一種從鈣化組織中提取rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從鈣化組織中提取RNA的方法。其方法步驟為：將鈣化組織在液氮中進(jìn)行研磨直到塊狀直徑小于0.5cm的顆粒時(shí),加入Trizol，再加液氮繼續(xù)研磨成粉末狀，直至直徑約1mm或小于1mm為止；再將所得粉末轉(zhuǎn)移到RNase-Free的小管中，加入Trizol消化裂解細(xì)胞；將上述小管離心后將上清轉(zhuǎn)移到新的小管；上清加入氯仿處理后離心，將最上層的水相轉(zhuǎn)移到另一新的小管，加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸；然后轉(zhuǎn)移到試劑盒的吸附柱上，靜置后離心，RNA結(jié)合到吸附柱上；用試劑盒溶液洗滌；再進(jìn)行洗脫即得到鈣化組織總RNA。得到的鈣化組織總RNA的收率高，純度高、質(zhì)量、完整性好。
【專利說(shuō)明】一種從鈣化組織中提取RNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)，尤其涉及一種從鈣化組織中提取RNA的方法，特別是從造礁珊瑚中提取核糖核酸RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鈣化組織是指鈣鹽在軟組織中沉積，并使其硬化的過(guò)程。提取鈣化組織中鈣化細(xì)胞中總RNA通常是對(duì)鈣化組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、表達(dá)譜測(cè)序、cDNA克隆、RT-PCR和Northernblot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的第一步，總RNA的質(zhì)和量決定著后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗和質(zhì)量。目前，提取培養(yǎng)的骨細(xì)胞系以及各種臟器中總RNA方法的報(bào)道有很多，但從鈣化組織中提取總RNA的方法一直處于摸索間段。傳統(tǒng)的提取方法所得到的RNA純度以及產(chǎn)量較低，難以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為獲得較完整、純度高、產(chǎn)量高的鈣化組織RNA，本專利人在實(shí)踐中摸索出有效的提取造礁珊瑚等鈣化組織中核糖核酸RNA的方法。
[0003]目前，一般鑒定RNA的純度和RNA質(zhì)量的方法為
1)用檢測(cè)RNA溶液的吸光度來(lái)鑒定RNA的純度
230nm、260nm、280nm下的吸光度分別代表了鹽濃度、核酸和蛋白等有機(jī)物的值。一般的，我們只看0D260/0D280。當(dāng)0D260/0D280的比值為1.8-2.0時(shí)，認(rèn)為RNA中蛋白或者是其他有機(jī)物的污染很少。當(dāng)0D260/0D280〈1.8時(shí)，溶液中蛋白或者是其他有機(jī)物的污染比較明顯，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng)0D260/0D280>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核苷酸了。A260/A230的比值表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有1^1七&-巰基乙醇?xì)埩簦渲荡笥?.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA ；
2)用RNA的電泳圖譜鑒定RNA的質(zhì)量
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的，電泳的目的是在于檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的；
這兩種方法都無(wú)法明確的知道RNA溶液中有沒(méi)有RNA酶殘留。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法很難察覺(jué)，但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37°C以上并且是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行的。如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中RNA酶就會(huì)有非常適合的環(huán)境和時(shí)間發(fā)揮它們的作用，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。故需要進(jìn)一步確證； 3)用保溫試驗(yàn)進(jìn)一步確定RNA溶液有無(wú)RNA酶的殘留
