一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法，屬于食品加工【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明以殼聚糖-TPP為載體用離子凝膠一步法固定葡萄糖氧化酶，真空低溫干燥后制得固定化葡萄糖氧化酶。該固定化酶制劑能有效減緩葡萄糖氧化酶的催化速率，從而控制過氧化氫的釋放速度，進(jìn)而有利于焙烤過程中小麥面筋蛋白的氧化交聯(lián)，優(yōu)化面筋蛋白的組織結(jié)構(gòu)，提高小麥面粉的加工特性；同時也有效增加了葡萄糖氧化酶在面粉加工過程中的穩(wěn)定性。該方法工藝簡單、安全有效，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法，屬于食品加工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)侵饕募Z食作物之一，我國小麥種植廣，產(chǎn)量大，但是存在一硬麥不硬，軟麥不軟Il的特點，小麥面筋含量不高，僅靠遺傳育種還不能在短期內(nèi)改善小麥面粉的面筋品質(zhì)，所以亟需開發(fā)安全有效的強(qiáng)筋劑。溴酸鉀是種極佳的強(qiáng)筋劑，它是一種慢速氧化劑，在醒發(fā)后期和焙烤期間作用更明顯，它能改善面團(tuán)的流變性能，增強(qiáng)面團(tuán)結(jié)構(gòu)，提高面團(tuán)的粘彈性，增加面包比容。但一些報道指出溴酸鉀具有致癌性，很多國家已經(jīng)禁止使用。我國也于2005年7月I日起取消溴酸鉀作為面粉處理劑。
[0003]隨著溴酸鉀的禁用，以及人們生活水平的提高和健康意識的加強(qiáng)，綠色無公害的面粉改良劑一酶制劑成為當(dāng)前研究的熱點，如戊聚糖酶、漆酶、己糖酶和葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶(GO)是最具潛力的替代溴酸鉀的酶制劑，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到實際生產(chǎn)之中。GO能將葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和過氧化氫(H2O2)。過氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，在過氧化氫酶的催化下將面團(tuán)中的巰基(-SH)氧化成二硫鍵(-S-S-)，使面筋蛋白發(fā)生氧化交聯(lián)，從而有利于形成面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在面團(tuán)形成過程中增強(qiáng)面筋強(qiáng)度，提高面團(tuán)的持水能力、面包的比容和改善面包的質(zhì)量。然而，GO在改善面包各項品質(zhì)方面尚有許多不足之處，GO并不能完全取代溴酸鉀。首先，GO屬于快速氧化劑，在加水形成面團(tuán)過程中就催化葡萄糖快速氧化，生成大量的H2O2，引起面團(tuán)過度氧化，從而使面團(tuán)變干變硬，導(dǎo)致最終的焙烤產(chǎn)品品質(zhì)不佳；其次，GO在面團(tuán)中的穩(wěn)定 性較差，易失活，且在焙烤期，會熱失活，起不到任何作用。
[0004]殼聚糖是自然界中唯一發(fā)現(xiàn)的帶陽離子性質(zhì)的堿性多糖，具有生物降解、安全無毒害、生物相容等特點，在酶固定化方面顯示出了重要作用。殼聚糖壁材所具有的較大外表面積有助于GO的固定，同時還能降低過氧化氫的釋放速率，達(dá)到緩釋效果。
[0005]目前，國內(nèi)外關(guān)于用固定化葡萄糖氧化酶作為面粉改良劑的研究甚少，江南大學(xué)俞超華(CN102422848A)用殼聚糖-三聚磷酸鈉(TPP)凝膠為壁材通過二步吸附法制備得到固定化葡萄糖氧化酶，先制得空白的殼聚糖-TPP微粒，再將GO溶液與微?；旌衔街频煤珿O的微粒，但該法得到的殼聚糖-TPP-GO混合體系，固形物含量低，直接將混合體系用于噴霧干燥得到固定化葡萄糖氧化酶，耗時耗能，且噴霧干燥過程中酶活會因高溫有所損失，得率也較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法，提高固定化酶的產(chǎn)量。先由殼聚糖溶液和GO溶液制備殼聚糖-GO溶液，然后向殼聚糖-GO溶液中添加TPP水溶液，從而在載體形成的同時將GO包裹進(jìn)去，形成固定化GO微粒。通過直接離心獲取沉淀，去除大量的含未固定化酶的上清溶液，降低干燥的成本，再經(jīng)真空低溫干燥即可獲得固定化GO粉末。
[0007]所述殼聚糖和TPP的質(zhì)量比為3:1-7:1 ;所述殼聚糖與GO的比例為3_7:1。
[0008]所述殼聚糖溶液優(yōu)選將粘度700cps、脫乙酰度為90%的殼聚糖用體積濃度為
