ERβ啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因的重組與藥物篩選應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及ERβ啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組、構(gòu)建雌激素受體β啟動(dòng)子細(xì)胞模型及篩選出有效減緩牙周組織疾病，維持牙槽骨高度的雌激素替代藥物的應(yīng)用,在此發(fā)明中，我們利用基因工程技術(shù)，從人基因組中擴(kuò)增出了1253bp的ERβ啟動(dòng)子序列，將其克隆到PGL2-luc載體上，構(gòu)建出ERβ啟動(dòng)子-Luc表達(dá)載體,ERβ表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)域的調(diào)控，構(gòu)建牙周膜細(xì)胞ERβ啟動(dòng)子模型是篩選出治療骨缺損的有效中藥成分的關(guān)鍵步驟,通過(guò)構(gòu)建此藥物篩選細(xì)胞模型，證明了一定濃度的西洋參成分可促進(jìn)ERβ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，且濃度越高活性越強(qiáng)，可指導(dǎo)臨床應(yīng)用該藥物進(jìn)行牙周疾病及牙槽骨吸收的治療。
【專利說(shuō)明】ER^啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因的重組與藥物篩選應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及雌激素受體β (ERi3)啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組、構(gòu)建雌激素受體β啟動(dòng)子細(xì)胞模型及篩選出能夠有效減緩牙周組織疾病的繼續(xù)發(fā)展，維持牙槽骨高度的雌激素替代藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的許多研究都已證實(shí)雌激素與骨組織代謝之間存在著密切的關(guān)系。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用雌激素來(lái)改善牙槽骨的吸收，維護(hù)牙周組織健康的相關(guān)研究越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注。
[0003]目前人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，雌激素在牙周疾病發(fā)生的病理過(guò)程及牙槽骨的吸收過(guò)程中都起著重要的調(diào)控作用。例如，孕期的女性由于體內(nèi)雌激素水平的改變，使其牙周疾病的嚴(yán)重程度大于其他時(shí)期；絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素缺乏可影響體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)換過(guò)程，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，進(jìn)一步引起全身骨質(zhì)疏松。在口腔中主要表現(xiàn)為牙槽骨吸收加快，進(jìn)而引起牙齒松動(dòng)。[0004]雌激素主要通過(guò)雌激素受體a (ERa，estrogen receptor a )和雌激素受體β(ER^ , estrogen receptor β )兩種受體介導(dǎo)來(lái)行使其功能,這兩種受體存在于哺乳動(dòng)物的很多細(xì)胞中，在對(duì)細(xì)胞功能的行使中也起著重要的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過(guò)ER直接作用于牙周組織并發(fā)揮其作用，并且許多已知的骨代謝相關(guān)因子都受到雌激素的調(diào)控。有研究表明，在牙周組織細(xì)胞中ERi3的表達(dá)強(qiáng)于ERa表達(dá)，其對(duì)骨代謝作用稍大于ERa。并且當(dāng)ERa基因結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)，ERβ基因表達(dá)模式不會(huì)發(fā)生明顯變化，說(shuō)明ERβ介導(dǎo)雌激素的作用部分，可能以一種不直接依賴于ER a的方式進(jìn)行的基因調(diào)控。因此本發(fā)明開(kāi)創(chuàng)性的采用構(gòu)建ERi3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行牙周疾病及骨代謝方面的研究。
[0005]牙周膜細(xì)胞是牙周膜內(nèi)的主要成分，對(duì)牙周膜的形成有決定性的作用。牙周膜細(xì)胞具備多向分化及增殖的潛能。牙周膜細(xì)胞的增殖、分化除了可維持牙周組織的對(duì)牙齒的營(yíng)養(yǎng)和支持功能外，還可進(jìn)一步影響牙槽骨的成骨活性。并且牙周膜細(xì)胞內(nèi)存在介導(dǎo)雌激素的ERi3受體，其在外源性雌激素的刺激下，可使牙周膜細(xì)胞的成骨作用增強(qiáng)。本發(fā)明將重組的ERi3啟動(dòng)子重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至牙周膜細(xì)胞中，為后期有效要藥物的篩選提供了基礎(chǔ)。