從RNA溶液中吸取兩份約1000 ng的RNA加入0.5 ml的離心管中，用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70°C的恒溫水浴中，保溫I h。另一份放置在_20°C冰箱中保存I h。隨后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，t匕較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無(wú)明顯差別(當(dāng)然，它們的條帶也要符合上述
2)中的方法條件)，則說(shuō)明RNA溶液中沒(méi)有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70°C保溫的樣本有明顯的降解，則說(shuō)明RNA溶液中有RNA酶污染。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種快速，有效地從造礁珊瑚等鈣化組織中提取到完整核糖核酸RNA的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從鈣化組織中提取RNA的方法，其特征在于，包括如下步驟，
液氮研磨鈣化組織:將鈣化組織在液氮中進(jìn)行研磨直到塊狀直徑小于0.5cm的顆粒時(shí)，加入Trizol,再加液氮繼續(xù)研磨成粉末狀,直至直徑約1_或小于Imm為止；
充分裂解:將所得粉末轉(zhuǎn)移到RNase-Free的1.5ml小管中，加入Trizol試劑，溫和混勻，室溫靜置，期間顛倒混勻一次，消化裂解細(xì)胞；
提取:將上述小管在4°C離心，將上清轉(zhuǎn)移到新的小管；上清加入氯仿，顛倒混勻30s，室溫靜置15min后離心，離心后的樣品分為三層，將最上層的水相轉(zhuǎn)移到另一新的小管，加A 75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸；
吸附:將上步所得轉(zhuǎn)移到E.Z.N.A.? Total RNA Kit II (50)試劑盒的吸附柱上，靜置后離心，RNA結(jié)合到吸附柱上；
洗漆:用RNA Wash Buffer I洗漆吸附柱一次，再用RNA Wash Buffer II洗漆吸附柱一次，室溫放置IOmins ；
洗脫:用RNase-Free的水100_200ul洗脫柱子，即得到鈣化組織總RNA。
[0006]所述液氮研磨鈣化組織中Trizol的加入量為25_50mg 鈣化組織/ml Trizol來(lái)加入。
[0007]所述充分裂解中Trizol的加入量為25_50mg 鈣化組織/ml Trizol來(lái)加入； 任選的，所述室溫靜止10分鐘，期間2分鐘顛倒混勻一次；
所述提取為充分裂解后的小管在4°C, 1000Orpm離心2mins,將上清轉(zhuǎn)移到新的小管；上清按照200ul氯仿/ml Trizol加入200ul的氯仿,顛倒混勻30s,室溫靜置15min后高速離心，使不溶物沉于管底；離心后的樣品分為三層，最上層是溶有RNA的水相，把該水相轉(zhuǎn)移到另一新的小管，按Iml 75%乙醇/ml Triol加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸優(yōu)選的；
所述高速離心條件為:4°C, 1000Orpm離心lOmins。
[0008]所述鈣化組織是造礁珊瑚，紅柳珊瑚；鯽魚魚鱗表面的硬鱗層。
[0009]采用本發(fā)明方法提取的鈣化組織總RNA的收率高，并且純度高、質(zhì)量、完整性好，可以滿足分子生物學(xué)研究應(yīng)用。
[0010]一般認(rèn)為鈣化組織所含的活細(xì)胞數(shù)相對(duì)交少，細(xì)胞中的RNA含量也較少，而本發(fā)明方法中，采取了充分、分步研磨，使其中的RNA成分能充分提取出來(lái)，同時(shí)與試劑盒相結(jié)合，得到完整性好、純度高的RNA。
[0011]本發(fā)明的制備方法具有如下優(yōu)點(diǎn):提取RNA的方法快速、簡(jiǎn)便、整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程僅需2-3小時(shí)即可完成；通過(guò)用五洲東方的BD-2000型超微量紫外分光光度計(jì)(型號(hào):BD-2000，廠商:五洲東方)測(cè)定RNA的濃度和安捷倫2100生物分析儀(型號(hào):agilent G2939A，廠商:安捷倫)對(duì)RNA純度和完整性檢測(cè)表明，所提取的RNA純度高、質(zhì)量、完整性好，為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和使用RT-PCR檢測(cè)法提供理想、合格的RNA樣品。同時(shí)經(jīng)過(guò)多次的對(duì)比實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果表明:用本法提取鈣化組織中的RNA不含有破壞RNA和抑制逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)的因子。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是所提取的RNA的電泳圖；
