一種具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其活性成分由黨參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，所述黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖10~250、枸杞多糖5~90，該黨參和枸杞復(fù)合多糖的純度及活性高，具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的功效。還公開了上述黨參和枸杞復(fù)合多糖的制備方法，該制備方法其工藝簡單穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生產(chǎn)，成本低，本發(fā)明還公開了上述黨參和枸杞多糖在制備具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的保健食品中的應(yīng)用。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多糖【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞 復(fù)合多糖及其制備方法和應(yīng)用。 一種具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖及其 制備方法和應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是困擾臨床腫瘤治療的具有普遍意義的難題，究其原因，在于現(xiàn) 有治療的目標(biāo)仍然集中在腫瘤細(xì)胞本身，而忽略了其微環(huán)境的重要性。腫瘤微環(huán)境與腫瘤 細(xì)胞之間是土壤與種子的關(guān)系，腫瘤惡變過程，就是腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境共進(jìn)化的過程，其 結(jié)果就是休眠腫瘤細(xì)胞的蘇醒，進(jìn)入快速增殖，并發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，改善腫瘤微環(huán)境，維持腫 瘤細(xì)胞的休眠狀態(tài)，是目前研究的熱點和重點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多糖就具有顯著地抗腫 瘤活性并且對人體的毒副作用相對較小，對多糖的生物活性研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)成為國內(nèi) 外專家學(xué)者研究的熱點。近年發(fā)現(xiàn)一些多糖及其復(fù)合物對多種疾病，如免疫紊亂、癌癥、糖 尿病、高血壓、肝炎、血栓、肺炎、病毒等都具有顯著療效，并且參與細(xì)胞各種生命現(xiàn)象的調(diào) 節(jié)并具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的作用。
[0003] 黨參為中國常用的傳統(tǒng)補益藥，古代以山西上黨地區(qū)出產(chǎn)的黨參為上品，具有補 中益氣，健脾益肺之功效。現(xiàn)代研究，黨參含多種糖類、酚類、留醇、揮發(fā)油、黃芩素葡萄糖 甙、皂甙及微量生物堿，具有增強免疫力、擴張血管、降壓、改善微循環(huán)、增強造血功能等作 用。此外對化療放療引起的白細(xì)胞下降有提升作用。枸杞是名貴的藥材和滋補品，中醫(yī)很 早就有"枸杞養(yǎng)生"的說法?！侗静菥V目》記載："枸杞，補腎生精，養(yǎng)肝……明目安神，令人長 壽。"目前尚未有人以黨參和枸杞為原料提取多糖并配制復(fù)合多糖，并用于調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán) 境及輔助抑制腫瘤保健食品方面的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合 多糖，該黨參和枸杞復(fù)合多糖以黨參和枸杞為原料提取獲得，獲得的黨參和枸杞復(fù)合多糖 純度及活性高，具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的功效。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的在于提供上述具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合 多糖的制備方法，該制備方法工藝簡潔、高效穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)，成本低。
[0006] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供上述具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù) 合多糖在制備具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的保健食品中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功 效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其活性成分由黨參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，所述黨參多糖和 枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖10?250、枸杞多糖5~ 90。
[0008] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，本發(fā)明所述的黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份 配比為黨參多糖50?150、枸杞多糖20?80。
[0009] 作為本發(fā)明的一種較佳的具體實施技術(shù)方案，本發(fā)明所述的黨參多糖和枸杞多糖 的質(zhì)量份配比為黨參多糖50、枸杞多糖50。
[0010] 本發(fā)明所述的黨參多糖或枸杞多糖優(yōu)選通過以下方法制備獲得：選取黨參或枸杞 為原料，采用沸水提取多次，合并提取液并濃縮得濃縮液al，將濃縮液al采用透析袋進(jìn)行 透析得透析液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2,在濃縮液a2中加入三氯乙酸水溶液進(jìn) 行蛋白沉淀后離心，取上清液進(jìn)行中和、透析處理得透析液b2,將透析液b2濃縮得濃縮液 a3,在濃縮液a3中加入乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，所得沉淀物即為黨參多糖或枸杞多糖。 [0011] 在上述黨參多糖或枸杞多糖的制備過程中：采用沸水提取時，共提取1飛次，每次 提取時沸水的用量為黨參或枸杞原料總質(zhì)量的ΚΓ20倍，每次提取時間為4~5h。