[0006]因?yàn)榇萍に亻L(zhǎng)期服用會(huì)引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的代謝紊亂，有一定的副作用。因此選擇植物雌激素來(lái)替代雌激素治療疾病越來(lái)越受到人們的關(guān)注。植物雌激素是一種來(lái)源于植物當(dāng)中，具有類黃酮結(jié)構(gòu)，并具類雌激素功能的物質(zhì)。在我國(guó)中醫(yī)藥理中，許多中藥中都含有植物雌激素成分。因此，篩選出能夠替代雌激素的有效中藥成分對(duì)指導(dǎo)臨床治療雌激素缺乏引起的牙周組織疾病及減緩牙槽骨的吸收有著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]由于雌激素缺乏后易引起的牙周組織疾病和牙槽骨吸收加快，進(jìn)而導(dǎo)致牙齒過(guò)早的松動(dòng)脫落。并且臨床上尚未發(fā)現(xiàn)解決此問(wèn)題的有效方法。本發(fā)明主要基于此治療難點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建ERi3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因，構(gòu)建牙周膜細(xì)胞ERi3啟動(dòng)子模型，篩選有效維持牙周營(yíng)養(yǎng)及促進(jìn)骨形成的中藥藥物成分。本發(fā)明對(duì)于開(kāi)發(fā)治療牙周疾病及減緩牙槽骨吸收的藥物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0008]ER^啟動(dòng)子重組質(zhì)粒構(gòu)建及藥物篩選的過(guò)程包括以下步驟:
[0009]第一步:目的片段的獲取
[0010]應(yīng)用primer premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)ERβ啟動(dòng)子的引物，以人類基因組為模板進(jìn)行PCR，得到從-1137至+116，全長(zhǎng)1253bp的ER0啟動(dòng)子序列。
[0011]這段啟動(dòng)子的堿基序列為:
[0012]
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[0013]第二步:克隆載體的構(gòu)建
[0014]將擴(kuò)增得到的目的片段與pGEM-T Easy載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取等步驟得到重組質(zhì)粒后，酶切鑒定。
[0015]第三步:表達(dá)載體pGL2_ER0 promoter的構(gòu)建
[0016]將克隆質(zhì)粒和pGL-2載體進(jìn)行雙酶切后連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)和提取，構(gòu)建pGL2-ER β promoter重組質(zhì)粒,酶切鑒定重組序列，并且通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定。
[0017]第四步:牙周膜細(xì)胞(PDLCS periodontal ligament cells)培養(yǎng)與鑒定
[0018]牙周膜組織在孵育72h后進(jìn)行首次換液，培養(yǎng)至第10d，細(xì)胞集落數(shù)量和面積明顯增加，集落與集落之間無(wú)明顯間隙，各個(gè)細(xì)胞集落擴(kuò)大直至鋪滿培養(yǎng)瓶底面，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列成旋窩狀。角蛋白染色陰性，波形蛋白染色陽(yáng)性表明原代細(xì)胞為來(lái)自中胚層的成纖維細(xì)胞，所獲取的細(xì)胞較純可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。[0019]第五步:藥物篩選的應(yīng)用
[0020]首先以2X IO5/孔的密度將TOLCS鋪于48孔板中，使細(xì)胞達(dá)到70%的匯合率，37°CC02培養(yǎng)箱過(guò)夜；將脂質(zhì)體101^和重組質(zhì)粒(每孔100叩)、？1--7-1?111(3內(nèi)參質(zhì)粒(每孔25叩)分別溶于50(^1^ optimem中，震蕩混勻，合并為一管，混勻，室溫靜置30min。20 μ L每孔加入48孔板中，37°C CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜；48孔板分為陰性、人參(濃度分別為0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml )、西洋參(濃度分別為 0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml )、共七組，每組3個(gè)平行孔，370C CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜；棄上清，每孔65 μ L PLB (熒光素酶報(bào)告基因裂解溶液)，搖床15min，室溫，分別轉(zhuǎn)入EP管中；13000rpm，IOmin,取20 μ L上清置于新EP管中，檢測(cè)熒光值并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0021]再次以2Χ IO5/孔的密度將TOLCS鋪于96孔板中，使細(xì)胞達(dá)到70%的匯合率，37°CC02培養(yǎng)箱過(guò)夜；將脂質(zhì)體101^和重組質(zhì)粒(每孔100叩)、？1--7-1?111(3內(nèi)參質(zhì)粒(每孔25叩)分別溶于50(^1^ optimem中，震蕩混勻，合并為一管，混勻，室溫靜置30min。IOyL每孔加入96孔板中，37°C CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜；96孔板分為陰性、濃度為0.03mg/ml的人參、濃度為0.03mg/ml的西洋參，共三組，每組15個(gè)平行孔，37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；分別于培養(yǎng)Id、2d、3d后棄上清，加入10μ L5%MTT (3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽)，37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)，加入150 μ L DMSO (二甲基亞砜)。在492波長(zhǎng)下讀取吸光度值并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
