以沙門氏菌菌毛為載體的hiv-1 10e8表位疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以沙門氏菌菌毛為載體的HIV-1?10E8表位疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。屬于生物制藥領(lǐng)域，本發(fā)明采用沙門氏菌(S.typhimurium)的細(xì)聚合菌毛(thin?aggregative?fimbriae)為載體構(gòu)建表達(dá)HIV-1?10E8表位的疫苗，利用沙門氏菌攜帶菌毛的特點(diǎn)，顯著提高10E8表位蛋白的表達(dá)數(shù)量，解決HIV-1?10E8中和表位免疫原性差問題，同時(shí)提高了其表位的免疫原性并刺激機(jī)體使之產(chǎn)生針對(duì)HIV-1?10E8表位的中和抗體和特異性T細(xì)胞。因此本發(fā)明的一種以沙門氏菌菌毛為載體的HIV-1?10E8表位疫苗能夠做為HIV候選疫苗，達(dá)到預(yù)防HIV感染的目的。
【專利說明】以沙門氏菌菌毛為載體的HIV-1 10E8表位疫苗及其構(gòu)建 方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種表位疫苗，特別涉及用減毒Salmonella typhimurium ST14028_3b菌株的細(xì)聚合菌毛（thin aggregative fimbriae)為載體構(gòu)建表達(dá)HIV-1 10E8 表位的疫苗。本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，

【背景技術(shù)】
[0002] HIV-1感染機(jī)體后能夠刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此學(xué)術(shù)界普遍 認(rèn)為，有效預(yù)防HIV-1感染的疫苗必須同時(shí)具備誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒特異性的體液免疫和細(xì) 胞免疫的雙重能力。而事實(shí)上，雖然HIV疫苗的研究由來已久，但隨著研究的深入，人們發(fā) 現(xiàn)要研制具備上述特性的理想疫苗還面臨著許多困難（5111；[1：111^.1116!11￥￥300；[116 8383· Med Immunol. 2003 ;2 (1):1.):其中最關(guān)鍵的問題是HIV病毒變異性高。HIV基因變異速度 快，在病毒感染過程中抗體中和表位和CTL表位的變異使病毒快速逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān) 視，導(dǎo)致疫苗的效力降低，所以如何在快速變異的病毒分子中篩選出能夠誘導(dǎo)廣泛中和抗 體的保守性抗原是開發(fā)疫苗的關(guān)鍵。為解決這個(gè)問題，近年來以保守的包膜主要中和表位 (principle neutralizingdeterminants，PND)為基礎(chǔ)的表位疫苗應(yīng)運(yùn)而生。研究結(jié)果表 明，表位多肽疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)不同HIV-1毒株的廣譜中和抗體，是一種很有前 途的疫苗形式。由于大多中和表位僅由幾個(gè)或幾十個(gè)氨基酸組成，免疫原性較差，因此如何 提高表位的免疫原性并能誘導(dǎo)能夠中和多個(gè)HIV-1分離株抗體反應(yīng)的表位疫苗是目前研 究的重點(diǎn)。
[0003] HIV-ι保守的廣譜中和表位主要集中在跨膜蛋白gp41的近膜端胞外區(qū)（MPER)， MPER主要含有3個(gè)構(gòu)象依賴性抗原決定簇（aa579-604, aa619-648, aa644-663)，含有2F5、 4E10和Z13三個(gè)具有廣譜中和活性的抗原表位。雖然從病人體內(nèi)分離出的抗體可以中和 高度多樣化的HIV-1分離株，但研究表明以這3個(gè)表位研制的疫苗卻很難誘生出具有廣譜 中和活性的中和抗體（BNabs)反應(yīng)。2012年Huang等發(fā)現(xiàn)了一個(gè)HIV-1 gp41近膜端胞 外區(qū)（MPER)特異性抗體，命名為10E8,該抗體可中和?98 %的實(shí)驗(yàn)病毒（Huang J，0fek G, Laub L, et al. Broad and potent neutralization of HIV-1 by a gp41_specific human antibody[J]. Nature，2012)。10E8是目前報(bào)道的最廣譜、最強(qiáng)的中和抗體之一。與以往 MPER抗體相比，10E8更易接近原代病毒Env的MPER區(qū)。以往MPER抗體的脂質(zhì)結(jié)合性和自 身反應(yīng)性是其顯著特征，也是疫苗誘導(dǎo)此類抗體的重要阻礙。然而，10E8缺乏這些特征。另 夕卜，文章報(bào)道的慢性感染隊(duì)列中，具有相似特異性的抗體并不罕見。這表明10E8樣抗體并 沒有通過自身反應(yīng)性篩選而從抗體系統(tǒng)中被刪除。這些結(jié)果進(jìn)一步提示，如果設(shè)計(jì)疫苗誘 生這些抗體，接種未感染HIV的人群后可能在大多數(shù)人體中產(chǎn)生10E8樣抗體。所以10E8 表位可能是HIV表位疫苗不可或缺的表位之一。但對(duì)于表位疫苗而言可能不僅需要天然 10E8表位的呈遞，還需要運(yùn)用一個(gè)載體平臺(tái)，使其具有足夠的免疫原性去引導(dǎo)10E8樣抗體 進(jìn)化。