[0012] 在上述黨參多糖或枸杞多糖的制備過程中：所述三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的體 積百分含量為15~35%，其用量與濃縮液a2的體積相同，進(jìn)行蛋白沉淀時間為:T4h。
[0013] 在上述黨參多糖或枸杞多糖的制備過程中：所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含 量為7(Γ95%，乙醇水溶液的用量為濃縮液a3總體積的2?4倍。
[0014] 優(yōu)選將透析液bl濃縮至原體積的1/10左右得濃縮液a2,將透析液b2濃縮至原體 積的1/10左右得濃縮液a3。
[0015] 透析袋的截留分子量優(yōu)選為3500 Da。
[0016] 本發(fā)明的第二個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：上述具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功 效的黨參和枸杞復(fù)合多糖的制備方法，包括以下步驟： (1) 選取黨參或枸杞原料，采用沸水提取多次，合并提取液并濃縮得濃縮液al ; (2) 將濃縮液al采用透析袋進(jìn)行透析得透析液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2 ; (3) 在濃縮液a2中加入三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀后離心，取上清液進(jìn)行中和、透 析處理得透析液b2,將透析液b2濃縮得濃縮液a3 ; (4) 在濃縮液a3中加入乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，所得沉淀物即為黨參多糖或枸杞多 糖； (5) 將黨參多糖和枸杞多糖按照上述計量比混勻，即制備獲得黨參和枸杞復(fù)合多糖。
[0017] 在該黨參和枸杞復(fù)合多糖的制備方法中： 步驟（1)中采用沸水提取時，共提取Γ5次，每次提取時沸水的用量為黨參或枸杞原料 總質(zhì)量的1(Γ20倍，每次提取時間為4?5h ;步驟（3)中所述三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的 體積百分含量為15~35%，其用量與濃縮液a2的體積相同，進(jìn)行蛋白沉淀時間為:T4h ;步驟 (4)中所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為7(Γ95%，乙醇水溶液的用量為濃縮液a3總 體積的2~4倍。
[0018] 步驟（2)優(yōu)選將透析液bl濃縮至原體積的1/10左右得濃縮液a2,步驟（3)中優(yōu) 選將透析液b2濃縮至原體積的1/10左右得濃縮液a3。
[0019] 步驟（2)和步驟（3)中透析袋的截留分子量優(yōu)選為3500 Da。
[0020] 本發(fā)明的最后一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：上述具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境 功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖在制備具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的保健食品中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明所述保健食品的劑型可以為膠囊型、片劑、粉劑、顆粒劑或口服液等。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點： (1)本發(fā)明中的黨參和枸杞復(fù)合多糖，可以通過抑制腫瘤新生血管生成、免疫抑制及免 疫負(fù)調(diào)控等多途徑調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，其具有良好的抗腫瘤活性，其可以直接口服，也可以制 成藥劑學(xué)上所說的多種劑型，如膠囊型、片劑、粉劑、顆粒劑或口服液等，食用后具有調(diào)節(jié)腫 瘤微環(huán)境以及輔助抑制腫瘤的功效； (2) 本發(fā)明中的黨參和枸杞復(fù)合多糖以富含活性多糖的中草藥為主料，利用各種多糖 成分合理組合、配合共用，通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以及輔助抑制腫瘤，對亞健康保健 具有良好的效果； (3) 本發(fā)明中的黨參和枸杞復(fù)合多糖的制備方法，其工藝簡單穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生 產(chǎn)，成本低。

【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0024] 以下實施例中采用的各原料，如無特殊說明，均為市售產(chǎn)品。
[0025] 第一部分黨參和枸杞復(fù)合多糖及其制備方法 實施例1 本實施例中的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其活性成分由黨參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，其 中黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖10、枸杞多糖90。
[0026] 上述黨參和枸杞復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得： (1) 制備黨參多糖：選取黨參藥材3kg，加入水30L，加熱煮沸提取，共提取3次，每次提 取5小時，合并提取液并濃縮至約5L得濃縮液al，將濃縮液al采用透析袋(截留分子量為 3500 Da，同下）和對流水進(jìn)行透析大約2天后得透析液bl，將透析液bl濃縮至原體積的 1/10左右得濃縮液a2,下同，在濃縮液a2中加入等體積的三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀后 離心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的體積百分含量為30%，溫度為4°C，去蛋白時間約 為:T4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氫氧化鈉水溶液(其中氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量約為 10%)中和至中性得中性上清液，將中性上清液進(jìn)行透析大約2天后得透析液b2 (截留分子 量為3500 Da，同下)，將透析液b2濃縮至大約3L得濃縮液a3,在濃縮液a3中邊攪拌邊加 入乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，其中乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為85%，用量約為濃縮 液a3的3倍，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀分別用無水乙醇脫水1次，丙酮脫水2次，40°C 真空干燥，所得沉淀物即為黨參多糖； (2) 制備枸杞多糖，枸杞多糖的制備方法同黨參多糖； (3) 將黨參多糖和枸杞多糖按照黨參多糖10、枸杞多糖90的質(zhì)量份配比混勻，即制備 獲得黨參和枸杞復(fù)合多糖。