[0022]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的西洋參成分可顯著上調(diào)ERi3啟動(dòng)子的活性，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖，對(duì)促進(jìn) 牙周及骨組織再生有顯著作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0023]圖1為pGL2_ER0 promoter重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程示意圖；
[0024]圖2為ER β promoter PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0025]圖3為PCR擴(kuò)增出的ER β promoter啟動(dòng)子片段凝膠回收電泳圖；
[0026]圖4為pGEMT - ER^ promoter重組質(zhì)粒單酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0027]圖5為pGEMT - ER β promoter重組質(zhì)粒雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0028]圖6為pGL2_ERβ promoter重組質(zhì)粒単酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0029]圖7為pGL2_ERβ promoter重組質(zhì)粒雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0030]圖8為PGL2-ER β promoter啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果
[0031]圖9牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)圖
[0032]圖10抗角質(zhì)蛋白陰性圖
[0033]圖11抗波形蛋白陽(yáng)性圖
[0034]圖12為藥物篩選雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)圖表；
[0035]圖13為藥物篩選MTT檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)圖表
【具體實(shí)施方式】:
[0036]實(shí)施例一:ER β promoter-pGL2重組質(zhì)粒的構(gòu)建【圖1】
[0037]1.目的片段的獲取
[0038]通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找ERP啟動(dòng)子，應(yīng)用primer premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)ERP啟動(dòng)子全長(zhǎng)的引物。以人類基因組為模板，上游引物為5’GGTACCTATAGAAGCAAGCGAGGAC(含KpnI酶切位點(diǎn))，下游引物為5’ AAGCTTCAACAGATGCAGGTTAGGA (含 HindIII 酶切位點(diǎn))，進(jìn)行 PCR，成功擴(kuò)增出 ERP 啟動(dòng)子目的片段，長(zhǎng)度為1253bp，瓊脂凝膠電泳【圖2】可見(jiàn)顯示一條清晰的特異性擴(kuò)增條帶，長(zhǎng)度約為1253bp，與預(yù)期長(zhǎng)度相符合。應(yīng)用AxyPr印PCR清潔試劑盒回收ER β啟動(dòng)子的DNA片段【圖3】。
[0039]2.ER β promoter-pGEMT Easy 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0040]將ER β啟動(dòng)子片段與pGEMT Easy載體連接，連接體系為L(zhǎng)igase5ul，pGEMTVector0.5ul，純化的DNA5ul，混合均勻，16°C連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物全部加入IOOul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴30min，放入已加溫至42°C的水浴中，熱激90s(期間不要搖動(dòng)試管)，迅速放入冰浴中2min，加入600ulS0C培養(yǎng)基，放入37°C搖床振蕩lh，鋪到含氨芐(Amp)的抗性平板上，37°C平放待液體吸干后，倒置平皿繼續(xù)培養(yǎng)12-16h，待出現(xiàn)乳白色菌落后挑克隆，以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，以KpnI進(jìn)行單酶切【圖4】和KpnI&Hindlll分別雙酶切鑒定【圖5】。根據(jù)【圖4】可以看出，進(jìn)行單酶切后，pGEM-T-ERPpromoter為一條大小為4268bp的特異性條帶。而雙酶切回收后，pGEM-T-ER0 promoter則呈現(xiàn)大小為1253bp和3015bp的兩條特異性條帶，如【圖5】，符合我們的預(yù)期。