圖2是所提取的RNA進(jìn)行保溫試驗(yàn)后的電泳圖；
圖3是鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)RNA的安捷倫2100生物分析儀檢測(cè)結(jié)果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒模擬RNA凝膠電泳結(jié)果圖；
圖4是紅柳珊瑚RNA的安捷倫2100生物分析儀檢測(cè)結(jié)果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒模擬RNA凝膠電泳結(jié)果圖；
圖5是鯽魚魚鱗表面的硬鱗層RNA的安捷倫2100生物分析儀檢測(cè)結(jié)果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒模擬RNA凝膠電泳結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0014]實(shí)施例1: RNA的提取
(O液氮研磨組織:用鐵錘等硬物從珊瑚礁上敲下一塊鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種)和紅柳珊瑚組織；用DEPC·水處理并滅菌后的剪刀分別剪下鯽魚魚鱗表面的硬鱗層，放于液氮預(yù)冷的研缽中，加入少量液氮敲碎迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，研磨到塊狀直徑小于0.5cm的顆粒時(shí)將樣品轉(zhuǎn)移到2mlEP管中，先加入500ulTrizol,(整個(gè)實(shí)驗(yàn)按 50-100mgRNA/ml Trizol 需要加入 Iml Trizol,(參見(jiàn) Trizol 使用說(shuō)明書，廠商:上海閃晶分子生物技術(shù)研究所)。Trizol先用一半的量，另一半的量在(2)中補(bǔ)齊，因?yàn)檠心r(shí)間長(zhǎng)，加Trizol防止RNA降解)，再加液氮繼續(xù)研磨成粉末狀，直至直徑約Imm或小于Imm為止；
(2)充分裂解:將(I)所得粉末轉(zhuǎn)移到RNase-Free的1.5ml小管中，加入500ulTrizol試劑,補(bǔ)足(I)中所述一半的量,溫和混勻，室溫靜置10 mins,期間2分鐘顛倒混勻一次，消化裂解細(xì)胞，使得核糖核酸(RNA)更容易從細(xì)胞中釋放出來(lái)；
(3)提取:將(2)步的小管在4°C，1000Orpm離心2mins，將上清轉(zhuǎn)移到新的小管(去除礁石粉末)。上清按照200ul氯仿/ml Trizol加入200ul的氯仿,顛倒混勻30s,室溫靜置15min (氯仿可以有效的使有機(jī)相和無(wú)機(jī)相迅速分離，氯仿本身也對(duì)蛋白有變性作用，然后析出變性蛋白)，高速離心，使不溶物沉于管底。高速離心條件為:4°C，1000Orpm離心IOmins，離心后的樣品分為三層，最上層是溶有RNA的水相，把該水相轉(zhuǎn)移到另一新的小管，切忌吸到其它相(蛋白)，按Iml 75%乙醇/ml Triol加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸；
(4)吸附:將上步所得轉(zhuǎn)移到E.Z.N.A.? Total RNA Kit II (50)(商購(gòu)來(lái)源:OMEGA ;貨號(hào):R6934-01)試劑盒的吸附柱上，靜置5mins，5000rpm離心30mins，RNA結(jié)合到吸附柱上；
(5)洗滌:用 E.Z.N.A.? Total RNA Kit II (50)(商購(gòu)來(lái)源:0MEGA ;貨號(hào):R6934-01)試劑盒中的 RNA Wash Buffer I 洗滌吸附柱一次，用 Ε.Ζ.N.A.? Total RNA Kit II (50)(商購(gòu)來(lái)源=OMEGA ;貨號(hào):R6934-01)試劑盒中的RNA Wash Buffer II洗滌吸附柱一次，室溫放置lOmins。通過(guò)使用RNA Wash Buffer I和RNA Wash Buffer II兩次洗漆去除蛋白復(fù)合物，使吸附柱上的核糖核酸(RNA)更純凈。
[0015](6)洗脫:用RNase-Free的水IOOul洗脫柱子，即得到鈣化組織總RNA，_80°C保存?zhèn)溆?
