一種利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物柴油的酶法制備方法，具體的說是一種利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法。以脂肪酶基因、重組載體和表達(dá)宿主通過基因工程方式獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株作為出發(fā)材料，利用出發(fā)材料酵母菌株重組表達(dá)的脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)物作為原位催化劑，同時(shí)在發(fā)酵物中添加外源油脂與短鏈醇，以外源添加物作為反應(yīng)底物，將脂肪酶的表達(dá)生產(chǎn)與生物柴油催化整合于酵母高密度發(fā)酵過程中，將反應(yīng)底物在原位催化劑存在的條件下進(jìn)行原位催化制備生物柴油。本發(fā)明的整合生物加工過程通過高密度發(fā)酵和催化同步操作，將傳統(tǒng)的脂肪酶表達(dá)生產(chǎn)與生物柴油催化兩個(gè)獨(dú)立的過程整合于一個(gè)過程，過程簡(jiǎn)易，能耗低，無污染。
【專利說明】一種利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物柴油的酶法制備方法，具體的說是一種利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴 油的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物柴油是由生物來源的油脂與短鏈醇甲醇或乙醇，在催化劑的作用下發(fā)生水解、酯化及轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成的長(zhǎng)鏈脂肪酸甲酯或者乙酯，是一類環(huán)保、可再生的，可替代石化柴油的清潔能源。制備生物柴油的催化劑可分為酸堿催化劑和脂肪酶催化劑。酸堿催化存在醇用量大、能耗高、污染環(huán)境、腐蝕生產(chǎn)設(shè)備、副產(chǎn)物甘油不易分離等缺陷。對(duì)于酸價(jià)較高的廢棄油脂(如地溝油)，必須先用酸催化劑進(jìn)行降酸處理，否則直接堿催化會(huì)形成皂化反應(yīng)，妨礙反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行。脂肪酶催化可克服上述酸堿催化的缺陷，備受學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的重視。目前脂肪酶催化生物柴油應(yīng)用得較廣泛的是固定化脂肪酶和全細(xì)胞形式的脂肪酶催化系統(tǒng)。固定化脂肪酶和全細(xì)胞脂肪酶的制備過程與生物柴油的催化過程是兩個(gè)時(shí)空分離的獨(dú)立過程。因?yàn)橹久复呋瘎┑闹苽渖婕鞍l(fā)酵液的分離、純化、固定化或者全細(xì)胞的通透性處理，這些生物催化劑的制備過程耗時(shí)費(fèi)力，尤其是脂肪酶發(fā)酵過程的能耗與生物柴油催化過程的能耗無法偶聯(lián)整合使用，使得生物柴油的酶法制備過程的成本居高不下。
[0003]目前，關(guān)于脂肪酶法制備生物柴油的專利都集中于傳統(tǒng)的固定化酶和全細(xì)胞催化體系，如中國(guó)專利(200710059727)公開了一種固定化脂肪酶催化麻瘋樹油與乙酸甲酯生成生物柴油的方法；中國(guó)專利(CN1687313)公開了一種不同甘油酯位置特異性的組合固定化脂肪酶生產(chǎn)生物柴油的工藝；中國(guó)專利(CN1944629)公開了酵母菌體與固定化材料硅藻土、海藻酸鈉、二氯化鈣的固定化全細(xì)胞制備方法；中國(guó)專利(200610089767.1)公開了游離型和戍二醒聚氨酯交聯(lián)的固定化絲狀真菌米根霉Rhizopus oryzae IF04697細(xì)胞催化脂肪酸及含酸油脂生產(chǎn)生物柴油的方法。經(jīng)檢索，脂肪酶生產(chǎn)與生物柴油催化偶聯(lián)整合的方法尚未見任何報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有獨(dú)立的脂肪酶催化劑制備與生物柴油催化過程技術(shù)的不足，提供一種利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，以脂肪酶基因、重組載體和表達(dá)宿主通過基因工程方式獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株作為出發(fā)材料，利用出發(fā)材料酵母菌株重組表達(dá)的脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)物作為原位催化劑，同時(shí)在發(fā)酵物中添加外源油脂與短鏈醇，以外源添加物作為反應(yīng)底物，將脂肪酶的表達(dá)生產(chǎn)與生物柴油催化整合于酵母高密度發(fā)酵過程中，將反應(yīng)底物在原位催化劑存在的條件下進(jìn)行原位催化制備生物柴油。
