沙漠齒肋赤蘚實(shí)時(shí)熒光定量pcr內(nèi)參分子的篩選方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種沙漠齒肋赤蘚實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法，該方法利用齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，選取15個(gè)內(nèi)參候選基因，以15個(gè)內(nèi)參基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因特異引物，選取受10種非生物脅迫和沒(méi)有脅迫（對(duì)照）的齒肋赤蘚配子體為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用geNorm，NormFinder和Refinder軟件進(jìn)行熒光定量數(shù)據(jù)的分析，從而篩選出齒肋赤蘚開(kāi)展各種非生物脅迫下熒光定量研究的最適合，最穩(wěn)定的內(nèi)參分子是CDPK和α-TUB2。用本發(fā)明所述方法可避免不同非生物脅迫下的齒肋赤蘚配子體材料在RNA質(zhì)量，產(chǎn)量及反轉(zhuǎn)錄效率等上的存在的誤差，能更好的對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，提高了該種基因定量研究的準(zhǔn)確性和可靠性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】沙漠齒肋赤蘚實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于沙漠蘚類(lèi)齒肋赤蘚各種非生物脅迫下實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究的內(nèi)參分子的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干旱，高鹽等非生物脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要因素，每年導(dǎo)致作物減產(chǎn)達(dá)50%以上。隨著全球氣候變暖，溫室效應(yīng)和土地沙漠化的加劇，干旱問(wèn)題將日益突出，干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響也將更加嚴(yán)重。目前，利用干旱脅迫相關(guān)基因提高植物的抗旱能力，已經(jīng)成為植物抗逆分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)和植物抗逆基因工程重要的研究方向。
[0003]干旱區(qū)植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中積累的抗干旱基因資源是開(kāi)展種質(zhì)創(chuàng)新的源動(dòng)力。干旱區(qū)嚴(yán)酷的自然環(huán)境孕育了特殊，天然，珍稀的逆境植物資源。荒漠極端耐旱蘚類(lèi)齒肋赤蘚即為典型代表。齒肋赤蘚(Syntrichia caninervis Mitt.)隸屬叢蘚科、赤蘚屬,為典型的變水植物，是構(gòu)成蘚類(lèi)結(jié)皮的優(yōu)勢(shì)種，自然干燥狀態(tài)下呈灰黑色，似一層“殼”分布在沙漠表面，形成有重要生態(tài)意義的苔蘚生物結(jié)皮，不僅具有較強(qiáng)的抗逆能力，而且在維持荒漠生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和受損生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)重建中起著重要的作用。此外，一旦遇到降水，齒肋赤蘚即在30s內(nèi)迅速通過(guò)再水化過(guò)程而“復(fù)原”呈鮮活的綠色，并開(kāi)始執(zhí)行光合作用，其獨(dú)特的生理特性及抗旱性和耐熱性的分子調(diào)控機(jī)制已成為國(guó)內(nèi)外相關(guān)科學(xué)的研究熱點(diǎn)。同時(shí)，長(zhǎng)期的環(huán)境壓力使得該種具有極好的抗旱，抗高溫等抵抗多種非生物脅迫的能力，其體內(nèi)必定蘊(yùn)含著豐富的抗逆基因資源。目前，從極端抗旱蘚類(lèi)齒肋赤蘚中發(fā)掘優(yōu)質(zhì)抗逆基因資源已經(jīng)展開(kāi)，特別是齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，更是為該種的基因研究提供了很好的平臺(tái)。目前，從齒肋赤蘚中克隆，分析ALDH，HSP70, DREB等家族基因的工作正在展開(kāi)。而要了解齒肋赤蘚的抗逆機(jī)制以及挖掘豐富的抗逆基因資源，很關(guān)鍵的一個(gè)方法就是要分離這些基因并迅速、準(zhǔn)確地定量檢測(cè)抗旱基因在各種非生物脅迫下的表達(dá)。傳統(tǒng)的印跡雜交，生物芯片技術(shù)和RT-PCR等手段在實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)抗旱基`因表達(dá)量上，或存在缺陷，或價(jià)格昂貴、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著分子生物學(xué)各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)成為目前基因表達(dá)定量檢測(cè)的主要方法，該法不僅靈敏度高，樣品消耗量少，能檢測(cè)出低豐度靶基因表達(dá)量，定量線性寬，但是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性很大程度上依賴(lài)于篩選適合的內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，從而避免不同標(biāo)本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄率上可能存在的差別。因此，合適穩(wěn)定的內(nèi)參基因的選擇則是齒肋赤蘚抗逆機(jī)制和抗逆基因研究的基礎(chǔ)。