[0004] 性傳播是HIV-ι主要的傳染方式，通過泌尿道、生殖道和肛腸粘膜，突破粘膜的解 剖學(xué)、生物學(xué)和免疫學(xué)屏障，是HIV感染的先決條件。所以粘膜免疫是預(yù)防HIV傳播的重要 手段。對(duì)于HIV表位疫苗來說，人們期望構(gòu)建一種疫苗載體既能提高表位的免疫原性并能 通過粘膜途徑有效地將HIV抗原表位遞呈給機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生局部粘膜的IgA和 CTLs的反應(yīng)，以及全身的特異性CTLs及IgG、IgM的反應(yīng)。而減毒沙門氏菌就是這樣一個(gè) 理想的遞呈外源抗原的粘膜載體的候選者。這是因?yàn)樯抽T氏菌是具有高度侵襲性的細(xì)胞內(nèi) 寄生菌，在感染人體后不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的局部粘膜免疫反應(yīng)，而且由于其細(xì)胞 內(nèi)寄生的特性，沙門氏菌能誘導(dǎo)機(jī)體形成較廣泛的全身免疫反應(yīng),包括血清抗體、粘膜IgA 抗體以及不同類型的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。攜帶外源抗原的沙門氏菌可直接接觸腸道局部粘 膜，并由此侵入腸粘膜上皮細(xì)胞。開始，沙門氏菌可滯留在內(nèi)噬小體內(nèi)，但其質(zhì)粒所攜帶的 抗原可經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制釋放出來，被抗原提呈細(xì)胞加工后，傳遞給免疫活性細(xì)胞，從而誘導(dǎo) 體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)一一這是迄今沙門氏菌用作疫苗載體在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫的一般過程，其 中很多情況下沙門氏菌是用來攜帶載有抗原表位的質(zhì)粒載體。然而在使用質(zhì)粒載體的過 程中存在著一個(gè)明顯問題，即表達(dá)質(zhì)粒在體內(nèi)的不穩(wěn)定性，這是因?yàn)橹亟M質(zhì)粒往往帶有抗 生素耐藥基因，在人體內(nèi)缺乏抗生素壓力的情況下，質(zhì)粒易丟失。也有研究者把抗原表位基 因整合到染色體上，然而外源基因的表達(dá)通常水平低下，難以產(chǎn)生足夠的重組蛋白以激發(fā) 機(jī)體的免疫反應(yīng)。為了避免上述2個(gè)主要問題，確保HIV抗原表位在沙門氏菌染色體上高 水平表達(dá)，本發(fā)明通過基因置換技術(shù)（U. S.patent6864365)在沙門氏菌菌毛的基因中插入 HIV-1 10E8抗原表位。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠高效表達(dá)HIV-1 10E8中和表位的， 以沙門氏菌為載體的表位疫苗。
[0006] 為了增強(qiáng)沙門氏菌攜帶外源蛋白的數(shù)量本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段來高效表達(dá) HIV-1 10E8中和表位：
[0007] 以沙門氏菌細(xì)聚合菌毛AgfA為載體表達(dá)10E8中和表位。通過基因置換技術(shù)將 10E8中和表位置換到沙門氏菌的聚合菌毛AgfA上。菌毛AgfA具有以下特點(diǎn)：1)高水平表 達(dá)并且位于細(xì)菌的表面。沙門氏菌的細(xì)聚合菌毛是細(xì)菌表面毛發(fā)狀蛋白附屬物，一般不參 與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)而有可能與細(xì)菌的黏附有關(guān)。細(xì)聚合菌毛的表達(dá)量非常高，每個(gè)細(xì)菌大約有 100?1000條，每條細(xì)聚合菌毛至少由1000個(gè)相同的菌毛亞單位呈螺旋狀排列聚合而成。 因此如果以細(xì)聚合菌毛為載體表達(dá)外源多肽則其表達(dá)量將非常強(qiáng)大。2)很大的容納性。本 發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明AgfA的最大容量可達(dá)25個(gè)氨基酸?，F(xiàn)在的中和表位一般都不會(huì)超過25 個(gè)氨基酸，恰好位于AgfA的容納范圍內(nèi)，因此AgfA應(yīng)該是其一個(gè)理想的載體。3)可起到佐 劑的作用。以此為載體表達(dá)的表位將能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)有力的免疫反應(yīng)。