[0007]所述出發(fā)材料的具體構(gòu)建是，將脂肪酶基因和重組載體通過構(gòu)建獲得含有目的脂肪酶基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至酵母感受態(tài)細(xì)胞，篩選含有高拷貝目的基因的轉(zhuǎn)化子，獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株。
[0008]所述重組質(zhì)粒為誘導(dǎo)型載體或組成型載體與目標(biāo)脂肪酶基因通過限制性內(nèi)切酶酶切，而后酶連構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒；所述的組成型表達(dá)載體為pGAPZ aA、pGAPZ α B或 pGAPZ α C，所述的誘導(dǎo)型載體為 pPIC9K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C 或 pPIC9 ；所述目標(biāo)脂肪酶為疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces Ianuginosus)脂肪酶Tll、皺裙假絲酵母(Candida rugosa)脂肪酶、南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)脂肪酶、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nudulans)脂肪酶、米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolylica)脂肪酶、米赫毛霉(Mucor miehe)脂肪酶、黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶、白地霉(Geotrichumcandidum)脂肪酶或華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶；
[0009]所述酵母感受態(tài)細(xì)胞為畢赤酵母。所述畢赤酵母為Pichia pastoris X33或Pichia pastoris GS115 或Pichia pastoris KM71 或Pichia pastoris SMD1168。
[0010]所述的含高拷貝基因的轉(zhuǎn)化子為在濃度為500-2000 μ g/ml博萊霉素(Zeocin)或2-4mg/ml遺傳霉素(G418)的YPD抗性平板上能正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。
[0011]所述原位催化劑的獲得為:將出發(fā)材料進(jìn)行高效表達(dá)獲得誘導(dǎo)型表達(dá)或組成型表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵物含有胞內(nèi)脂肪酶的重組酵母細(xì)胞及胞外脂肪酶的高密度發(fā)酵培養(yǎng)物，作為原位生物催化劑。
[0012]所述誘導(dǎo)型表達(dá)為兩階段發(fā)酵(對(duì)于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子A0X1)具體是指，誘導(dǎo)前的菌體積累階段與甲醇的誘導(dǎo)表達(dá)階段，誘導(dǎo)前的菌體積累階段為出發(fā)材料在以甘油為碳源的BMGY或無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長(zhǎng)，直至菌體密度達(dá)到0D_=2-6，然后進(jìn)入脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段；脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段是指以甲醇為唯一碳源的BMMY或無機(jī)鹽培養(yǎng)基，每隔12-24h添加0.5-4% (v/v)甲醇至培養(yǎng)液中，保持脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá)和菌體的進(jìn)一步生長(zhǎng)；
[0013]所述組成型表達(dá)為一步發(fā)酵(對(duì)于組成型啟動(dòng)子GAP)具體是，指從出發(fā)材料接種到發(fā)酵結(jié)束僅在YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行。
[0014]所述的高密度生產(chǎn)是指強(qiáng)組成型表達(dá)產(chǎn)生的大量菌體及脂肪酶，或者由誘導(dǎo)前菌體積累階段過渡到脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段的過程中，需將菌體積累階段獲得的菌體于室溫?zé)o菌離心收獲，然后將這些菌體無菌轉(zhuǎn)接到脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)的新鮮BMMY或無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并開始每隔12_24h添加甲醇開始誘導(dǎo)脂肪酶并進(jìn)一步大量積累菌體。