[0004]以往對(duì)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性研究證實(shí)，任何一種內(nèi)參基因的所謂恒定表達(dá)都只是在一定類(lèi)型的植物或特定實(shí)驗(yàn)因素作用下的相對(duì)恒定，在其他類(lèi)型的植物中或不同實(shí)驗(yàn)處理下穩(wěn)定性則很可能是變化的。若盲目的參考別的物種中穩(wěn)定的一個(gè)內(nèi)參或或幾個(gè)內(nèi)參基因，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能得到錯(cuò)誤甚至是相反的結(jié)論。近年來(lái)，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性問(wèn)題近年來(lái)越來(lái)越受爭(zhēng)議和關(guān)注。隨著人們對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定行問(wèn)題的越來(lái)越重視，目前，已開(kāi)發(fā)出基于Excel程序多種軟件，用于評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和變異系數(shù)，其中應(yīng)用最普遍的為GeNorm和NormFinder程序。[0005]綜上所述，荒漠極端耐旱蘚類(lèi)齒肋赤蘚是研究沙漠蘚類(lèi)抗逆機(jī)制和挖掘優(yōu)良抗逆基因的好材料。研究和篩選齒肋赤蘚中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是進(jìn)行該種基因定量研究(熒光定量PCR實(shí)驗(yàn))的先決條件。近年來(lái)，做為極端抗旱蘚類(lèi)的齒肋赤蘚的分子水平工作陸續(xù)展開(kāi)，從齒肋赤蘚中已克隆出一些抗逆基因，如乙醛脫氫酶基因ALDH21 (NCBI登錄號(hào):GQ245973)，特別是近年來(lái)本課題組對(duì)齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組，蛋白組等高通量測(cè)序結(jié)果的相繼獲得，更是加快了齒肋赤蘚的分子研究工作。很多抗逆基因的特性和功能亟待研究，但關(guān)于該種的內(nèi)參基因的序列資料未見(jiàn)報(bào)道，最合適內(nèi)參分子的研究和篩選工作更是空白。因此，本發(fā)明就旨在找到一種在非生物脅迫條件下齒肋赤蘚開(kāi)展實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究最穩(wěn)定，最合適的內(nèi)參分子的篩選方法，為以后大規(guī)模開(kāi)展抗逆基因特性及功能研究奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于，提供一種沙漠齒肋赤蘚實(shí)時(shí)突光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法，該方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究苔蘚植物抗逆相關(guān)基因功能時(shí)，缺少適用的、可靠的、表達(dá)恒定的內(nèi)參分子，提出了一種適用于沙漠蘚類(lèi)齒肋赤蘚在非生物脅迫條件下開(kāi)展實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究的最穩(wěn)定，最合適的內(nèi)參分子的篩選方法；利用齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)庫(kù)，選取了 15個(gè)齒肋赤蘚候選內(nèi)參基因，并以這些基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因特異引物。選取受10種非生物脅迫和沒(méi)有脅迫(對(duì)照)的齒肋赤蘚為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行突光定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,運(yùn)用三大內(nèi)參穩(wěn)定性評(píng)估軟件包括geNorm,NormFinder和Refinder進(jìn)行突光定量數(shù)據(jù)的分析,從而篩選出齒肋赤蘚開(kāi)展各種非生物脅迫下熒光定量研究的最適合，最穩(wěn)定的內(nèi)參分子。運(yùn)用本發(fā)明所述方法篩選的內(nèi)參分子，可避免在多種非生物脅迫下齒肋赤蘚樣本在RNA產(chǎn)量，質(zhì)量及反轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差另O，能更好的對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，提高對(duì)該種基因定量研究的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0007]本發(fā)明所述的一種沙漠蘚類(lèi)齒肋赤蘚實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法，按下列步驟進(jìn)行:`[0008]a、利用齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，挑選15個(gè)齒肋赤蘚內(nèi)參候選基因，并以挑選的15個(gè)齒肋赤蘚序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了 15對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因引物，其中15個(gè)內(nèi)參基因的核苷酸序列及設(shè)計(jì)的15對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列為:
