SmCPS4蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種SmCPS4蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明公開的一種蛋白，為如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.3所示的蛋白；（2）將SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開的SmCPS4基因與丹參中另一個(gè)SmKSL2基因聯(lián)合，介導(dǎo)催化形成丹參中一種新的半日花烷型二萜類化合物13-epi-manoyl?oxide，這兩個(gè)基因是首次發(fā)現(xiàn)的植物中能催化形成13-epi-manoyl?oxide結(jié)構(gòu)類型的二萜合酶基因，該合成途徑的解析為利用合成生物學(xué)生產(chǎn)類似化合物，深入研究此類化合物的藥理作用提供了重要的基礎(chǔ)。
【專利說明】SmCPS4蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種SmCPS4蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]藥用植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)為一味常用中藥，素有“一味丹參，功同四物”的美稱，具有活血化瘀，理氣止痛的功效，是眾多復(fù)方、保健品的主要成分。其中脂溶性的松香烷型丹參酮類化合物為丹參中主要的二萜類化合物。二萜合酶基因是形成二萜類化合物的關(guān)鍵酶基因(Trapp SC, Croteau R.Genomic Organization of Plant TerpeneSynthases and Molecular Evolutionary Implications.Genetics, 2001，158:811 - 832)。在雙子葉植物中，二職類化合物大多通過兩類二職合酶:CPS (copalyl pyrophosphatesynthase)和KSL (kaurene-like synthase)連續(xù)催化來完成從直鏈前體物牛兒基物牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)到二職母核的環(huán)化。通過基因組序列分析(Ma, Y.M., Yuan, L.C., Wu, B., Li, X.E., Chen, S.L., and Lu.S.F.(2012).Genome-w1.de identification and characterization of novel genes involved in terpenoid biosynthesis in Salvia miltiorrhiza.J.Exp.Bot.63:2809-2823.)發(fā)現(xiàn)丹參基因組內(nèi)存在5個(gè)CPS和2個(gè)KSL基因。其中SmCPSl和SmKSLl已被證實(shí)為參與丹參酮生物合成的關(guān)鍵酶基因(Gao, ff., Hillwig, M.L., Huang, L.Q., Cui, G.H., Wang, X.Y., Kong, J.Q., Yang,B., Peters, R.J.(2009).A functional genomics approach to tanshinonebiosynthesis provides stereochemical insights.0rg.lett.11:5170-5173.X在菊科植物 Grindelia robusta 中發(fā)現(xiàn)的 GrTPSl 和 GrTPS6 能催化 GGPP 形成 manoyl oxide(Zerbe,P., Hamberger, B., Yuen, Μ., Chiang, A., Sandhu, H., Madilao, L., Nguyen, A., Hamberger, B.,Bach, S.S., and Bohlmann, J.(2013).Gene Discovery of Modular Diterpene Metabolismin Nonmodel Systems.Plant Physiol.162:1073 - 1091.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種SmCPS4蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明提供的一種蛋白，為如下(I)或(2)所示:
[0005](I) SEQ ID N0.3 所示的蛋白；
[0006](2)將SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
[0007]上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008]上述編碼基因中，所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N:
[0009]I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0010]2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0011]3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。[0012]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]一種蛋白組合物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，由上述蛋白和SEQ ID N0.4所示的蛋白組成。