[0015]所述的高效表達(dá)是指強(qiáng)組成型表達(dá)或受甲醇誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子在持續(xù)的甲醇誘導(dǎo)條件下驅(qū)動(dòng)脂肪酶大量表達(dá)；所述的胞內(nèi)脂肪酶為由于高效表達(dá)而未充分分泌至胞外并保留在酵母細(xì)胞內(nèi)的這部分脂肪酶，胞外脂肪酶為分泌到胞外培養(yǎng)液中的這部分脂肪酶。
[0016]所述誘導(dǎo)型表達(dá)的培養(yǎng)條件為:搖瓶裝液量5-10% (體積百分比)，搖床轉(zhuǎn)速250-300rpm，培養(yǎng)溫度為28_30°C，誘導(dǎo)前的菌體積累階段培養(yǎng)時(shí)間為8_12h，誘導(dǎo)表達(dá)階段培養(yǎng)時(shí)間為24-168h ；
[0017]所述的組成型表達(dá)的培養(yǎng)條件為:搖瓶裝液量5-10% (體積百分比)，搖床轉(zhuǎn)速250-300rpm，培養(yǎng)溫度為28_30°C，培養(yǎng)時(shí)間為24_168h ；
[0018]所述原位催化具體是，向上述誘導(dǎo)型表達(dá)或組成型表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)物中原位添加外源的油脂和短鏈醇，同時(shí)以發(fā)酵培養(yǎng)物中的胞內(nèi)脂肪酶和胞外脂肪酶作為原位催化劑，原位催化制備生物柴油。
[0019]所述誘導(dǎo)型表達(dá)或組成型表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)物為出發(fā)材料經(jīng)誘導(dǎo)或組成型表達(dá)12-96h后的培養(yǎng)物；
[0020]所述油脂和短鏈醇的摩爾比為1:3-1:9。
[0021]所述的油酯為動(dòng)物、植物或微生物來源的各種油脂；如大豆油、花生油、菜籽油、玉米油、棉籽油、蓖麻油、麻瘋樹油、小桐子油、芝麻油、微藻油、豬油、牛油、魚油、產(chǎn)油酵母油，也包含高酸價(jià)的廢棄油脂，如工業(yè)地溝油、餐廚地溝油等；所述的胞內(nèi)脂肪酶為發(fā)酵培養(yǎng)物中酵母全細(xì)胞形式的脂肪酶；所述的胞外脂肪酶為發(fā)酵液中的液體酶液；所述發(fā)酵過程與生物柴油催化過程的偶聯(lián)與整合是指不進(jìn)行任何發(fā)酵液的處理和其他條件的改變，直接應(yīng)用于生物柴油催化；所述的油酯與短鏈醇的反應(yīng)為水解、酯化、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。
[0022]所述的短鏈醇為甲醇或乙醇。
[0023]所述原位催化反應(yīng)溫度為28_30°C，時(shí)間為12_240h ;水含量為50_200%(占油脂的質(zhì)量百分比)，進(jìn)行原位反應(yīng)的轉(zhuǎn)速為250-300rpm。待原位反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液于8000 X g離心10min，上層即為生物柴油成分脂肪酸酯，生物柴油得率為50-95%。
[0024]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有的技術(shù)具有優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
[0025]1.本發(fā)明將脂肪酶生產(chǎn)與生物柴油催化這兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的過程巧妙地偶聯(lián)整合，避免了脂肪酶催化劑的獨(dú)立制備過程，充分利用發(fā)酵培養(yǎng)物中存在的胞外脂肪酶液和以胞內(nèi)酶形式存在的全細(xì)胞催化劑，直接原位催化制備生物柴油，最大程度地節(jié)省了脂肪酶發(fā)酵過程的能耗，具有降低生物 柴油生產(chǎn)成本的明顯優(yōu)勢(shì)。
[0026]2.本發(fā)明的生產(chǎn)方法同時(shí)利用胞外酶和胞內(nèi)酶，進(jìn)一步降低催化劑的使用成本。
[0027]3.本發(fā)明的生產(chǎn)方法相對(duì)于傳統(tǒng)的固定化酶和全細(xì)胞催化系統(tǒng)，具有良好的水和短鏈醇耐受性，對(duì)原料油脂的要求低，且催化過程控制成本降低，因此整個(gè)生物柴油生產(chǎn)過程成本低廉，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。