(7)檢測(cè)RNA溶液的濃度和吸光度:
通過(guò)用五洲東方的BD-2000型超微量紫外分光光度計(jì)(型號(hào):BD-2000，廠商:五洲東方)測(cè)定RNA的濃度和吸光度，濃度為:鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種):80ng/ul，有l(wèi)OOul。紅柳珊瑚組織:160ng/ul，有l(wèi)OOul，鯽魚魚鱗表面的硬鱗層:119ng/ul，有100ul。檢測(cè)RNA溶液的吸光度為:鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種):0D260/0D280=1.98, A260/A230=2.1。紅柳珊瑚組織:0D260/0D280=1.97，A260/A230=2.2，鯽魚魚鱗表面的硬鱗層:0D260/0D280=2.0, A260/A230=2.2。此結(jié)果滿足當(dāng) 0D260/0D280 的比值為 1.8-2.0 時(shí)，RNA 中蛋白或者其他有機(jī)物的污染很少，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)或者影響很小，可以忽略不計(jì)。A260/A230的比值表明RNA的純度，其值介于2.0和2.4之間，表明裂解液中沒(méi)有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇?xì)埩簦瑹o(wú)需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。[0016](8)電泳檢測(cè):用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，其中泳道Marker為DL2000;泳道I為鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)；泳道2為紅柳珊瑚；泳道3為鯽魚魚鱗表面的硬鱗層。從圖1可以看出，有28S和18S的帶，就說(shuō)明提取成功，28S和帶比18S的帶亮2倍，并且后面沒(méi)有拖帶，說(shuō)明沒(méi)被降解，完整性好。28S和18S大概在DL2000marker的2000bp以下；真核生物的核糖體rRNA，在小亞單位中的為18 srna核苷酸單鏈:1900nt，即1900個(gè)堿基，950個(gè)堿基對(duì)，等于950bp ;在大亞單位中的為28srna核苷酸單鏈:4700nt，即4700個(gè)堿基，等于2350個(gè)堿基對(duì)，多拷貝4700/3=1566bp。一般28srna和18 srna電泳圖參見(jiàn)文獻(xiàn):《一種簡(jiǎn)單有效的植物RNA提取方法_張容.pdf.》。
[0017](9)保溫試驗(yàn)，保溫試驗(yàn)后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖譜見(jiàn)圖2。
[0018]從三份RNA溶液中各吸取兩份約1000 ng的RNA加入0.5 ml的離心管中，用ρΗ7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70°C的恒溫水浴中，保溫I h。另一份放置在_20°C冰箱中保存I h。隨后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中的1、2、3泳道分別代表鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種)、紅柳珊瑚組織、鯽魚魚鱗表面的硬鱗層在70°C的恒溫水浴中，保溫I h后的泡膠結(jié)果；圖2中的4、5、6泳道分別代表鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚的一種)、紅柳珊瑚組織、鯽魚魚鱗表面的硬鱗層在-20°C冰箱中保存I h后的跑膠結(jié)果?？梢钥闯觯鲜鰞煞N條件處理后RNA跑膠的條帶一致，無(wú)明顯差別，28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則說(shuō)明RNA溶液中沒(méi)有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。
[0019]實(shí)施例2
用安捷倫2100生物分析儀(型號(hào):agilent G2939A，廠商:安捷倫)測(cè)定RNA濃度和完整性，本儀器說(shuō)明書中指出RNA完整性數(shù)值(RIN)大于I和28s/18s在1_3之間為RNA完整性較好；用安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號(hào):5067-1511)模擬RNA凝膠電泳圖，上樣量Iul，模擬電泳圖的28s和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。
[0020]圖3為鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)RNA的安捷倫2100生物分析儀(型號(hào):agilentG2939A，廠商:安捷倫)檢測(cè)結(jié)果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號(hào):5067-1511)模擬RNA凝膠電泳結(jié)果，從圖中可以看出RNA完整性數(shù)值(RIN)等于8.1，符合完整性數(shù)值(RIN)大于7的要求，28s/18s等于1.2，符合28s/18s在1-3之間的要求，所以本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為本次提取的鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)RNA完整性好；用安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號(hào):5067-1511)模擬RNA凝膠電泳圖，上樣量lul。模擬電泳圖的28s和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認(rèn)為本次提取的鋸齒刺星珊瑚(造礁珊瑚)RNA的質(zhì)量是好的。