[0027] 實施例2 本實施例中的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其活性成分由黨參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，其 中黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖250、枸杞多糖5。
[0028] 上述黨參和枸杞復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得： (1)制備黨參多糖：選取黨參藥材3kg，加入水60L，加熱煮沸提取，共提取3次，每次提 取4小時，合并提取液并濃縮至約5L得濃縮液al，將濃縮液al采用透析袋和對流水進(jìn)行透 析大約2天后得透析液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2,在濃縮液a2中加入等體積的 三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀后離心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的體積百分含量為 15%，溫度為4°C，去蛋白時間約為:T4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氫氧化鈉水溶液(其中 氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量約為10%)中和至中性得中性上清液，將中性上清液進(jìn)行透析大約 2天后得透析液b2,將透析液b2濃縮至大約3L得濃縮液a3,在濃縮液a3中邊攪拌邊加入 乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，其中乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為70%，用量約為濃縮液 a3的3倍，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀分別用無水乙醇脫水1次，丙酮脫水2次，40°C真 空干燥，所得沉淀物即為黨參多糖； (2) 制備枸杞多糖，枸杞多糖的制備方法同黨參多糖； (3) 將黨參多糖和枸杞多糖按照黨參多糖250、枸杞多糖5的質(zhì)量份配比混勻，即制備 獲得黨參和枸杞復(fù)合多糖。
[0029] 實施例3 本實施例中的黨參和枸杞復(fù)合多糖，由黨參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，其中黨參多糖 和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖50、枸杞多糖80。
[0030] 上述黨參和枸杞復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得： (1) 制備黨參多糖：選取黨參藥材3kg，加入水30L，加熱煮沸提取，共提取3次，每次提 取5小時，合并提取液并濃縮至約5L得濃縮液al，將濃縮液al采用透析袋和對流水進(jìn)行透 析大約2天后得透析液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2,在濃縮液a2中加入等體積的 三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀后離心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的體積百分含量為 35%，溫度為4°C，去蛋白時間約為：T4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氫氧化鈉水溶液(其中 氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量約為10%)中和至中性得中性上清液，將中性上清液進(jìn)行透析大約 2天后得透析液b2,將透析液b2濃縮至大約3L得濃縮液a3,在濃縮液a3中邊攪拌邊加入 乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，其中乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為80%，用量約為濃縮液 a3的3倍，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀分別用無水乙醇脫水1次，丙酮脫水2次，40°C真 空干燥，所得沉淀物即為黨參多糖； (2) 制備枸杞多糖，枸杞多糖的制備方法同黨參多糖； (3) 將黨參多糖和枸杞多糖按照黨參多糖50、枸杞多糖80的質(zhì)量份配比混勻，即制備 獲得黨參和枸杞復(fù)合多糖。
[0031] 實施例4 本實施例中的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其活性成分由黨參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，其 中黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖150、枸杞多糖20。
[0032] 上述黨參和枸杞復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得： (1)制備黨參多糖：選取黨參藥材3kg，加入水60L，加熱煮沸提取，共提取5次，每次提 取4小時，合并提取液并濃縮至約5L得濃縮液al，將濃縮液al采用透析袋)和對流水進(jìn)行 透析大約2天后得透析液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2,在濃縮液a2中加入等體積 的三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀后離心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的體積百分含量 為20%，溫度為4°C，去蛋白時間約為：T4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氫氧化鈉水溶液(其 中氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量約為10%)中和至中性得中性上清液，將中性上清液進(jìn)行透析大 約2天后得透析液b2,將透析液b2濃縮至大約3L得濃縮液a3,在濃縮液a3中邊攪拌邊加 入乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，其中乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為80%，用量約為濃縮 液a3的4倍，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀分別用無水乙醇脫水1次，丙酮脫水2次，40°C 真空干燥，所得沉淀物即為黨參多糖； (2) 制備枸杞多糖，枸杞多糖的制備方法同黨參多糖； (3) 將黨參多糖和枸杞多糖按照黨參多糖150、枸杞多糖20的質(zhì)量份配比混勻，即制備 獲得黨參和枸杞復(fù)合多糖。