[0008] 本發(fā)明所利用的抗原表位插入載體細(xì)聚合菌毛（Thin aggregative fimbriae) 和細(xì)菌的抗原性及黏附性有關(guān)，直徑3-4nm，為周身菌毛（500根/細(xì)胞），其單體 蛋白（fimbrin)攜帶的外源表位拷貝數(shù)可達(dá)500, 000/細(xì)胞，適宜作為活疫苗。該 細(xì)聚合菌毛結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不溶于511似0!1、81尿素或2%十二烷基磺酸鈉（303)，其單 體蛋白僅在90 %甲酸溶液中發(fā)生解聚（Collinson S. K.，et al. Purification and characterization of thin, aggregative fimbriae from Salmonella enteritidis. J. Bacteriol. 1991，173, 4773-4781.)。AgfA蛋白是細(xì)聚合菌毛的一種主要的單體蛋 白，在沙門氏菌中結(jié)構(gòu)保守（R〇mling，U.，et al. Curli fibers are highly conserved between Salmonella typhimurium and Escherichia coli with respect to operon structure and regulation. Journal of Bacteriologyl998，）。該蛋白抗原性強(qiáng)，對(duì)于 檢測插入其中的外源表位是十分重要的，此外重組菌毛的制備和純化方法簡單、成本較低 (Pallesen, L. &Klemm, P. (1994). Chimeric fimbrial vaccines. In Fimbriae adhesion, gen etics, biogenesis, and vaccines(Klemm, P. , ed. ), pp. 271-276. CRC Press, Boca Raton. )〇 AgfA蛋白C末端含有一個(gè)蛋白酶抗性結(jié)構(gòu)域，由五個(gè)β -鏈，結(jié)構(gòu)類似（Sx5QxGx2NxAx3Q) 的五個(gè)重復(fù)片斷組成，可以插入外源表位片段。
[0009] 本發(fā)明的一種以沙門氏菌菌毛為載體的HIV-1 10E8表位疫苗，其特征在于：以沙 門氏菌（s. typhimurium)的細(xì)聚合菌毛作為疫苗的活載體，使艾滋病病毒的抗原表位10E8 表達(dá)在沙門氏菌（S. typhimurium)的細(xì)聚合菌毛上，其中所述的艾滋病病毒的抗原表位 10E8的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示（由SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列編碼）。
[0010] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的沙門氏菌（S. typhimurium)為aroA營養(yǎng)缺陷型沙門 氏國。
[0011] 更優(yōu)選的，所述的沙門氏菌為減毒沙門氏菌菌株ST14028-3b，購自SALMONELLA GENETIC STOCK CENTRE(SGSC, www. ucalgary. ca/ ?kesander/) 〇
[0012] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，是將艾滋病病毒的抗原表位10E8的序列置換到沙門氏菌 (S. typhimurium)細(xì)聚合性菌毛的染色體agfA基因之中。
[0013] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建以上任一項(xiàng)所述表位疫苗的方法，其特征在 于包括以下步驟：
[0014] 1)提取沙門氏菌的基因組DNA ;
[0015] 2)通過兩步重疊 PCR法擴(kuò)增得到嵌合有HIV-1 10E8抗原表位的沙門氏菌的聚合 性菌毛agfA的目的基因片段agfA: : 10E8 ;
[0016] 3)將目的基因片段agfA: : 10E8與溫度敏感型質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接，得到重組質(zhì)粒， 重組質(zhì)粒經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)入沙門氏菌（S. typhimurium)中；
[0017] 4)進(jìn)行同源重組，使目的基因片段agfA: :10E8置換至沙門氏菌（S. typhimurium) 的染色體中，即得。
