,將180 μ L上清液轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中用于分離RNA，剩余液體及沉淀用于分離DNA ； 步驟3.DNA分離 (1)加入140yL Buffer DTL 及 15uL Proteinase K Solution 至剩余液體和沉淀中,使用移液器吹打混勻，50~60°C消化20min~12h ;所述Buffer DTL包含80~150mM的Tris ?Cl, 40~70mM的EDTA，80~150mM的二硫蘇糖醇，3~10% (V/V)十二烷基硫酸鈉，.10 ~25% (V/V)的 Tween20 ； (2)加入IOyLBuffer DES，混勻后放入溫度已升至85~95°C的恒溫加熱器中，孵育.1~3h ;所述調(diào)節(jié)液Buffer DES包含所述80~150mM的Tris.Cl, 30~70mM的EDTA，.0.4 ~1.5M 的(NH4) 2S04,0.8 ~1.5M 的 KCl ； (3)用掌式離心機(jī)離心5~10s。如有需要，可待液體溫度降至室溫，加入2μ LlOOmg/mL RNase A，室溫放置3~IOmin以去除RNA ； (4)加入200μ L Buffer DTB和200 μ L無(wú)水乙醇，振蕩混勻后用掌式離心機(jī)離心5~.1Os ;所述結(jié)合液 Buffer DTB 包括 80 ~150mM 的 Tris.Cl，40 ~70mM 的 EDTA，0.6 ~1.2M的KC1，4~6M的異硫氰酸胍； (5)將全部液體轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱中,6000~12000rpm離心30s~2min,倒掉收集管中的液體； (6)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer Dff1,6000 ~12000rpm 離心 30s ~2min，倒掉收集管中的液體；所述Buffer Dffl包含150~400mM的Tris.Cl，40~IOOmM的EDTA，.2~5M的異硫氰酸胍，40~70%乙醇； (7)往DNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer DW2，6000 ~12000rpm 離心 30s ~2min，丟棄收集管；所述漂洗液Buffer DW2包含300~700mM的Tris *C1,0.8~1.2M的NaCl，70~.90%乙醇； (8)換用新的收集管，10000~16000rpm離心1~5min,丟棄收集管；(9)將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中；往0嫩吸附膜中心滴加30~100 μ LBuffer DTE,室溫靜置1~3min，10000~16000rpm離心30s~2min，收集樣品DNA并保存；所述洗脫液Buffer DTE包含10~20mM的Tris.Cl，5~IOmM的EDTA ； (10)所分離的DNA馬上使用，如超過(guò)6h未使用，于~20±5°C冷凍保存； 步驟4.RNA分離 (1)將含180μ L上清液的離心管轉(zhuǎn)移到溫度已升至75~85°C的恒溫加熱器中，孵育10_20min ； (2)待液體溫度降至室溫，用掌式離心機(jī)離心5~IOs; (3)加入30μ LDNase I工作混合液至樣品中，使用移液器吹打混勻，室溫靜置15min ；所述的DNase I工作混合液是按每人份20 μ L DNase I Magic Buffer與10 μ L DNase I的比例配制成的； (4)加入340μ L Buffer RTB和750 μ L無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻后用掌式離心機(jī)離心 5 ~IOs ;所述 Buffer RTB 包含 50 ~150mM 的 Tris.Cl, 150 ~250mM 的 EDTA，0.8 ~.1.2M 的 KCl, 0.4 ~1.2M 的 NaCl, 0.1 ~0.5% (V/V)的十二烷基硫酸鈉，8 ~16% (V/V)的Tween20,4~6M的異硫氰酸胍； (5)將650μ L液體轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm離心10~60s，倒掉收集管中的液體； (6)將剩余液體全部轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱中，10000~16000rpm離心10~60s,倒掉收集管中的液體；
(7)往RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 離心 10 ~60s,倒掉收集管中的液體；所述漂洗液Buffer RTff包含250~350mM的Tris.Cl，30~70mM的EDTA, 0.5 ~1.5M 的 NaCl，70 ~90% 乙醇；
(8)往RNA 吸附柱中加入 600 μ L Buffer RTff, 10000 ~16000rpm 離心 10 ~60s,丟棄收集管； (9)換用新的收集管，10000~16000rpm離心3~IOmin,丟棄收集管； (10)將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL離心管中；往RNA吸附膜中心滴加30~80 μ LBuffer RTE,室溫靜置I~3min，10000~16000rpm離心30s~20min，收集樣品RNA ;所述洗脫液 Buffer RTE 包含 10 ~50mM 的 Tris.Cl，5 ~20mM 的 EDTA ； (11)所分離的RNA馬上使用，如超過(guò)2h未使用，于~70°C以下保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述裂解液BufferRTL包含200mM的Tris ?Cl, IM 的 NaCl，10%(V/V)Tween20,0.5%(V/V)的十二烷基硫酸鈉；所述結(jié)合液 BufferRTB 包含 IOOmM 的 Tris.Cl,200mM 的 EDTA，IM 的 KCl，IM 的 NaCl，0.2% (V/V)的十二烷基硫酸鈉，10% (V/V)的TWeen20，6M的異硫氰酸胍；所述漂洗液Buffer RTff中，乙醇濃度為80% ;所述 Buffer DTL 包含 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 EDTA，IOOmM 的二硫蘇糖醇，5% (V/V)十二烷基硫酸鈉，20% (V/V)的Tween20 ;所述Buffer DES中(MM)2SO4濃度為0.8M ;所述Buffer DTB中異硫氰酸胍濃度為5M ;所述Buffer Dffl中乙醇濃度為56%，Buffer DW2中乙醇濃度為80%。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2所述加入的BufferRTL與Proteinase K Solution比例為8:1,使用移液器吹打混勻。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟4加入的DNaseI工作混合液中，DNase I Magic Buffer 包括 IOOmM 的 Tris.Cl，50mM 的 NaCl ；80mM 的 MgCl2, DNase I 濃度為3U/ μ L0
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟4所述加入的BufferRTB和無(wú)水乙醇的混合比例為50~60%，上下顛倒混勻；優(yōu)選地，混合比例為58%。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103725672SQ201310522206
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】劉云芬, 宋慶濤, 林清華, 李海燕, 阮力, 鄭立謀 申請(qǐng)人:廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司