[0033] 實施例5 本實施例中的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其活性成分由黨參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，其 中黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份比為黨參多糖50、枸杞多糖25。
[0034] 上述黨參和枸杞復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得： (1) 制備黨參多糖：選取黨參藥材3kg，加入水40L，加熱煮沸提取，共提取5次，每次提 取5小時，合并提取液并濃縮至約5L得濃縮液al，將濃縮液al采用透析袋和對流水進(jìn)行透 析大約2天后得透析液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2,在濃縮液a2中加入等體積的 三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀后離心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的體積百分含量為 35%，溫度為4°C，去蛋白時間約為：T4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氫氧化鈉水溶液(其中 氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量約為10%)中和至中性得中性上清液，將中性上清液進(jìn)行透析大約 2天后得透析液b2,將透析液b2濃縮至大約3L得濃縮液a3,在濃縮液a3中邊攪拌邊加入 乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，其中乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為95%，用量約為濃縮液 a3的3倍，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀分別用無水乙醇脫水1次，丙酮脫水2次，40°C真 空干燥，所得沉淀物即為黨參多糖； (2) 制備枸杞多糖，枸杞多糖的制備方法同黨參多糖； (3) 將黨參多糖和枸杞多糖按照黨參多糖50、枸杞多糖25的質(zhì)量份配比混勻，即制備 獲得黨參和枸杞復(fù)合多糖。
[0035] 實施例6 本實施例中的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其活性成分由黨參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，其 中黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖100、枸杞多糖50 ; 上述黨參和枸杞復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得： (1)制備黨參多糖：選取黨參藥材3kg，加入水50L，加熱煮沸提取，共提取5次，每次提 取4小時，合并提取液并濃縮至約5L得濃縮液al，將濃縮液al采用透析袋和對流水進(jìn)行透 析大約2天后得透析液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2,在濃縮液a2中加入等體積的 三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀后離心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的體積百分含量為 20%，溫度為4°C，去蛋白時間約為：T4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氫氧化鈉水溶液(其中 氫氧化鈉的質(zhì)量百分含量約為10%)中和至中性得中性上清液，將中性上清液進(jìn)行透析大約 2天后得透析液b2,將透析液b2濃縮至大約3L得濃縮液a3,在濃縮液a3中邊攪拌邊加入 乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，其中乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為80%，用量約為濃縮液 a3的3倍，靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀分別用無水乙醇脫水1次，丙酮脫水2次，40°C真 空干燥，所得沉淀物即為黨參多糖。
[0036] (2)制備枸杞多糖，枸杞多糖的制備方法同黨參多糖； (3)將黨參多糖和枸杞多糖按照黨參多糖100、枸杞多糖50的質(zhì)量份配比混勻，即制備 獲得黨參和枸杞復(fù)合多糖。
[0037] 實施例7 黨參多糖和枸杞多糖的制備方法同實施例1，分別取黨參多糖5g、枸杞多糖5 g，以 (1:1)比例混合均勻，得復(fù)合多糖組分P1。
[0038] 實施例8 黨參多糖和枸杞多糖的制備方法同實施例1，分別取黨參多糖lg、枸杞多糖5 g，以 (1:5)比例混合均勻，得復(fù)合多糖組分P2。
[0039] 實施例9 黨參多糖和枸杞多糖的制備方法同實施例1，分別取黨參多糖10g、枸杞多糖5 g，以 (2:1)比例混合均勻，得復(fù)合多糖組分P3。
[0040] 實施例10 以上述實施例1-9中提供的復(fù)合多糖為主要功效成分制備保健食品，通過常規(guī)工藝， 可以制成藥劑學(xué)上所說的多種劑型，如膠囊劑、片劑、粉劑、顆粒或口服液等。
[0041] 第二部分多糖及復(fù)合多糖輔助抑制腫瘤活性實驗 實施例11復(fù)合多糖可抑制BMP2誘導(dǎo)的帶有BRE報告基因的熒光素酶的活性 C2C12細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞庫，C2C12- pGFl-BRE細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海藥物研究 所丁侃實驗室構(gòu)建，保存于液氮中。C2C12- pGFl-BRE細(xì)胞用含10 % Gibco胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C飽和濕度、含5% C02的恒溫箱中培養(yǎng)，以1 X 104細(xì)胞/孔的密度接 種于96孔板內(nèi)，每孔100 μ L。貼壁24 h后吸去60 μ L培養(yǎng)基，加配置好相應(yīng)濃度的多 糖樣品（？1、？2、？3)50以1^，終濃度分別為0.5 11^/1^、0.111^/1^、0.02 11^/1^，10 4 1^1^2 調(diào)整至終濃度200 ng/mL。同時設(shè)空白組和ΒΜΡ2組對照。給藥16 h后吸去培養(yǎng)基，加20 μ L Reporter Lysis IX Buffer，將溶解的細(xì)胞裂解液20 μ L轉(zhuǎn)移至白板，加入40 μ L luciferase底物，于3分鐘內(nèi)讀板，讀取RLU值。采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù) 據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（.Z ±·5)表示，兩組間比較采用獨立樣本?檢驗，多組間比較采用 單因素方差分析。