[0028]4.本發(fā)明的整合生物加工過程通過高密度發(fā)酵和催化同步操作，將傳統(tǒng)的脂肪酶表達(dá)生產(chǎn)與生物柴油催化兩個(gè)獨(dú)立的過程整合于一個(gè)過程，過程簡(jiǎn)易，能耗低，無污染，是一種成本低廉的生物柴油綠色制備系統(tǒng)。相對(duì)于傳統(tǒng)的固定化酶和全細(xì)胞催化生物柴油系統(tǒng)，該整合系統(tǒng)具有良好的水和短鏈醇耐受性，具有更好的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的工藝流程圖，其中A為固定化酶和全細(xì)胞催化劑制備與生物柴油催化分開的傳統(tǒng)過程，B:本發(fā)明提出的脂肪酶生產(chǎn)與生物柴油催化偶聯(lián)整合過程。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0031]下述實(shí)施例中實(shí)施例1和2區(qū)別在于添加油脂和甲醇的時(shí)間不一樣，導(dǎo)致發(fā)生不同的原位催化反應(yīng)。實(shí)施例1在誘導(dǎo)表達(dá)后的第36h添加油脂；在誘導(dǎo)表達(dá)后的第36h，48h，60h，72h分別添加3.5% (v/v)甲醇至搖瓶培養(yǎng)物中，發(fā)生酯化與轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。實(shí)施例2在誘導(dǎo)表達(dá)后的第36h添加油脂；在誘導(dǎo)表達(dá)后的第48h，60h，72h，84h分別添加3.5%(v/v)甲醇至搖瓶培養(yǎng)物中，發(fā)生水解與酯化反應(yīng)。實(shí)施例3、實(shí)施例4與實(shí)施例2的區(qū)別在于使用不同的目的脂肪酶基因與表達(dá)載體。實(shí)施例2使用疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因與誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒PPICZ α Α,實(shí)施例3使用皺褶假絲酵母脂肪酶基因與誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K，實(shí)施例4使用南極假絲酵母脂肪酶基因與組成型表達(dá)質(zhì)粒pGAPZ α A。
[0032]實(shí)施例1
[0033]本實(shí)施例的脂肪酶生產(chǎn)與生物柴油催化偶聯(lián)整合的方法是:
[0034](I)基因工程菌的構(gòu)建:通過限制性內(nèi)切酶Eco RI和NotI酶切pPICZ a A質(zhì)粒與疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶Tll基因，然后用T4連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，將所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞Pichia pastoris X33,通過高濃度抗性篩選,得到能在含有2000 μ g/ml博萊霉素(Zeocin)的YPD抗性平板上正常生長(zhǎng)的高拷貝基因轉(zhuǎn)化子，獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株。YPD培養(yǎng)基成份:2%胰蛋白胨，1%酵母膏，1%葡萄糖(下同)。
[0035](2)脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá):將上述高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株單菌落接種至裝有25ml BMGY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，于搖床轉(zhuǎn)速250rpm，28°C培養(yǎng)，待菌體密度達(dá)到0D_=4時(shí)，在室溫4000 X g無菌離心5min，收獲菌體，然后將這些菌體無菌重懸到裝有25ml新鮮BMMY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，并每隔12h添加向搖瓶中中的培養(yǎng)中添加0.5%(v/v)甲醇(甲醇占培養(yǎng)液的體積百分比，下同)，進(jìn)入脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段，同時(shí)進(jìn)一步積累菌體。BMGY培養(yǎng)基成份:2%蛋白胨，1%酵母浸膏，IOOmM磷酸鹽緩沖液，pH6.0, 1.34%酵母氮堿(YNB)，0.4ppm生物素，1%(v/v)甘油。BMMY培養(yǎng)基成份:2%蛋白胨，1%酵母浸膏，IOOmM磷酸鹽緩沖液， pH6.0, 1.34%酵母氮堿(YNB) , 0.4ppm生物素，1%(v/v)甲醇(下同)。
[0036](3)生物柴油的原位催化:上述培養(yǎng)物誘導(dǎo)表達(dá)36h后，開始添加IOg地溝油，并每隔12h分四次，(即誘導(dǎo)表達(dá)后的第36h，48h，60h，72h)分別添加3.5% (v/v)甲醇至搖瓶培養(yǎng)物中(油脂與甲醇的摩爾比為1:6)，在250rpm，28°C的條件下發(fā)生酯化(B卩脂肪酸與甲醇的酯化反應(yīng))與轉(zhuǎn)酯化(即甘油酯與甲醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng))原位反應(yīng)至96h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液于8000 Xg離心10min，上層即為生物柴油成分脂肪酸酯，生物柴油得率為66%。