[0041]3.ER^ promoter-pGL2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042]首先將pGEM-T-ER β promoter與pGL_2分別進(jìn)行單酶切，酶切體系為50 μ L，其中10XBuffer5.0μ L, 10XBSA5.0 μ L，質(zhì)粒 2.0mg, KpnI2.0μ L, H2O 補(bǔ)足 50μ L 體系，37°C酶切過(guò)夜，瓊脂糖凝膠 電泳回收，再向單酶切體系中補(bǔ)充:5M NaCl0.5 μ L, HindIII2.0 μ L,Η20補(bǔ)足50 μ L體系，進(jìn)行雙酶切后凝膠回收鑒定，PGL2為一條大小為5563bp的特異性條帶，而pGEM-T-ERβ promoter則呈現(xiàn)大小為1253bp和3015bp的兩條特異性條帶，同樣符合我們的預(yù)期。取上述回收ERi3啟動(dòng)子片段與pGl-2載體連接，連接體系為L(zhǎng)igaselOul，pGL-2Vector2ul,ERβ promoter7ul,混合均勻，16°C連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5 α中，在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，應(yīng)用KpnI和KpnI&Hindlll對(duì)ERβ promoter-pGL2重組體進(jìn)行單酶切【圖6】和雙酶切鑒定【圖7】，根據(jù)酶切圖我們可以看出，ERβ promoter-pGL2重組體為一條大小6851bp的特異性條帶,對(duì)其進(jìn)行雙酶切后呈現(xiàn)出大小為5563bp和1253bp的兩條特異性條帶，其結(jié)果可證實(shí)ER β啟動(dòng)子片段已與PGL2載體連接成功。之后我們對(duì)ERi3 pr0m0ter-pGL2重組體進(jìn)行測(cè)序【圖8】,測(cè)序報(bào)告結(jié)果證實(shí)PGL2-ER β promoter啟動(dòng)子重組質(zhì)粒序列完全正確。
[0043]實(shí)施例二:細(xì)胞培養(yǎng)及藥物篩選
[0044]1.細(xì)胞系的培養(yǎng)及鑒定
[0045](I)細(xì)胞原代培養(yǎng)
[0046]標(biāo)本取自臨床因正畸治療而拔除的健康、無(wú)齲壞的雙尖牙。提供標(biāo)本的患者年齡為13~18歲，無(wú)性別差異。在患者簽署知情同意書(shū)后，先使用復(fù)方氯已定含漱3X3min，然后使用拔牙鉗將牙拔除，并立即放入盛有含5%氯霉素、鏈霉素的PBS溶液中，在30min以內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用含2%雙抗(霉素100U/ml，鏈霉素100μ g/ml)的PBS溶液反復(fù)沖洗，將牙根表面殘留的血塊沖洗干凈，直到牙根表面變白。然后使用11號(hào)手術(shù)刀片，將根中1/3的牙周膜輕輕刮除，并剪成I X Imm3大小，然后放置在35mm的培養(yǎng)皿中并均勻擺放。開(kāi)始加少量的20%完全培養(yǎng)基將牙周膜侵濕即可，并將其放入37°C恒溫孵箱中，2~4小時(shí)后再補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。前3天勿動(dòng)，以后每2天換液I次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代培養(yǎng)【圖9】。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，狀態(tài)良好，呈星形或梭形，具有牙周膜細(xì)胞的特性。
[0047](2)細(xì)胞爬片制作:
[0048]PDLCS消化后使用10%完全培養(yǎng)基重懸(3~5ml)，在24孔板里預(yù)先鋪Φ 14mm細(xì)胞培養(yǎng)專用蓋玻片，取細(xì)胞懸液分別滴加到圓形蓋玻片上，注意不要滴在圓片外并讓細(xì)胞貼附30min左右。然后在培養(yǎng)板中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，應(yīng)注意輕微加入，以免將貼附上的細(xì)胞沖下來(lái)。然后將培養(yǎng)板放置孵箱中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70~80%聚合度時(shí)取出蓋玻片。先用
0.01M PBS漂洗2min X3，然后在室溫下使用4%多聚甲醛處理20min，PBS漂洗2minX3，然后0.5%tritonx-100室溫處理20min用于細(xì)胞打孔，最后PBS再漂洗2minX3。
[0049](3)免疫組化染色
[0050]由于牙周膜細(xì)胞來(lái)源于外胚層的間充質(zhì)，因此本實(shí)驗(yàn)用兩種抗體進(jìn)行免疫組化染色，來(lái)驗(yàn)證牙周膜細(xì)胞純度。波形絲蛋白和角蛋白染色均根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。波形蛋白是鑒定細(xì)胞來(lái)源于間充質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志蛋白，而角蛋白則是鑒定上皮來(lái)源細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白。本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色結(jié)果為抗波形蛋白染色陽(yáng)性【圖10】，而抗角蛋白染色陰性【圖11】。證實(shí)細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞而非上皮來(lái)源，細(xì)胞較純，無(wú)其他細(xì)胞混入。