[0014]上述蛋白在合成(13E)_8 α-hydroxylabden-15-yl diphosphate 中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]上述蛋白在催化物牛兒基物牛兒基焦磷酸合成(13Ε)-8 α-hydroxylabden-15-yldiphosphate中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016](13E) -8 a -hydroxy labden-15-y I diphosphate 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖 6 中的 LDPP所
/Jn ο
[0017]上述蛋白組合物在合成13-ep1-manoyl oxide中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]上述蛋白組合物在催化物牛兒基物牛兒基焦磷酸合成13-ep1-manoyl oxide中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019]上述蛋白或上述蛋白組合物在丹參中合成13-ep1-manoyl oxide中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]13-ep1-manoyl oxide的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖6中所不。
[0021]本發(fā)明提供的SmCPS`4基因是丹參地上部分特別是花萼特異表達(dá)的基因，其與丹參中另一個(gè)SmKSL2基因聯(lián)合，介導(dǎo)催化形成丹參中一種新的半日花烷型二萜類化合物13-ep1-manoyl oxide,這兩個(gè)基因是首次發(fā)現(xiàn)的植物中能催化形成13-ep1-manoyl oxide結(jié)構(gòu)類型的二職合酶基因，13-ep1-manoyl oxide的該合成途徑的解析為利用合成生物學(xué)生產(chǎn)類似化合物，深入研究此類化合物的藥理作用提供了重要的基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為SmCPS4和SmKSL2與其他已知功能二萜合酶基因的分子進(jìn)化樹。
[0023]圖2為丹參SmCPS4和SmKSL2基因的表達(dá)。
[0024]圖3為丹參SmCPS4重組蛋白的純化。
[0025]圖4為丹參SmCPS4重組蛋白的酶促反應(yīng)結(jié)果。
[0026]圖5為丹參SmCPS4和SmKSL2重組蛋白的酶促反應(yīng)和植株中13-印1-manoyloxide化合物的檢測(cè)。
[0027]圖6為SmCPS4和SmKSL2聯(lián)合催化GGPP產(chǎn)生13_印1-manoyl oxide的反應(yīng)過程?！揪唧w實(shí)施方式】
[0028]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030]丹參(Salvia miltiorrhiza)在文獻(xiàn)“崔光紅,王學(xué)勇，馮華,趙靜雪,黃貓琦.丹參乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶基因全長克隆和SNP分析.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45 (6): 785-790)”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。
[0031]SMART? RACE cDNA Amplification Kit 購自 Clontech 公司。[0032]pMD19-T 載體購自 Takara 公司。
[0033]LA Taq 購自 Takara 公司。
[0034]Labdenediol購自云南西力生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為BBP02205，CAS號(hào)為10267-31-9。
[0035]N-Methyl-N- (trimethylsilyl) trif luoroacetamide (MSTFA)購自 sigma 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為394866，CAS號(hào)為24589-78-4。
[0036]吡啶購自sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為437611，CAS號(hào)為110-86-1。
[0037]實(shí)施例1、丹參SmCPS4和SmKSL2全長cDNA序列的克隆