[0037]所述的原位反應(yīng)是指在原來誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行就地催化，除了添加外源的油脂和短鏈醇之外，不改變其他條件，其催化的時(shí)限以誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間算起。
[0038]實(shí)施例2
[0039]本實(shí)施例的脂肪酶生產(chǎn)與生物柴油催化偶聯(lián)整合的方法是(基因工程菌的構(gòu)建和脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá)步驟同實(shí)施例1):
[0040](I)基因工程菌的構(gòu)建:通過限制性內(nèi)切酶Eco RI和NotI酶切pPICZ a A質(zhì)粒與疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶TH基因，然后用T4連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至酵母感受態(tài)細(xì)胞Pichia pastoris X33，通過高濃度抗性篩選，得到能在含有2000 μ g/ml博萊霉素(Zeocin)的YPD抗性平板上正常生長(zhǎng)的高拷貝基因轉(zhuǎn)化子，獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株。
[0041](2)脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá):將上述高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株單菌落接種至裝有25ml BMGY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，于搖床轉(zhuǎn)速250rpm，28°C培養(yǎng)，待菌體密度達(dá)到0D_=4時(shí)，室溫4000 Xg無菌離心5min，收獲菌體，然后將這些菌體無菌重懸到裝有25ml新鮮BMMY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，并每隔12h添加0.5% (v/v)甲醇至培養(yǎng)液中，進(jìn)入脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段，同時(shí)進(jìn)一步積累菌體。
[0042](3)生物柴油的原位催化:上述培養(yǎng)物誘導(dǎo)表達(dá)36h后，添加IOg地溝油，讓其發(fā)生原位水解反應(yīng)12h (脂肪酶水解油脂)，之后開始每隔12h分四次，即誘導(dǎo)表達(dá)后的第48h，60h，72h，84h分別添加3.5% (v/v)甲醇至搖瓶培養(yǎng)物中(油脂與甲醇的摩爾比為I:6)，250rpm，28°C的條件下發(fā)生原位酯化反應(yīng)至96h (脂肪酸與甲醇的酯化反應(yīng))。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液于SOOOXg離心10min，上層即為生物柴油成分脂肪酸酯，生物柴油得率為87%。
[0043]實(shí)施例3
[0044]本實(shí)施例的脂肪酶生產(chǎn)與生物柴油催化偶聯(lián)整合的方法是:
[0045](I)基因工程菌的構(gòu)建:通過限制性內(nèi)切酶Eco RI和NotI酶切pPIC9K質(zhì)粒與皺褶假絲酵母脂肪酶基因，然后用T4連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至酵母感受態(tài)細(xì)胞Pichia pastoris GS115,通過高濃度抗性篩選,得到能在含有4mg/ml遺傳霉素(G418)的YPD抗性平板上正常生長(zhǎng)的高拷貝基因轉(zhuǎn)化子，獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株。
[0046](2)脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá):將上述高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株單菌落接種至裝有25ml BMGY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，于搖床轉(zhuǎn)速250rpm，28°C培養(yǎng)，待菌體密度達(dá)到0D_=4時(shí)，室溫4000 Xg無菌離心5min，收獲菌體，然后將這些菌體無菌重懸到裝有25ml新鮮BMMY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，并每隔12h添加0.5% (v/v)甲醇至培養(yǎng)液中，進(jìn)入脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段，同時(shí)進(jìn)一步積累菌體。