0.1-2%的乙酸水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為0.5-3%殼聚糖溶液，用100-200目尼龍濾布過濾去除不溶性雜質(zhì)。
[0009]所述GO溶液優(yōu)選用ρΗ5.0-7.0的磷酸鹽緩沖液配置質(zhì)量濃度為5_20mg/mL的GO溶液。所使用的GO是粉末狀，活力為10000U/g。
[0010]所述TPP水溶液優(yōu)選質(zhì)量濃度為4-16mg/mL的TPP水溶液，用0.45 μ m濾膜過濾，形成透明溶液。
[0011]所述殼聚糖-GO溶液的制備優(yōu)選向殼聚糖溶液中通過恒流泵加入GO溶液，攪拌速度 100-200r/min。
[0012]所述固定化GO微粒的制備優(yōu)選將TPP水溶液在100-500r/min的攪拌速度下，以2-6mL/min的滴加速度緩慢加入到殼聚糖-GO溶液中，形成殼聚糖-GO-TPP混合體系，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌0.5-lh，形成固定化酶分散體系。
[0013]本發(fā)明技術(shù)方案優(yōu)選以下步驟:
[0014](I)將粘度700cps、脫乙酰度為90%的殼聚糖用體積濃度為0.1_2%的乙酸水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為0.5-3%殼聚糖溶液，用100-200目尼龍濾布過濾去除不溶性雜質(zhì)；
[0015](2)配置ρΗ5.0-7.0的磷酸鹽緩沖液，用該緩沖液配置成質(zhì)量濃度為5_20mg/mL的GO溶液；
[0016](3)向步驟⑴得到的殼聚糖溶液中通過恒流泵加入步驟(2)得到的GO溶液，攪拌速度100-200r/min，得到殼聚糖-GO溶液；
[0017](4)配置質(zhì)量濃度為4-16mg/mL的TPP水溶液，用0.45 μ m濾膜過濾，形成透明溶液；
[0018](5)將步驟(4)得到的TPP水溶液在100-500r/min的攪拌速度下，以2_6mL/min的滴加速度緩慢加入到步驟(3)得到的殼聚糖-GO溶液中，形成殼聚糖-GO-TPP混合體系，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌0.5-lh，形成固定化酶分散體系。
[0019](6)將步驟(5)得到的殼聚糖-GO-TPP固定化混合體系，離心獲取沉淀，離心條件為:8000-10000r/min、溫度 10°C、時間 20_40min ；
[0020](7)將步驟(6)得到的沉淀進(jìn)行低溫干燥，得到乳白色的固定化酶粉末。
[0021]本發(fā)明通過一步法制備固定化葡萄糖氧化酶，在載體形成的同時將GO包裹進(jìn)去，形成GO微粒，再經(jīng)離心獲取沉淀，去除大量未固定的酶的上清，將沉淀進(jìn)行真空低溫干燥獲得固定化GO粉末。既實現(xiàn)了酶與載體的充分接觸，也提高了固形物含量，提升了固定化GO的得率，降低酶活損失，又降低了干燥成本。該酶制劑具有良好的緩釋效果，穩(wěn)定性增強(qiáng)，產(chǎn)率增加，能有效地提高GO在焙烤產(chǎn)品中的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1實施例1所得固定化酶的緩釋效果，.:固定化酶:游離酶。
[0023]圖2實施例2所得固定化酶的緩釋效果，.:固定化酶，:游離酶。【具體實施方式】
[0024]固定化葡萄糖氧化酶的酶活力測定方法:利用葡萄糖氧化酶-辣根過氧化物酶-鄰聯(lián)茴香胺偶聯(lián)反應(yīng)體系測定游離GO酶活。依次向反應(yīng)體系中加入2.4mL0.006%鄰聯(lián)茴香胺.2Η(:1 (0.lmol/L pH7.0 磷酸鹽緩沖液)、0.5mL 10% (w/v)葡萄糖和 0.lmL60U/mL辣根過氧化物酶，充分混勻后，在體系中加入0.1mL GO (0.15-0.2U/mL)，精確計時5min后，在426nm下測定吸光值。GO酶活的定義:室溫條件下，Imin內(nèi)催化葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生I μ mol過氧化氫(H2O2)所需的酶量為IU。
[0025]利用由0.2mol/L NaHCO3 和 0.06mol/L Na3C6H5O7.2H20, pH = 7.8-8.2.組成的破囊液將固定化葡萄糖氧化酶破囊使其成為游離的G0，采用上述相同的方法測定酶活。
[0026]固定化葡萄糖緩釋效果的測定:G0催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸內(nèi)酯和H2O2。葡萄糖酸內(nèi)酯在水溶液中不穩(wěn)定，可逐漸水解生成葡萄糖酸，從而降低反應(yīng)體系的PH值。因此，通過動態(tài)記錄反應(yīng)體系的PH值的變化趨勢，可定性觀察緩釋GO催化反應(yīng)的速度。取IOg葡萄糖溶于IOOmL蒸餾水中，加入15mg游離GO或相當(dāng)于15mg游離GO制備得到的固定化G0,每隔IOmin測定溶液的pH值一次,記錄180min內(nèi)的數(shù)據(jù)。