[0021]圖4為紅柳珊瑚RNA的安捷倫2100生物分析儀(型號(hào):agilent G2939A，廠商:安捷倫)檢測(cè)結(jié)果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號(hào):5067-1511)模擬RNA凝膠電泳結(jié)果，從圖中可以看出RNA完整性數(shù)值(RIN)等于7.3，符合完整性數(shù)值(RIN)大于7的要求，28s/18s等于2.0，符合28s/18s在1_3之間的要求，所以本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為本次提取的紅柳珊瑚RNA完整性好。用安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號(hào):5067-1511)模擬RNA凝膠電泳圖，上樣量lul。模擬電泳圖的28s和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認(rèn)為本次提取的紅柳珊瑚的RNA的質(zhì)量是好的。
[0022]圖5為鯽魚魚鱗表面的硬鱗層RNA的安捷倫2100生物分析儀(型號(hào):agilentG2939A，廠商:安捷倫)檢測(cè)結(jié)果和安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號(hào):5067-1511)模擬RNA凝膠電泳結(jié)果，從圖中可以看出RNA完整性數(shù)值(RIN)等于8.5，符合完整性數(shù)值(RIN)大于7的要求，28s/18s等于2.8，符合28s/18s在1_3之間的要求，所以本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為本次提取的鯽魚魚鱗表面的硬鱗層RNA完整性好。用安捷倫RNA6000 Nano試劑盒(貨號(hào):5067-1511)模擬RNA凝膠電泳圖，上樣量lul。模擬電泳圖的28s和18s條帶明亮、清晰、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰)，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則認(rèn)為本次提取的鯽魚魚鱗表面的硬鱗層的RNA的質(zhì)量是好的。
[0023]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種從鈣化組織中提取RNA的方法，其特征在于，包括如下步驟， 液氮研磨鈣化組織:將鈣化組織在液氮中進(jìn)行研磨直到塊狀直徑小于0.5cm的顆粒時(shí)，加入Trizol,再加液氮繼續(xù)研磨成粉末狀,直至直徑約Imm或小于Imm為止； 充分裂解:將所得粉末轉(zhuǎn)移到RNase-Free的1.5ml小管中，加入Trizol試劑，溫和混勻，室溫靜置，期間顛倒混勻一次，消化裂解細(xì)胞； 提取:將小管在4°C離心，將上清轉(zhuǎn)移到新的小管；上清加入氯仿，顛倒混勻30s，室溫靜置15min后離心，離心后的樣品分為三層，將最上層的水相轉(zhuǎn)移到另一新的小管，加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸； 吸附:將上步所得轉(zhuǎn)移到E.Z.N.A.? Total RNA Kit II (50)試劑盒的吸附柱上，靜置后離心，RNA結(jié)合到吸附柱上； 洗漆:用RNA Wash Buffer I洗漆吸附柱一次，再用RNA Wash Buffer II洗漆吸附柱一次，室溫放置IOmins ； 洗脫:用RNase-Free的水100_200ul洗脫柱子，即得到鈣化組織總RNA。
2.權(quán)利要求1所述的提取RNA的方法，其特征在于，所述液氮研磨鈣化組織中Trizol的加入量為25-50mg鈣化組織/ml Trizol來(lái)加入。
3.權(quán)利要求1所述的提取RNA的方法，其特征在于，所述充分裂解中Trizol的加入量為25-50mg鈣化組織/ml Trizol來(lái)加入； 任選的，所述室溫靜止10分鐘，期間2分鐘顛倒混勻一次。
4.權(quán)利要求1所述的提取RNA的方法，其特征在于，所述提取為充分裂解后的小管在4°C, 1000Orpm離心2mins,將上清轉(zhuǎn)移到新的小管；上清按照200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，顛倒混勻30s，室溫靜置15min后高速離心，使不溶物沉于管底；離心后的樣品分為三層，最上層是溶有RNA的水相，把該水相轉(zhuǎn)移到另一新的小管，按Iml 75%乙醇/ml Triol加入75%乙醇溶液，輕輕混勻沉淀核酸優(yōu)選的； 所述高速離心條件為:4°C, 1000Orpm離心lOmins。
5.權(quán)利要求1所述的提取RNA的方法，其特征在于，所述鈣化組織是造礁珊瑚，紅柳珊瑚；鯽魚魚鱗表面的硬鱗層。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103667258SQ201310648321
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】陳建明, 暨國(guó)彪, 郭輝革, 楊慧 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所