[0047](3)生物柴油的原位催化:上述培養(yǎng)物誘導(dǎo)表達(dá)36h后，添加IOg地溝油，讓其發(fā)生原位水解反應(yīng)12h (脂肪酶水解油脂)，之后開始每隔12h分四次，即誘導(dǎo)表達(dá)后的第48h，60h，72h，84h分別添加3.5% (v/v)甲醇至搖瓶培養(yǎng)物中(油脂與甲醇的摩爾比為I:6)，250rpm，28°C的條件下發(fā)生原位酯化反應(yīng)至96h (脂肪酸與甲醇的酯化反應(yīng))。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液于SOOOXg離心10min，上層即為生物柴油成分脂肪酸酯，生物柴油得率為81%。
[0048]實(shí)施例4
[0049]本實(shí)施例的脂肪酶生產(chǎn)與生物柴油催化偶聯(lián)整合的方法是:
[0050](I)基因工程菌的構(gòu)建:通過限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI酶切pGAPZ a A質(zhì)粒與南極假絲酵母脂肪酶基因，然后用T4連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至酵母感受態(tài)細(xì)胞Pichia pastoris KM71，通過高濃度抗性篩選，得到能在含有2000 μ g/ml博萊霉素(Zeocin)的YPD抗性平板上正常生長(zhǎng)的高拷貝基因轉(zhuǎn)化子，獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株。
[0051](2)脂肪酶的組成型表達(dá):將上述高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株單菌落接種至裝有25ml YPD培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，于搖床轉(zhuǎn)速250rpm，28°C培養(yǎng)，無需添加任何誘導(dǎo)劑，即開始表達(dá)脂肪酶，并積累菌體。
[0052](3)生物柴油的原位催化:上述培養(yǎng)物組成型表達(dá)36h后，添加IOg地溝油，讓其發(fā)生原位水解反應(yīng)12h (脂肪酶水解油脂)，之后開始每隔12h分四次，即組成型表達(dá)后的第48h，60h，72h，84h分別添加3.5% (v/v)甲醇至搖瓶培養(yǎng)物中(油脂與甲醇的摩爾比為I:6)，250rpm，28°C的條件下發(fā)生原位酯化反應(yīng)至96h (脂肪酸與甲醇的酯化反應(yīng))。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液于SOOOXg離 心10min，上層即為生物柴油成分脂肪酸酯，生物柴油得率為90%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于:以脂肪酶基因、重組載體和表達(dá)宿主通過基因工程方式獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株作為出發(fā)材料，利用出發(fā)材料酵母菌株重組表達(dá)的脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)物作為原位催化劑，同時(shí)在發(fā)酵物中添加外源油脂與短鏈醇，以外源添加物作為反應(yīng)底物，將脂肪酶的表達(dá)生產(chǎn)與生物柴油催化整合于酵母高密度發(fā)酵過程中，將反應(yīng)底物在原位催化劑存在的條件下進(jìn)行原位催化制備生物柴油。
2.按權(quán)利要求1所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于:所述出發(fā)材料的具體構(gòu)建是，將脂肪酶基因和重組載體通過構(gòu)建獲得含有目的脂肪酶基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至酵母感受態(tài)細(xì)胞，篩選含有高拷貝目的基因的轉(zhuǎn)化子，獲得高效表達(dá)脂肪酶的重組酵母基因工程菌株。
3.按權(quán)利要求2所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于: 所述重組質(zhì)粒為誘導(dǎo)型載體或組成型載體與目標(biāo)脂肪酶基因通過限制性酶切與酶連而構(gòu)建的重組質(zhì)粒；所述的組成型表達(dá)載體為PGAPZ a A、pGAPZ α B或pGAPZ α C，所述的誘導(dǎo)型載體為PPIC9K、pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C或pPIC9 ;所述目標(biāo)脂肪酶為疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces Ianuginosus)脂肪酶T11、皺裙假絲酵母(Candida rugosa)脂肪酶、南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)脂肪酶、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nudulans)脂肪酶、米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolylica)脂肪酶、米赫毛霉(Mucor miehe)脂肪酶、黑曲霉(Aspergillusniger)脂肪酶、白地霉(Geotrichum candidum)脂肪酶或華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶； 所述酵母感受態(tài)細(xì)胞為畢赤酵母。