[0051]2.藥物篩選 的應(yīng)用
[0052]首先以2X IO5/孔的密度將TOLCS鋪于48孔板中，使細(xì)胞達(dá)到70%的匯合率，37°CC02培養(yǎng)箱過(guò)夜；將脂質(zhì)體101^和重組質(zhì)粒(每孔100叩)、？1--7-1?111(3內(nèi)參質(zhì)粒(每孔25叩)分別溶于50(^1^ optimem中，震蕩混勻，合并為一管，混勻，室溫靜置30min。20 μ L每孔加入48孔板中，37°C CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜；48孔板分為陰性、人參(濃度分別為0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml )、西洋參(濃度分別為 0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml )、共七組，每組3個(gè)平行孔，370C CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜；棄上清，每孔65 μ L PLB (熒光素酶報(bào)告基因裂解溶液)，搖床15min，室溫，分別轉(zhuǎn)入EP管中；利用Turner Designs TD20/20光度計(jì)中的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)模式測(cè)定熒光素酶活性，所得的結(jié)果為各個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性與Renilla熒光素酶活性的比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，制作圖表【圖12】。雙突光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示濃度為0.003mg/ml, 0.03mg/ml, 0.3mg/ml的人參，西洋參對(duì)ER β啟動(dòng)子均有顯著的激活作用，隨著濃度增高，激活作用增強(qiáng)，并具有劑量依賴性。其中西洋參的作用效果較人參更為顯著。
[0053]再次以2Χ IO5/孔的密度將TOLCS鋪于96孔板中，使細(xì)胞達(dá)到70%的匯合率，37°CC02培養(yǎng)箱過(guò)夜；將脂質(zhì)體101^和重組質(zhì)粒(每孔100叩)、？1--7-1?111(3內(nèi)參質(zhì)粒(每孔25叩)分別溶于50(^1^ optimem中，震蕩混勻，合并為一管，混勻，室溫靜置30min。IOyL每孔加入96孔板中，37°C CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜；96孔板分為陰性、濃度為0.03mg/ml的人參、濃度為0.03mg/ml的西洋參，共三組，每組15個(gè)平行孔，37 °C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)ld、2d、3d后棄上清，加入10 μ L5%MTT(3- (4，5- 二甲基噻唑_2) -2，5- 二苯基四氮唑溴鹽)，37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時(shí)，加入150 μ L DMSO (二甲基亞砜)。在492波長(zhǎng)下讀取吸光度值并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，制作圖表【圖13】MTT檢測(cè)結(jié)果顯示濃度為0.03mg/ml的人參，西洋參可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖數(shù)量增多。其中西洋參的作用效果較人參更為顯著。
[0054]本發(fā) 明中利用ERi3啟動(dòng)子重組質(zhì)粒篩選中藥藥物，證明了西洋參可以顯著上調(diào)ER^啟動(dòng)子活性并促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖及分化。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可運(yùn)用本發(fā)明的ERi3啟動(dòng)子重組質(zhì)粒篩選其他中藥，用以治療雌激素缺乏引起的牙周炎癥并改建吸收的牙槽骨，為臨床治療上述疾病藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[0055]
【權(quán)利要求】
1.ERi3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因的重組，將該基因啟動(dòng)子-1137至+116序列克隆到空載體pGL2-Basic的多克隆位點(diǎn)中，其下游為熒光素酶Luc的表達(dá)序列，構(gòu)建出ERP啟動(dòng)子-Luc表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利I所述報(bào)告基因基因重組轉(zhuǎn)染至于人類牙周膜細(xì)胞中，構(gòu)建藥物篩選模型。
3.根據(jù)權(quán)利2發(fā)現(xiàn)一定濃度的西洋參成分可使ERβ啟動(dòng)子活性升高并可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖，且濃度越高活 性越強(qiáng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103937834SQ201410098446
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】李江, 李曉菊, 楊柳, 趙超悅, 賀璽, 魏溦 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)