[0038]基因組序列分析顯示，丹參的SmCPS4和SmKSL23 ’端均為完整序列(Ma, Y.M., Yuan, L.C., Wu, B., Li, X.E., Chen, S.L., and Lu.S.F.(2012).Genome-wideidentification and characterization of novel genes involved in terpenoidbiosynthesis in Salvia miltiorrhiza.J.Exp.Bot.63:2809-2823.),需要克隆 5’端形成完整 cDNA 序列。采用 SMART? RACE cDNA Amplification Kit 擴(kuò)增 SmCPS4 和 SmKSL2 的 5’末端，按照說明書進(jìn)行操作。
[0039]一、設(shè)計(jì)并合成如下引物
[0040]CPS4-GSP1:5’ -CCAAGCTGAAGAGCAGTGATGTGGGCTC-3’
[0041]KSL2-GSP1:5，-TTCCTGCCATGCTTGATTATGCCAGAGG-3，。
[0042]二、Trizol 法提取丹參的總 RNA，利用 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒中引物5’ -Q)S primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。
[0043]以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以UPM和CPS4-GSPI為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SmCPS4基因的cDNA5’末端，目的產(chǎn)物為808bp，該序列包含SmCPS4基因的5’末端完整序列。
[0044]以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以UPM和KSL2-GSPI為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SmKSL2基因的cDNA5’末端，目的產(chǎn)物為705bp，該序列包含SmKSL2基因的5’末端完整序列。
[0045]5，-CDS primer 和 UPM 引物為 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 自帶。
[0046]PCR 程序:94°C預(yù)變性 5min ；94V 30s，68°C 30s，72°C 3min，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。
[0047]三、使用LA Taq采用LA-PCR方法，進(jìn)行如下反應(yīng):
[0048]Trizol 法提取丹參的總 RNA，以 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒中引物5’ -CDS primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，CPS4F和CPS4R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SmCPS4基因的全長cDNA序列(如SEQ ID N0.1所示)。
[0049]Trizol 法提取丹參的總 RNA，以 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒中引物5’ -CDS primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，KSL2F和KSL2R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SmKSL2基因的全長cDNA序列(如SEQ ID N0.2所示)。
[0050]引物如下:
[0051]CPS4F:5’ ~GCGATATCATGTCATTTGCGTCCAACGC~3J ；
[0052]CPS4R: 5’ -TGCGGCCGCCTAGACTATTTTTTCAAACAATAC-3’。
[0053]KSL2F:5’ -GCGATATCATGGCGCTTCC TCTCTCCACTTG-3’ ；[0054]KSL2R: 5’ -GGAAAGCGGCCGCTCAACCATGAAGCTTTGATAATCC-3’。
[0055](下劃線所示序列為酶切識(shí)別位點(diǎn))
[0056]PCR 程序:94°C預(yù)變性 5min ；94°C 30s，55。。30s，72。。3min，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。
[0057]四、將SmCPS4基因的全長cDNA序列和SmKSL2基因的全長cDNA序列分別插入PMD19-T載體中得到重組質(zhì)粒pMD19T-SmCPS4和pMD19T_SmKSL2，將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序，并用于原核表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0058]五、SmCPS4和 SmKSL2
[0059]SmCPS4基因(SEQ ID N0.1所示)，編碼776個(gè)氨基酸殘基(如SEQ ID N0.3所示)。
[0060]SmKSL2基因(SEQ ID N0.2所示)，編碼807個(gè)氨基酸殘基(如SEQ ID N0.4所示)。[0061 ] 實(shí)施例2、SmCPS4和SmKSL2的基因表達(dá)譜