[0027]面包芯的全質(zhì)構(gòu)分析:面包出爐2h后，對面包芯進(jìn)行全質(zhì)構(gòu)分析:將面包在面包切片機(jī)下切成厚度為20mm的厚薄均勻的薄片，選取中間位置進(jìn)行測定。測試用P/25型探頭，測定前速度:1.0mm/s ;測定速度:1.0mm/s ;測定后速度:3.0mm/s。下壓距離:50%,間隔5s。每個樣品取6次平行。
[0028]實施例1
[0029](I)將粘度700cps、脫乙酰度為90%的殼聚糖用體積濃度為I %的乙酸水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為1%殼聚糖溶液，用100目尼龍濾布過濾去除不溶性雜質(zhì)；
[0030](2)配置ρΗ5.6的磷酸鹽緩沖液，用該緩沖液配置成質(zhì)量濃度為10mg/mL的GO溶液；
[0031](3)向步驟⑴得到的殼聚糖溶液中通過恒流泵加入步驟(2)得到的GO溶液，殼聚糖和GO的質(zhì)量比為5:1，攪拌速度100r/min，得到殼聚糖-GO溶液；
[0032](4)配置質(zhì)量濃度為4mg/mL的TPP水溶液，用0.45 μ m濾膜過濾，形成透明溶液；
[0033](5)將步驟(4)得到的TPP水溶液在300r/min的攪拌速度下，以4mL/min的滴加速度緩慢加入到步驟(3)得到的殼聚糖-GO溶液中，形成殼聚糖-GO-TPP混合體系，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌0.5h，形成固定化酶分散體系。殼聚糖-GO和TPP的質(zhì)量比為6:1。
[0034](6)將步驟(5)得到的殼聚糖-GO-TPP固定化混合體系，離心獲取沉淀，離心條件為:8000r/min、溫度 10。。、時間 35min。
[0035](7)將步驟(6)得到的沉淀進(jìn)行真空低溫干燥(30°C )，得到乳白色的固定化酶粉末。 [0036]按此法制得的固定化GO，酶活回收達(dá)77.04 %，在緩釋效果測定中中，在開始的90min內(nèi)，固定化的GO所產(chǎn)生的H2O2速率明顯低于游離G0，起到了很好的緩釋作用(圖1)。將制備好的固定化GO以400U/kg面粉的添加量添加應(yīng)用到面包中制作過程中，對制得的面包進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析，與相同酶活添加量的游離GO作空白對照，面包的比容增加了 11.12%，硬度降低了 15.40%，彈性從0.919提高到0.930.[0037]實施例2
[0038](I)將粘度700cps、脫乙酰度為90%的殼聚糖用體積濃度為I %的乙酸水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為1.25%殼聚糖溶液，用100目尼龍濾布過濾去除不溶性雜質(zhì)；
[0039](2)配置pH7.0的磷酸鹽緩沖液，用該緩沖液配置成質(zhì)量濃度為12mg/mL的GO溶液；
[0040](3)向步驟⑴得到的殼聚糖溶液中通過恒流泵加入步驟(2)得到的GO溶液，殼聚糖和GO的質(zhì)量比為3:1，攪拌速度150r/min，得到殼聚糖-GO溶液；
[0041](4)配置質(zhì)量濃度為5mg/mL的TPP水溶液，用0.45 μ m濾膜過濾，形成透明溶液；
[0042](5)將步驟(4)得到的TPP水溶液在400r/min的攪拌速度下，以3mL/min的滴加速度緩慢加入到步驟(3)得到的殼聚糖-GO溶液中，形成殼聚糖-GO-TPP混合體系，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌Ih，形成固定化酶分散體系。殼聚糖-GO和TPP的質(zhì)量為4:1。
[0043](6)將步驟(5)得到的殼聚糖-GO-TPP固定化混合體系，離心獲取沉淀，離心條件為:8000r/min、溫度 10。。、時間 30min。
[0044](7)將步驟(6)得到的沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥，得到乳白色的固定化酶粉末。
[0045]按此法制得的固定化G0，酶活回收達(dá)89.74%，在緩釋效果測定中中，在開始的120min內(nèi)，固定化的GO所產(chǎn)生的H2O2速率明顯低于游離G0，起到了很好的緩釋作用(圖2)。將制備好的固定化GO以400U/kg面粉的添加量添加應(yīng)用到面包中制作過程中，對制得的面包進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析，與相同酶活添加量的游離GO作空白對照，面包的比容增加了 13.14%，硬度降低了 18.40%，彈性從0.921提高到 0.937。
