用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物及其用途和分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物及其用途和分析方法，分析方法包括如下步驟：(1)基因組DNA提?。?2)TP-M13-SSR分子標(biāo)記檢測；(3)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。該組引物是從樣本中提取DNA，篩選微衛(wèi)星位點，從而設(shè)計引物。該組引物PCR擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、多態(tài)性好，可用于多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。
【專利說明】用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物及其用途和分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及昆蟲進(jìn)化領(lǐng)域，具體涉及一種用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物及其用途和分析方法，可用于蠅蛹金小蜂群體遺傳多樣性分析。
【背景技術(shù)】
[0002]寄生蜂是害蟲的重要天敵組成，在控制害蟲種群密度中起著重要的調(diào)控作用。在生產(chǎn)實踐中，應(yīng)用并適當(dāng)維護(hù)寄生蜂的密度，可長期將害蟲種群密度控制在一定閾值以內(nèi)。充分發(fā)揮生物防治不污染環(huán)境，不殺傷天敵，且具有持續(xù)控災(zāi)效果的優(yōu)勢，可以達(dá)到保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)生物多樣性，持續(xù)控制蟲害的目標(biāo)。蠅蛹金小蜂Pachycrepoideusvindemmiae (Rondani)是家蜆、實蜆和果蜆等蜆類蛹期常見寄生蜂種類，屬于小蜂總科Chalcidoidea,金小蜂科Pteromalidae,金小蜂亞科Pteromalinae,在對蜆類害蟲的生物防治上起著非常重要的作用，具有很大的利用潛力。家蠅是重要的衛(wèi)生害蟲，在我國廣泛分布，嚴(yán)重威脅食品和衛(wèi)生安全；果蠅和實蠅是櫻桃、楊梅、柑橘、苦瓜等果蔬上的重要害蟲，嚴(yán)重影響到果蔬的安全生產(chǎn)和銷售。
[0003]微衛(wèi)星DNA又稱簡單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats, SSR)和短串連重復(fù)(Short Tandem Repeats, STRs), 一般以2_6個堿基為核心序列，首尾相連組成的串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星DNA序列被分為3種類型:單一型(pure)、復(fù)合型(compound)和間斷型(interrupted)。 重復(fù)序列兩側(cè)的DNA序列保守性很強。這種串聯(lián)重復(fù)序列存在于幾乎所有真核生物的基因組中，且呈隨機均勻分布。它們不僅大量分布于基因的間隔區(qū)和內(nèi)含子中，而且還分布于基因的外顯子和調(diào)控區(qū)(如啟動子、增強子)。例如，完整的人類基因組序列顯示，微衛(wèi)星標(biāo)記約占3%。在染色體上，除著絲粒及端粒區(qū)域外，其它區(qū)域均廣泛分布有微衛(wèi)星位點。其重復(fù)單位數(shù)目的改變可以引起相當(dāng)高的多態(tài)性，但突變率僅為0.5X 10_4—
5.0X 10_4，在譜系中可以穩(wěn)定地遺傳，是一種很好的遺傳標(biāo)志。到目前為止，國際上還沒有一套用以分析蠅蛹金小蜂遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物及其用途和分析方法，并進(jìn)一步給出了應(yīng)用該引物的PCR測定方法。具體技術(shù)方案如下:
[0005]一種用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物，其核苷酸序列為:
[0006]BLlF:GGGGTGTGTGAGATAACGC, BLlR:GGAGGCGAAATTTGTTGCT ；
[0007]BL2F: CGTCCATTGGAGAGACATCG, BL2R: TGTATATCGCGCACGGACC ；
[0008]BL3F:AGCCATCGTGATTTCTCCG, BL3R:CGATACACGCGCGTCTATTC ；
[0009]BL4F:AGCGAGCAAAGGTAGTGGTG, BL4R:CACCGACCATCGTCATTATCT ；
[0010]BL5F: CGACGTAAAAAGTCATTACGAGTC, BL5R:ATTTCCAATTTGGCACGGTC ；
[0011 ] BL6F:GCATCGTCTCCTGAACAATC, BL6R:GATACCACTCGCACGAGGT ；[0012]BL7F:GCGAAGGTGAAACGGAGAA, BL7R:ATAGGCATACGTGCGACAGC ；
[0013]BL8F: CGTTTCTGTTTGTCATCGACAG, BL8R:AGATGGTTCGGCGATAAAGA ；
[0014]BL9F: TCAGCATTAAATGGCGTCG, BL9R: CACTTGAGCGCGTTCAATC ；
[0015]BLlOF:GTCTGCCTCGTCTCGGATT, BLlOR:AGCGAGCGAGTGAGAGAGTAAG。
[0016]進(jìn)一步地，
[0017]引物BLl重復(fù)基序為(TC) 12，溶解溫度Tm為55.5°C，擴增片段大小為162-174;
[0018]引物BL2重復(fù)基序為(CT) 11，溶解溫度Tm為55.7°C，擴增片段大小為156-169;
[0019]引物BL3重復(fù)基序為(TC) 13，溶解溫度Tm為55.4°C，擴增片段大小為166-182 ;