[0062]為進(jìn)一步探索SmCPS4和SmKSL2的功能，利用半定量RT-PCR對(duì)來源于丹參花期的13個(gè)組織(依次為花期的木栓層，皮層，木質(zhì)部，莖，葉，小花(花瓣短于花萼)，待開放花(花瓣長于花萼，但未開放)，盛開花，花瓣，花萼，雄蕊，雌蕊，未成熟種子，編號(hào)依次為1-13)和發(fā)芽第三天的幼根(編號(hào)為14)和幼葉(編號(hào)為15)進(jìn)行基因表達(dá)譜的研究。編號(hào)對(duì)應(yīng)的組織示意圖如圖2A所示,半定量RT-PCR結(jié)果如圖2B所示。
[0063]利用Trizol法提取各組織的總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TranscriptFirst-strand cDNA Synthesis Super Mix (購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)反轉(zhuǎn)錄得到 cDNAo`[0064]以cDNA為模板，以CPS4-F1和CPS4-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定SmCPS4基因；
[0065]以cDNA為模板，以KSL2-F1和KSL2-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定SmKSL2基因；
[0066]同時(shí)以cDNA為模板，以actin-F和actin-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定actin基因，作為內(nèi)參。
[0067]引物如下:
[0068]CPS4-F1:5，-CGGCTGGCTTGGGCTACAACAATA-3，；
[0069]CPS4-R1:5’ -TCCCTGGTGACCTCCTCCTTCCCA-3’ ；
[0070]KSL2-F1:5 ’ -TTAGTTTTGGAGGGCAAGAAGAGTGT-3 ’ ；
[0071 ] KSL2-R1:5，-CTCCTGTTTGGTCGTTGAGAAGAATA-3，；
[0072]actin-F:5，-AGGAACCACCGATCCAGACA-3，；
[0073]actin-R: 5，-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3，。
[0074]圖2B 中，CPS4 和 KSL2 分別代表 SmCPS4 和 SmKSL2。
[0075]圖2B表明，SmCPS4基因在莖、葉以及花中均有表達(dá)，特別是花萼中有強(qiáng)烈表達(dá)。在發(fā)芽3天的幼葉中也有明顯表達(dá)，而在幼根及花期植物根中均無表達(dá)。SmKSL2基因在不同組織中均有表達(dá)，沒有顯著的組織表達(dá)特異性。揭示SmCPS4基因?yàn)榈⒌厣喜糠痔禺惐磉_(dá)的基因，其有可能具有新的功能。
[0076]實(shí)施例3、SmCPS4和和SmKSL2的功能分析
[0077]—、大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建
[0078]EcoRV和 NotI 雙酶切 pMD19T_SmCPS4，得到基因片段；EcoRV和 NotI 雙酶切 pET32a( + )，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒pET-SmCPS4 ；[0079]EcoRV和 NotI 雙酶切 pMD19T_SmKSL2，得到基因片段；EcoRV和 NotI 雙酶切 pET32a( + )，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒pET-SmKSL2 ；
[0080]將pET-SmCPS4 和 pET_SmKSL2 送測(cè)序，結(jié)果正確。
[0081]測(cè)序結(jié)果表明，pET-SmCPS4在EcoRV和NotI酶切位點(diǎn)間插入了 SEQ ID N0.1所示的DNA分子；pET-SmKSL2在EcoRV和NotI酶切位點(diǎn)間插入了 SEQ ID N0.2所示的DNA分子。
[0082]將pET-SmCPS4和pET-SmKSL2分別導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株Tuner (DE3)(購自Novagen公司)中，得到pET_SmCPS4重組菌和pET_SmKSL2重組菌。
[0083]同時(shí)用不含目的基因的pET32a ( + )空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Tuner (DE3)作為對(duì)照菌。
[0084]二、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0085]挑取pET-SmCPS4重組菌、pET_SmKSL2重組菌和對(duì)照菌分別接種于2mL的LB液體培養(yǎng)基(含羧芐青霉素50mg/L)中，于37°C振蕩培養(yǎng)過夜。次日按體積比1:100稀釋加入到200mL LB液體培養(yǎng)基(含羧芐青霉素50mg/L)中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0.6時(shí)轉(zhuǎn)入16°C振搖lh，然后加入IPTG至終濃度0.5mM,繼續(xù)于16°C搖床培養(yǎng)10小時(shí)誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)。將菌液用1000Orpm離心5分鐘，棄上清，收集pET_SmCPS4重組菌、pET_SmKSL2重組菌和對(duì)照菌菌體。將各菌體用20mL磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液，含有IOOmM KCl, IOmMMgCl2，體積百分含量10%甘油，2mM DTT)溶解，在冰浴條件下用超聲波處理，12000rpm,4°C離心15分鐘，分別得到SmCPS4、SmKSL2和對(duì)照上清備用。