4.按權(quán)利要求1所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于: 所述原位催化劑的獲得為:將出發(fā)材料進(jìn)行高效表達(dá)獲得誘導(dǎo)型表達(dá)或組成型表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)物，發(fā)酵物含有胞內(nèi)脂肪酶的重組酵母細(xì)胞及胞外脂肪酶的高密度發(fā)酵培養(yǎng)物，作為原位生物催化劑。
5.按權(quán)利要求4所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于: 所述誘導(dǎo)型表達(dá)為兩階段發(fā)酵具體是指，誘導(dǎo)前的菌體積累階段與甲醇的誘導(dǎo)表達(dá)階段，誘導(dǎo)前的菌體積累階段為出發(fā)材料在以甘油為碳源的BMGY或無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長(zhǎng)，直至菌體密度達(dá)到0D_=2-6，然后進(jìn)入脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段；脂肪酶誘導(dǎo)表達(dá)階段是指以甲醇為唯一碳源的BMMY或無機(jī)鹽培養(yǎng)基，每隔12-24h添加0.5-4% (v/v)甲醇至培養(yǎng)液中，保持脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá)和菌體的進(jìn)一步生長(zhǎng)； 所述組成型表達(dá)為一步發(fā)酵具體是指從出發(fā)材料接種到發(fā)酵結(jié)束僅在YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行。
6.按權(quán)利要求5所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于: 所述誘導(dǎo)型表達(dá)的培養(yǎng)條件為:搖床轉(zhuǎn)速250-300rpm，培養(yǎng)溫度為28_30°C，誘導(dǎo)前的菌體積累階段培養(yǎng)時(shí)間為8-12h，誘導(dǎo)表達(dá)階段培養(yǎng)時(shí)間為24-168h ； 所述的組成型表達(dá)的培養(yǎng)條件為:搖床轉(zhuǎn)速250-300rpm，培養(yǎng)溫度為28_30°C，培養(yǎng)時(shí)間為 24-168h。
7.按權(quán)利要求1所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于:所述原位催化具體是，向上述誘導(dǎo)型表達(dá)或組成型表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)物中原位添加外源的油脂和短鏈醇，同時(shí)以發(fā)酵培養(yǎng)物中的胞內(nèi)脂肪酶和胞外脂肪酶作為原位催化劑，原位催化制備生物柴油。
8.按權(quán)利要求7所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于: 所述誘導(dǎo)型表達(dá)或組成型表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)物為出發(fā)材料經(jīng)誘導(dǎo)或組成型表達(dá)12_96h后的培養(yǎng)物； 所述油脂和短鏈醇的摩爾比為1:3-1:9。
9.按權(quán)利要求8所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于: 所述的油酯為動(dòng)物、植物或微生物來源的各種油脂，所述的短鏈醇為甲醇或乙醇。
10.按權(quán)利要求 7所述的利用偶聯(lián)生產(chǎn)脂肪酶的方式催化生產(chǎn)生物柴油的方法，其特征在于:所述原位催化反應(yīng)溫度為28-30°C，時(shí)間為12-240h ;水含量為50-200% (占油脂的質(zhì)量百分比)，進(jìn)行原位反應(yīng)的轉(zhuǎn)速為250-300rpm。
【文檔編號(hào)】C12N9/20GK103923954SQ201410138507
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】閻金勇, 李盛英 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所