[0020]引物BL4重復(fù)基序為(AG) IOTA(AG)7，溶解溫度Tm為51.7°C，擴增片段大小為211-215；
[0021]引物BL5重復(fù)基序為(AG) 8，溶解溫度Tm為52.9°C，擴增片段大小為130-149 ;
[0022]引物BL6重復(fù)基序為(AG) 11，溶解溫度Tm為51.8°C，擴增片段大小為128-174 ；
[0023]引物BL7重復(fù)基序為(AG) 9，溶解溫度Tm為53.7°C，擴增片段大小為157-167 ；
[0024]引物BL8重復(fù)基序為(AG) 10，溶解溫度Tm為53.(TC，擴增片段大小為155-177 ；
[0025]引物BL9重復(fù)基序為(GA) 11，溶解溫度Tm為54.4°C，擴增片段大小為172-184 ；
[0026]引物BLlO重復(fù)基序為(GA) 11，溶解溫度Tm為55.7°C，擴增片段大小為282-292。
[0027]上述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途，用于蠅蛹金小蜂群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。
[0028]上述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途的分析方法，包括如下步驟:
[0029](I)基因組DNA提?。?br> [0030](2) TP-Ml3-SSR 分子標(biāo)記檢測；
[0031](3)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。
[0032]進(jìn)一步地，步驟(1)中具體包括如下步驟:
[0033]I)從樣本中取出個體；
[0034]2)容器中研磨成粉末,加入Buffer Digestion,震蕩混勻；
[0035]3)水浴至細(xì)胞完全裂；
[0036]4)加入Buffer PA,充分顛倒混勻；
[0037]5)離心，將上清液轉(zhuǎn)移到新的容器；
[0038]6)加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫放置；
[0039]7)離心，棄上清；
[0040]8)加入乙醇，顛倒漂洗，離心棄上清；
[0041]9)開蓋室溫倒置至殘留的乙醇完全揮發(fā)；
[0042]10)得到的 DNA 用 TE Buffer 溶解；
[0043]11)收集 DNA，保存。
[0044] 進(jìn)一步地，步驟(1)中采用動物基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取。
[0045]進(jìn)一步地，步驟(3)中用p0pgen3.2進(jìn)行等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性等分析。
[0046]進(jìn)一步地，步驟I)中從樣本中取出60個體，用雙蒸水浸泡清洗。[0047]進(jìn)一步地，步驟2)中加到1.5ml離心管中，研磨成粉末，加入400μ L BufferDigestion,震蕩混勻。
[0048]進(jìn)一步地，步驟3) 65°C水浴I小時至細(xì)胞完全裂；步驟4)加入200 μ LBuffer PA，充分顛倒混勻，置于_20°C冰箱放置5min ;步驟5)室溫1000Orpm離心5min，將500-550 μ L上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中；步驟6)加入等體積的異丙醇，顛倒5-8次使之充分混勻，室溫放置2-3min ;步驟7)室溫1000Orpm離心5min,棄上清；步驟8)加入1111175%乙醇，顛倒漂洗l_3min, 1000Orpm離心2min,棄上清,且此步驟8)重復(fù)2次；步驟9)開蓋室溫倒置5-10min至殘留的乙醇完全揮發(fā)；步驟10)得到的DNA用20 μ LTE Buffer溶解；步驟11)收集DNA，-20°C保存。
[0049]與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明引物是從樣本中提取DNA，篩選微衛(wèi)星位點，從而設(shè)計引物。該組引物PCR擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、多態(tài)性好，可用于多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。
【具體實施方式】
[0050]下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，其為本發(fā)明多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。
[0051]一組用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物，進(jìn)一步地微衛(wèi)星引物的核苷酸序列及指標(biāo)參數(shù)如表1所示:
[0052]表1蠅蛹金小蜂微衛(wèi)星引物及對應(yīng)的指標(biāo)參數(shù)
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物，其特征在于，其核苷酸序列為: BLlF:GGGGTGTGTGAGATAACGC,BLlR:GGAGGCGAAATTTGTTGCT ；
BL2F:CGTCCATTGGAGAGACATCG, BL2R: TGTATATCGCGCACGGACC ；
BL3F:AGCCATCGTGATTTCTCCG,BL3R: CGATACACGCGCGTCTATTC ；
BL4F:AGCGAGCAAAGGTAGTGGTG, BL4R: CACCGACCATCGTCATTATCT ；
BL5F:CGACGTAAAAAGTCATTACGAGTC, BL5R:ATTTCCAATTTGGCACGGTC ；
BL6F:GCATCGTCTCCTGAACAATC, BL6R:GATACCACTCGCACGAGGT ；