[0086]三、重組蛋白SmCPS4的純化
[0087]在SmCPS4上清中加入咪唑至終濃度為20mM。上清液使用0.45 μ m濾膜過濾。濾液經(jīng) HisTrap HP (ImL)純化柱(購自 GE Healthcare 公司)，用 12mL Washing buffer(50mmoI.L 1Na2HPO4JOOmmol.L 1NaCl, IOOmmol.L 1 咪唑,IOmmol.L 1MgCl2, pH7.4)梯度漂洗，用 3mL Elution buffer (50mmoI.Tr1Na2HPO4, 300mmo1.L-1NaCUOOmmol.L-1 咪唑，pH7.4)洗脫，得到洗脫液，將洗脫液用PD-1O柱(購自GEHealthcare公司)進(jìn)行脫鹽處理，將緩沖液置換為50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4，體積百分含量10%甘油，2mM DTT, IOmM MgCl2),將脫鹽處理的洗脫液經(jīng)Bradford法進(jìn)行蛋白定量，得到濃度為280ng.uL—1的純化重組蛋白 SmCPS4。
[0088]將對(duì)照上清、SmCPS4上清和純化的SmCPS4進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示。圖3中，CPS4 代表 SmCPS4。
[0089]圖3表明，純化后的SmCPS4大小約為95KD，大小與預(yù)期相符。
[0090]四、SmCPS4的酶促活性分析
[0091 ](一)取步驟三純化的SmCPS4和空載體對(duì)照進(jìn)行酶促反應(yīng)
[0092]實(shí)驗(yàn)組未脫磷反應(yīng):酶促反應(yīng)總體系為400uL，其中濃度為280ng.uL—1的SmCPS4重組蛋白200uL，底物為1078ug.mL—1濃度的櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(GGPP) 5uL，余量為195uL50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4，體積百分含量10%甘油，2mM DTT, IOmM MgCl2)，將體系在30°C放置3h后用正己烷萃取3次，合并正己烷層并用氮?dú)獯蹈纱谩?br> [0093]空載體對(duì)照未脫磷反應(yīng):實(shí)驗(yàn)同上述的實(shí)驗(yàn)組未脫磷反應(yīng)，將SmCPS4重組蛋白替換為步驟二制備的對(duì)照上清。[0094]實(shí)驗(yàn)組脫磷反應(yīng):將上述實(shí)驗(yàn)組未脫磷反應(yīng)體系的水相(水相是指酶促反應(yīng)總體系為400uL，其中濃度為280ng.uL—1的SmCPS4重組蛋白200uL，底物為1078ug.mL—1濃度的櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(GGPP) 5uL，余量為195uL50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4，體積百分含量10%甘油，2mM DTT, IOmM MgCl2)，將體系在30°C放置3h后)按照95uL水相加入5uL堿性磷酸酶的比例進(jìn)行脫磷處理。37°C放置過夜后，用正己烷萃取3次，合并正己烷層用氮?dú)獯蹈?，待用?br> [0095]空載體對(duì)照脫磷反應(yīng):實(shí)驗(yàn)同上述的實(shí)驗(yàn)組脫磷反應(yīng)，將SmCPS4重組蛋白替換為步驟二制備的對(duì)照上清。
[0096]將上述各組的提取物在上樣檢測(cè)前用80 μ L體積百分含量為98.5%的N-Methyl-N- (trimethylsilyl) trif luoroacetamide (MSTFA)和 8μ L 體積百分含量為 98%的吡啶在80°C衍生化40min，得到衍生后的產(chǎn)物。
[0097]同時(shí)以Labdenediol為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行上述衍生實(shí)驗(yàn)。
[0098](二)利用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜GC-QqQ-MS進(jìn)行目標(biāo)化合物的檢測(cè)
[0099]GC-QqQ-MS 分析系統(tǒng)為 Agilent7890A GC 配備 Agilent7000B triple quadrupleMS系統(tǒng)。衍生后的各組反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)樣量lyL，splitless模式。氣相色譜柱為DB-5ms (30mx0.25mm 1.d., 0.25-μ m film thickness, Agilent J&ff Scientiffc, USA).氦氣流速 1.0ml.min—1。進(jìn)樣口溫度280°C。升溫程序?yàn)?0°C min,程序升溫20°C min—1到200°C，然后以5°C min—1到300°C。質(zhì)譜接口溫度280°C。