[0018] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟1)中兩步重疊 PCR法擴(kuò)增所用的引物包括兩個(gè)外部引 物agfAfor和agfArev以及兩個(gè)內(nèi)部引物10E8for和10E8rev，其核苷酸序列分別如下所 示：
[0019] agfAfor ：GCAGAATTCAGCAGTTGTAGTGCAGAAACAGTCGCATAT
[0020] 10E8rev ：ACCGGATTTTATATACCACAGCCAGTTTGTTATGTCAAACCAATTGGATCCATTATCCGCA CCCTGGCCTACATCG
[0021] 10E8for ：GGATCCAATTGGTTTGACATAACAAACTGGCTGTGGTATATAAAATCCGGTGACCAGTGGA ACGCTAAAAACTCCGAT
[0022] agfArev ：AGACGCAAGCTTCGTTTAATGTGACCTGAGGGATCACC
[0023] 擴(kuò)增步驟包括：先分別以agfAfor和10E8rev，10E8for和agfArev為引物，以沙門 氏菌的基因組為模板第一輪擴(kuò)增得到兩個(gè)目的片段A和B，然后以A和B為模板，agfAfor 和agfArev為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增得到嵌合有HIV-1 10E8抗原表位的沙門氏菌的聚合性 菌毛agfA的目的基因片段agfA: : 10E8。
[0024] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的沙門氏菌為減毒沙門氏菌菌株ST14028_3b。
[0025] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（3)中所述的溫度敏感性質(zhì)粒是PHSG415。
[0026] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（4)包括以下步驟：
[0027] 1)取含有重組質(zhì)粒的單克隆菌落接種于5ml含Ampl00ug/ml TB培養(yǎng)基，42°C， 200rpm,12h ；
[0028] 2)從步驟1)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨芐100ug/ml TB培養(yǎng)基中，42°C 水浴，200rpm，12h ;
[0029] 3)從步驟2)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨芐100ug/ml TB培養(yǎng)基中，42°C 水浴，200rpm，12h ;
[0030] 4)從步驟3)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨芐100ug/ml TB培養(yǎng)基中，42°C 水浴，200rpm，12h ;
[0031] 5)從步驟4)得到的菌液中取菌液三道劃線于氨芐板，42°C溫箱，過夜培養(yǎng)；
[0032] 6)氨芐板上挑取4-8個(gè)陽性菌落，接種于新鮮的5mlTB培養(yǎng)基中，28°C 200rpm， 12h ；
[0033] 7)從步驟6)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培養(yǎng)基中，28°C水浴，200rpm， 12h ；
[0034] 8)從步驟7)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培養(yǎng)基中，28°C水浴，200rpm， 12h ；
[0035] 9)從步驟8)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培養(yǎng)基中，28°C水浴，200rpm， 12h ；
[0036] 10)步驟8)得到的菌液用生理鹽水稀釋6-8倍，取10_6,10_7,10_ 8菌液各lOOul均 勻涂于板LB板，28°C溫箱，過夜培養(yǎng)；
[0037] 11)挑選單克隆，分別劃線于LB平板和含氨芐LB平板，28°C溫箱，過夜培養(yǎng)；
[0038] 12)篩選氨芐青霉素敏感的菌落；
[0039] 13)從氨芐青霉素敏感的菌落中利用PCR方法篩選同時(shí)含HIV-1 10E8抗原表位的 重組沙門氏菌株。
[0040] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了以上任一項(xiàng)所述的艾滋病活載體疫苗在制備預(yù)防或 治療HIV感染藥物中的應(yīng)用。
[0041] 本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于：