[0042] 實施例12復(fù)合多糖對NF- κ Β報告基因的熒光素酶的活性 ΤΗΡ-1細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞庫，THP-l/pGFl-NF-κΒ細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海藥 物研究所丁侃實驗室構(gòu)建，保存于液氮中。THP-l/pGFl-NF-κΒ細(xì)胞用含10%胎牛血清 RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于37 °C飽和濕度、含5% 0)2的恒溫箱中培養(yǎng)，以5Χ104細(xì)胞/ 孔的密度接種于96孔板內(nèi)，每孔50 μ L容積。加入受試樣品（P1、P2、P3) 50 μ L，終濃度 分別為0· 5 mg/mL、0· 1 mg/mL、0· 02 mg/mL，同時設(shè)立空白組和LPS對照組。加入LPS溶液 10 yL，終濃度為1 yg/mL，置于37 1：飽和濕度、含5% C02的恒溫箱中培養(yǎng)過夜。培養(yǎng) 過夜后，每空加入100 μ LBright-Glo? Luciferase Assay System底物，于酶標(biāo)儀讀板，讀 取RLU值。

【權(quán)利要求】
1. 一種具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其特征是：其活性成分由黨 參多糖和枸杞多糖復(fù)配而成，所述黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖ΚΓ250、 枸杞多糖5~ 90。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其特征 是：所述的黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖50~150、枸杞多糖2(Γ 80。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其特征 是：所述的黨參多糖和枸杞多糖的質(zhì)量份配比為黨參多糖50、枸杞多糖50。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其 特征是：所述的黨參多糖或枸杞多糖通過以下方法制備獲得：選取黨參或枸杞為原料，采 用沸水提取多次，合并提取液并濃縮得濃縮液al，將濃縮液al采用透析袋進(jìn)行透析得透析 液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2,在濃縮液a2中加入三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀 后離心，取上清液進(jìn)行中和、透析處理得透析液b2,將透析液b2濃縮得濃縮液a3,在濃縮液 a3中加入乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，所得沉淀物經(jīng)干燥處理即得黨參多糖或枸杞多糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其特征 是：采用沸水提取時，共提取Γ5次，每次提取時沸水的用量為黨參或枸杞原料總質(zhì)量的 1(Γ20倍，每次提取時間為4?5h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其特征 是：所述三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的體積百分含量為15?35%，其用量與濃縮液a2的體積 相同，進(jìn)行蛋白沉淀時間為:T4h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖，其特征 是：所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為7(Γ95%，乙醇水溶液的用量為濃縮液a3總體 積的2~4倍。
8. 權(quán)利要求1、2或3所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖的制備方 法，其特征是包括以下步驟： (1) 選取黨參或枸杞原料，采用沸水提取多次，合并提取液并濃縮得濃縮液al ; (2) 將濃縮液al采用透析袋進(jìn)行透析得透析液bl，將透析液bl濃縮后得濃縮液a2 ; (3) 在濃縮液a2中加入三氯乙酸水溶液進(jìn)行蛋白沉淀后離心，取上清液進(jìn)行中和、透 析處理得透析液b2,將透析液b2濃縮得濃縮液a3 ; (4) 在濃縮液a3中加入乙醇水溶液進(jìn)行醇沉處理，所得沉淀物即為黨參多糖或枸杞多 糖； (5) 將黨參多糖和枸杞多糖按照上述計量比混勻，即制備獲得黨參和枸杞復(fù)合多糖。
9. 權(quán)利要求8所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖的制備方法，其 特征是：步驟（1)中采用沸水提取時，共提取Γ5次，每次提取時沸水的用量為黨參或枸杞 原料總質(zhì)量的ΚΓ20倍，每次提取時間為4?5h ;步驟（3)中所述三氯乙酸水溶液中三氯乙酸 的體積百分含量為15~35%，其用量與濃縮液a2的體積相同，進(jìn)行蛋白沉淀時間為:T4h ;步 驟（4)中所述乙醇水溶液中乙醇的體積百分含量為7(Γ95%，乙醇水溶液的用量為濃縮液a3 總體積的2~4倍。
10. 權(quán)利要求1、2或3所述的具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的黨參和枸杞復(fù)合多糖在制備 具有調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境功效的保健食品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A23L1/09GK104119575SQ201410273710
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】馬方勵, 胡明華, 王培培, 梁明 申請人:無限極（中國）有限公司