[0100]GC-QqQ-MS分析結(jié)果如圖4所示。
[0101]圖4A為各組酶促反應(yīng)的GC圖譜。
[0102]圖4A中，空載體對(duì)照(脫磷前)代表空載體對(duì)照未脫磷反應(yīng)；空載體對(duì)照(脫磷后)代表空載體對(duì)照脫磷反應(yīng)；Sm-CPS4-(脫磷前)代表實(shí)驗(yàn)組未脫磷反應(yīng)；Sm-CPS4-(脫磷后)代表實(shí)驗(yàn)組脫磷反應(yīng)。
[0103]圖4B為圖4A中實(shí)驗(yàn)組脫磷反應(yīng)產(chǎn)物中的峰I與標(biāo)準(zhǔn)品Iabdenediol加衍生化試劑后的EI質(zhì)譜圖。
[0104]圖4B表明，經(jīng)GC-QqQ-MS分析，SmCPS4與GGPP反應(yīng)后，在脫磷條件下產(chǎn)生一個(gè)已知化合物 labdenediol ((13E)-labda-8 α，15-diol)。Labdenediol 被認(rèn)為是以 GGPP 為底物產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物(13E) _8 α-hydroxylabden-15-yl diphosphate (LDPP)的脫憐產(chǎn)物(Schalk, M., Pastore, L., Mirata, M.A., Khim, S., Schouwey, M., Deguerry, F., Pineda, V., Rocci, L., and Daviet, L.(2012).Toward a biosynthetic route to sclareol and amberodorants.Journal of the American Chemical Society, 134 (46): 18900-18903.)。而實(shí)驗(yàn)組未脫磷反應(yīng)以及空載體對(duì)照反應(yīng)中均無此化合物，結(jié)果表明SmCPS4催化GGPP形成了LDPP。
[0105]SmCPS4催化GGPP形成LDPP這一功能與已鑒定的煙草中NtCPS2(Sallaud, C., Giacalone, C., Topfer, R., Goepfert, S., Bakaher, N., Rosti, S., andTissier,A.(2012).Characterization of two genes for the biosynthesisof the labdane di terpene Z-abienol in tobacco(Nicotiana tabacum)glandular trichomes.Plant J.72:1-17.),南歐丹參 salvia sclarea 中的 SsLPS(Schalk, Μ., Pastore, L., Mirata, M.A., Khim, S., Schouwey, M., Deguerry, F., Pineda, V., Rocci, L., and Daviet, L.(2012).Toward a biosynthetic route to sclareol and amberodorants.Journal of the American Chemical Society, 134(46): 18900-18903.)和菊科植物 Grindelia robusta 中發(fā)現(xiàn)的 GrTPSl (Zerbe, P., Hamberger, B., Yuen, M., Chiang, A., Sandhu, H., Madilao, L., Nguyen, A., Hamberger, B., Bach, S.S., and Bohlmann, J.(2013).Gene Discovery of Modular Diterpene Metabolism in Nonmodel Systems.PlantPhysiol.162:1073 - 1091.)功能相同。
[0106](三)SmCPS4和 SmKSL2 聯(lián)合產(chǎn)生 13-ep1-manoyl oxide (13_epi_ 淚柏醚)
[0107]實(shí)驗(yàn)組:在步驟(一)的實(shí)驗(yàn)組未脫磷反應(yīng)體系中加入300uL濃度200ng ?uL-1的步驟二制備的SmKSL2上清液后，將該體系30°C反應(yīng)3h后，用正己烷萃取3次，合并正己烷層并用氮?dú)獯蹈?，得到反?yīng)物(不需衍生化)。利用步驟(二)的GC-QqQ-MS條件分析反應(yīng)產(chǎn)物。
[0108]對(duì)照組:用步驟二制備的對(duì)照上清代替上述實(shí)驗(yàn)組中的SmKSL2上清液，進(jìn)行同樣反應(yīng)作為陰性對(duì)照。
[0109]圖5A為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的酶促反應(yīng)產(chǎn)物的GC圖譜，可見SmCPS4和SmKSL2聯(lián)合反應(yīng)生成兩個(gè)產(chǎn)物，其中峰2為主產(chǎn)物。