[0009]> 序列 I 齒肋赤蘚 SyntrichiacaninervisActin (ACT)核苷酸序列
[0010]ATGGCTGATGCTGAGGATGTCCAGCCTTTGGTGTGCGACAATGGATCGGGGATGGTTAAGGCCGGATTCGCCGGAG
[0011]ATGACGCCCCGCGTGCCGTATTTCCCAGCATTGTTGGGCGCCCGAGACACACCGGTGTGATGGTGGGCATGGGACA
[0012]GAAAGACGCGTATGTGGGCGACGAGGCGCAGTCCAAGAGGGGTATCCTGACGCTGAAGTACCCGATCGAGCACGG
[0013]CGTGGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTGCGTGTGGCCCCCGA
[0014]GGAGCACCCGGTGCTGCTCACGGAGGCGCCTCTCAATCCCAAGGCCAACAGGGAGAAGATGACGCAGATCATGTT
[0015]CGAGACCTTCAACGTGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCGGTGCTGTCGCTGTACGCCAGTGGGCGAACCACC
[0016]GGAATTGTGCTGGATAGTGGAGACGGTGTGACTCACACAGTGCCCATCTATGAGGGGTACGCCTTGCCTCACGCCA
[0017]TTCTGCGGCTG
[0018]GACTTGGCCGGTCGCGACTTGACGGACGCGCTGATGAAGATTCTGACGGAGCGTGGTTACTCGTTCACCACCACGG
[0019]CCGAGCGCGAGATCGTGCGTGACATGAAGGAGAAGCTGGCGTACGTGGCAATCGACTTTGAGCAGGAGCTCGACA
[0020]CAGCGCGCTCATCGTCCTCGCTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCGGACGGGCAGGTGATCACGATCGGCGCGGAGC
[0021]GGTTCAGGTGCCCGGAGGTGCTGTTCAACCCGTCGCTGATCGGGATGGAAGCTGCGGGCATTCACGAGACCACTTA
【權(quán)利要求】
1.一種沙漠蘚類(lèi)齒肋赤蘚實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參分子的篩選方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行:a、利用齒肋赤蘚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，挑選15個(gè)齒肋赤蘚內(nèi)參候選基因，并以挑選的15個(gè)齒肋赤蘚序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了 15對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因引物，其中15個(gè)內(nèi)參基因的核苷酸序列及設(shè)計(jì)的15對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列為: 序列I齒肋赤蘚SyntrichiacaninervisActin核苷酸序列
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述的內(nèi)參基因?yàn)?8s核糖體RNA，肌動(dòng)蛋白，α微管蛋白1，α微管蛋白2，β微管蛋白，甘油醛_3_磷酸脫氫酶I，甘油醛-3-磷酸脫氫酶2，泛素蛋白連接酶1，泛素蛋白連接酶2，鈣依賴(lài)型蛋白激酶，F(xiàn)-盒蛋白，轉(zhuǎn)錄延伸因子，肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，SAND蛋白，組蛋白3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中總共11齒肋赤蘚配子體為完全復(fù)水24h后的經(jīng)各種脅迫處理后的去除假根的葉片組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中非生物脅迫處理的條件為:分別用20%聚乙二醇6000，250mM氯化鈉，100 μ M脫落酸，0.5mM硫酸銅，50mM雙氧水，0.5w/m2紫外輻射模擬干旱，高鹽，脫落酸，重金屬，氧化和紫外脅迫；將齒肋赤蘚分別置于溫度4°C冰箱和溫度42°C光照培養(yǎng)箱模擬低溫和高溫脅迫；用10%PEG+溫度42°C模擬干熱混合脅迫，機(jī)械損傷脅迫是通過(guò)剪斷葉片實(shí)現(xiàn)；所有處理均是在脅迫6h后取材，且取得的材料立即置于液氮中，并迅速置于溫度_80°C冰箱儲(chǔ)存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中實(shí)時(shí)熒光定量PCR模板均為I μ gRNA反轉(zhuǎn)得到的cDNA的5倍稀釋液，且熒光定量程序?yàn)?第一步是預(yù)變性:溫度95°C -30秒；第二步是PCR反應(yīng)階段，溫度95°C -5秒，溫度58°C -60°C，30秒，40個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)；第三步是溶解曲線分析，溫度65°C _951:，溫度651:在30秒逐步升至951:，每0.51:收集一次熒光 信號(hào)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103866007SQ201410057384
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】張道遠(yuǎn), 李小雙, 李海燕, 楊紅蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所