[0046]對比例
[0047](I)將粘度700cps、脫乙酰度為90%的殼聚糖用體積濃度為I %的乙酸水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為I %殼聚糖溶液(加大殼聚糖濃度則導(dǎo)致在形成殼聚糖-TPP溶液過程中會直接絮凝沉淀，得不到均相的包埋載體)，用100目尼龍濾布過濾去除不溶性雜質(zhì)；
[0048](2)配置質(zhì)量濃度為2mg/mL的TPP水溶液，用0.45 μ m濾膜過濾，形成透明溶液；
[0049](3)向步驟(1)得到的殼聚糖溶液中通過恒流泵以3mL/min的滴加速度加入步驟(2)得到的TPP溶液，殼聚糖和三聚磷酸的質(zhì)量比為7:1，攪拌速度400r/min，得到殼聚糖-TPP溶液；
[0050](4)配置ρΗ5.6的磷酸鹽緩沖液，用該緩沖液配置成質(zhì)量濃度為10mg/mL的GO溶液；
[0051](5)將步驟(3)得到的殼聚糖-TPP水溶液在200r/min的攪拌速度下，以10mL/min的滴加速度緩慢加入步驟(4)得到的GO溶液中，形成殼聚糖-TPP-GO混合體系，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌lh，形成固定化酶分散體系。
[0052](6)將步驟(5)得到的殼聚糖-TPP-GO固定化混合體系，離心獲取沉淀，離心條件為:8000r/min、溫度10°C、時間90min,獲得少許沉淀(此均相體系很難沉淀)。
[0053](7)將步驟(5)得到的殼聚糖-TPP-GO固定化混合體系，直接噴霧干燥得到固定化葡萄糖氧化酶，體系固形物含量低，噴霧干燥過程耗時耗能，得率較低，且因過程中高溫酶活會有一定損失。
[0054] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求 書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種制備具有緩釋效果的固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，先由殼聚糖溶液和GO溶液混合制備殼聚糖-GO溶液，然后向殼聚糖-GO溶液中添加TPP水溶液，從而在載體形成的同時將GO包裹進(jìn)去，形成固定化GO微粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述殼聚糖-GO溶液中殼聚糖與GO的質(zhì)量比為:3:1-7:1，所述殼聚糖與TPP的質(zhì)量比為3:1-7:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步將固定化GO顆粒直接離心獲取沉淀、低溫干燥后獲得固定化GO粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述殼聚糖-GO溶液是通過將殼聚糖溶液通過恒流泵加入GO溶液，攪拌速度100-200r/min得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述殼聚糖溶液是通過將粘度700cps、脫乙酰度為90%的殼聚糖用體積濃度為0.1-2%的乙酸水溶液溶解，配成質(zhì)量濃度為0.5-3%殼聚糖溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述GO溶液是以pH5.0-7.0的磷酸鹽緩沖液配成質(zhì)量濃度為5-20mg/mL的GO溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述TPP水溶液的質(zhì)量濃度為4-16mg/mL,用0.45 μ m濾膜過濾,形成透明溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于，TPP水溶液在100-500r/min的攪拌速度下，以2-6mL/min的滴加速度緩慢加入到殼聚糖-GO溶液中，形成殼聚糖-GO-TPP混合體系，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌0.5-lh，形成固定化酶分散體系。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，離心條件為:8000-10000r/min、溫度10°C、時間 20-40min。
【文檔編號】C12N11/10GK104004744SQ201410262316
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】楊瑞金, 唐樂樂, 華霄, 趙偉, 張文斌 申請人:江南大學(xué)