[0110]圖5C中從上到下第一個(gè)和第二個(gè)圖分別為酶促反應(yīng)產(chǎn)物中峰I和峰2的E1-MS圖譜，其中主要產(chǎn)物峰2與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的13-ep1-manoyl oxide質(zhì)譜圖一致，另一個(gè)微量產(chǎn)物是其異構(gòu)體manoyl oxide，兩者最主要質(zhì)譜圖區(qū)別是離子275和257的豐度比例不同(Demetzos, C., Kolocouris, A., and Anastasaki, T.(2002).A simple and rapid methodfor the differentiation of C_13manoyl oxide epimers in biologically importantsamples using GC - MS analysis supported with NMR spectroscopy and computationalchemistry results.Bioorg.Med.Chem.Lett.12:3605 - 3609.)，根據(jù)此特點(diǎn)可以得到準(zhǔn)確的鑒別。`
[0111]實(shí)施例4、植物材料中13-ep1-淚柏醚(13-ep1-manoyl oxide)的檢測(cè)
[0112]取花期丹參植株的根、莖、葉、花萼和花瓣進(jìn)行13-ep1-manoyl oxide化合的檢測(cè)。具體步驟如下:將新鮮材料凍干48h后，研磨成粉，取各組織的粉末lOOmg，加入2mL正己烷進(jìn)行提取，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)正~ 十四燒0.8ug/mL。超聲提取30min后，尚心，取各上清液用于GC-QqQ-MS檢測(cè)(檢測(cè)前不需衍生化)。GC-QqQ-MS檢測(cè)方法與實(shí)施例3中步驟四的(二)方法相同。
[0113]結(jié)果如圖5B和5C中從上到下第三個(gè)圖所示。
[0114]圖5B表明，經(jīng)GC-QqQ-MS檢測(cè)，在丹參植株花萼，花瓣，葉和莖中均檢出13-ep1-manoyl oxide,其花萼中的 13-ep1-manoyl oxide (花萼中峰 2)的 EI 質(zhì)譜圖(圖5C中從上到下第三個(gè)圖)與酶促反應(yīng)體系(實(shí)施例3步驟四的(三)實(shí)驗(yàn)組)中的峰2完全一致。其中花萼中13-ep1-manoyl oxide含量最高,相對(duì)含量0.17ug.g—1 ;葉和花瓣中均為
0.03ug.g'莖中為0.02ug.g—1，而根中沒有檢測(cè)到。該結(jié)果與實(shí)施例2的SmCPS4的基因表達(dá)結(jié)果相吻合。表明該成分在丹參地上部分特別是花萼中特異積累。同時(shí)在丹參已報(bào)道的80多種萜類化合物中，還沒有半日花烷型二萜的報(bào)道。因此，該化合物為通過基因功能挖掘而發(fā)現(xiàn)的丹參中含有的新化合物，通過體外酶促和植株體內(nèi)化合物的檢測(cè)，證實(shí)丹參植物體內(nèi)的確存在一條半日花烷型二萜的合成途徑。[0115]SmCPS4與二萜類共同底物物牛兒基物牛兒基焦磷酸(GGPP)反應(yīng)的產(chǎn)物為(13E) -8 a -hydroxy labden-15-y I diphosphate (LDPP ),隨后 SmKSL2 將其催化產(chǎn)生13-ep1-manoyl oxide, 13-ep1-manoyl oxide為半日花焼型二胳類化合物，反應(yīng)如圖6所示，圖6中，CPS4和KSL2分 別代表SmCPS4和SmKSL20
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.3所示的蛋白； (2)將SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N: 1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.一種蛋白組合物，由權(quán)利要求1所述的蛋白和SEQ ID N0.4所示的蛋白組成。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白在合成(13E)_8 α-hydroxylabden-15-yl diphosphate中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白在催化櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成(13E) -8 a -hydroxylabden-15-yI diphosphate 中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5所述的蛋白組合物`在合成13-ep1-manoyloxide中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求5所述的蛋白組合物在催化物牛兒基物牛兒基焦磷酸合成13-ep1-manoyloxide中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求5所述的蛋白組合物在丹參中合成13-ep1-manoyl oxide 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P17/06GK103849614SQ201410085600
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】漆小泉, 崔光紅, 靳保龍 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所