BL7F:GCGAAGGTGAAACGGAGAA,BL7R:ATAGGCATACGTGCGACAGC ；
BL8F:CGTTTCTGTTTGTCATCGACAG, BL8R:AGATGGTTCGGCGATAAAGA ；
BL9F:TCAGCATTAAATGGCGTCG,BL9R: CACTTGAGCGCGTTCAATC ；
BLlOF:GTCTGCCTCGTCTCGGATT, BLlOR:AGCGAGCGAGTGAGAGAGTAAG。
2.如權(quán)利要求1所述的用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物，其特征在于，引物BLl重復(fù)基序為(TC) 12，溶解溫度Tm為55.5°C，擴增片段大小為162-174 ； 引物BL2重復(fù)基序為(CT) 11，溶解溫度Tm為55.7°C，擴增片段大小為156-169 ； 引物BL3重復(fù)基序為(TC) 13，溶解溫度Tm為55.4°C，擴增片段大小為166-182; 引物BL4重復(fù)基序為(AG) IOTA (AG) 7，溶解溫度Tm為51.7 °C，擴增片段大小為211-215 ； 引物BL5重復(fù)基序為(AG) 8，溶解溫度Tm為52.9°C，擴增片段大小為130-149 ； 引物BL6重復(fù)基序為(AG) 11，溶解溫度Tm為51.8°C，擴增片段大小為128-174 ； 引物BL7重復(fù)基序為(AG) 9，溶解溫度Tm為53.7°C，擴增片段大小為157-167 ； 引物BL8重復(fù)基序為(AG) 10，溶解溫度Tm為53.(TC，擴增片段大小為155-177 ； 引物BL9重復(fù)基序為(GA) 11，溶解溫度Tm為54.4°C，擴增片段大小為172-184 ； 引物BLlO重復(fù)基序為(GA) 11，溶解溫度Tm為55.7°C，擴增片段大小為282-292。
3.如權(quán)利要求1和2所述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途，其特征在于，用于蠅蛹金小蜂群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。
4.如權(quán)利要求3所述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途的分析方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)基因組DNA提取； (2)TP-M13-SSR分子標(biāo)記檢測； (3)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。
5.如權(quán)利要求4所述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途的分析方法，其特征在于，步驟(1)中具體包括如下步驟: 1)從樣本中取出個體； 2)容器中研磨成粉末,加入BufferDigestion,震蕩混勻； 3)水浴至細(xì)胞完全裂； 4)加入BufferPA,充分顛倒混勻； 5)離心，將上清液轉(zhuǎn)移到新的容器； 6)加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫放置； 7)離心，棄上清；8)加入乙醇，顛倒漂洗，離心棄上清； 9)開蓋室溫倒置至殘留的乙醇完全揮發(fā)； 10)得到的DNA用TEBuffer溶解； 11)收集DNA，保存。
6.如權(quán)利要求4或5所述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途的分析方法，其特征在于，步驟(1)中采用動物基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取。
7.如權(quán)利要求4-6中任一項所述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途的分析方法，其特征在于，步驟(3)中用popgen3.2進(jìn)行等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性等分析。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項所述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途的分析方法，其特征在于，步驟I)中從樣本中取出60個體，用雙蒸水浸泡清洗。
9.如權(quán)利要求 5-8中任一項所述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途的分析方法，其特征在于，步驟2)中加到1.5ml離心管中,研磨成粉末,加入400μ L BufferDigestion,震蕩混勻。
10.如權(quán)利要求5-9中任一項所述用于蠅蛹金小蜂多樣性分析的微衛(wèi)星引物的用途的分析方法，其特征在于，步驟3) 65°C水浴I小時至細(xì)胞完全裂；步驟4)加入200 μ LBufferPA,充分顛倒混勻，置于-20°C冰箱放置5min ;步驟5)室溫1000Orpm離心5min，將500-550 μ L上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中；步驟6)加入等體積的異丙醇，顛倒5_8次使之充分混勻，室溫放置2-3min ;步驟7)室溫1000Orpm離心5min，棄上清；步驟8)加入lml75%乙醇,顛倒漂洗l_3min, 1000Orpm離心2min,棄上清,且此步驟8)重復(fù)2次；步驟9)開蓋室溫倒置5-10min至殘留的乙醇完全揮發(fā)；步驟10)得到的DNA用20 μ LTE Buffer溶解；步驟11)收集DNA，-20°C保存。
【文檔編號】C12N15/11GK103981257SQ201410166679
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】胡好遠(yuǎn), 陳偉, 方磊, 劉佳璐, 賀張 申請人:安徽師范大學(xué)