[0042] 1、HIV病毒通過能通過生殖道、腸道粘膜侵入機(jī)體，根據(jù)共同粘膜免疫理論，一處 粘膜免疫，可在多處粘膜產(chǎn)生免疫作用，此沙門氏菌載體免疫后能廣泛誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣泛 特異針對(duì)HIV-1 10E8中和表位的腸道、生殖道的粘膜抗體。
[0043] 2、沙門氏菌對(duì)巨噬細(xì)胞有特殊的親和性，因此以沙門氏菌為載體可直接特異性地 將HIV-1 10E8中和表位抗原蛋白運(yùn)送到免疫相關(guān)器官的APC細(xì)胞，這比傳統(tǒng)的免疫途徑的 抗原遞呈更加有效。
[0044] 3、高表達(dá)，菌株的菌毛攜帶HIV-1 10E8抗原表位，一個(gè)細(xì)菌大約有100?1000 條，每條細(xì)聚合菌毛至少有1000個(gè)相同的含Hiv-l 10E8抗原表位菌毛亞單位，HIV-110E8 抗原蛋白攜帶數(shù)量相當(dāng)強(qiáng)大。
[0045] 4、用其作為載體制備的載體菌生產(chǎn)過程簡單，較易儲(chǔ)存和運(yùn)輸，可口服，易于大規(guī) 模免疫接種，因此顯著減低了以后作為疫苗應(yīng)用平臺(tái)生產(chǎn)成本和周期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1為細(xì)聚合菌毛單體蛋白AgfA的結(jié)構(gòu)模式圖；
[0047] C5a_e為五個(gè)β -鏈，是結(jié)構(gòu)類似（Sx5QxGx2NxAx3Q)的五個(gè)重復(fù)片段，可以插入外 源表位片段；
[0048] 圖2為本發(fā)明目的表位基因 10E8抗原的克隆方案；
[0049] 圖3為本發(fā)明目的表位基因序列10E8抗原克隆的第一步擴(kuò)增結(jié)果；
[0050] 泳道 M :DL2000DNA Marker :由大到小為 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100 bp ;泳道1 :引物agfAfor和10E8rev的PCR產(chǎn)物；泳道2 :引物agfArev和10E8for的PCR 產(chǎn)物；
[0051] 圖4為本發(fā)明目的表位基因序列10E8抗原克隆的第二步擴(kuò)增結(jié)果；
[0052] 泳道 M :DL2000DNA Marker :由大到小為 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100 bp ;泳道 2、3 :引物 agfAfor 和 agfArev 的 PCR 產(chǎn)物；
[0053] 圖5為本發(fā)明目的表位基因序列10E8連接到質(zhì)粒PHSG415上酶切鑒定結(jié)果；
[0054] 泳道1、2 :PHSG415質(zhì)粒對(duì)照；泳道2、6 :陽性結(jié)果，用EcoRI和Hindlll雙酶切后 電泳，可見兩條帶，737bp的插入片段和5322bp的載體片段；泳道M :DL2000DNA Marker :由 大到小為 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp ;
[0055] 圖6為將2、6泳道PHSG415-10E8質(zhì)粒送去測序后測序鑒定結(jié)果；
[0056] 圖7為用LB平板篩選氨芐青霉素敏感的菌落結(jié)果；
[0057] 左側(cè)為不含氨芐青霉素 LB平板，右側(cè)為含氨芐青霉素 LB平板；
[0058] 圖8為同源重組后氨芐青霉素敏感的菌agfa基因測序結(jié)果；
[0059] 測序結(jié)果表明菌毛基因 agfa中上置換上了 10E8表位；
[0060] 圖9為Western blotting檢測含10E8表位菌毛表達(dá)情況；
[0061] 可見在20100- 14400D之間突變株10E8有明顯的條帶，表明了菌毛的表達(dá)（約 17KD)；
[0062] 圖10為Dot-ELISA檢測含10E8表位菌毛表達(dá)情況，證實(shí)了 Western blotting的 結(jié)果；
[0063] 圖11為感染后第3天重組菌在各臟器分布；
[0064] 圖12為小鼠免疫血清10E8表位特異性抗體檢測結(jié)果，結(jié)果表明小鼠免疫血清 10E8表位特異結(jié)合性抗體約為1:10 2 5 ;W55為含有其他HIV表位的沙門氏菌免疫檢測結(jié) 果；
[0065] 圖13為10E8表位小鼠免疫血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果；
[0066] 圖14為pHSG415質(zhì)粒圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0067] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0068] 實(shí)施例1以沙門氏菌菌毛為載體的HIV-1 10E8表位疫苗的構(gòu)建
[0069] 1、通過兩步重疊 PCR法擴(kuò)增出在細(xì)聚合性菌毛基因 agfA上嵌合有10E8抗原抗原 表位的基因片段
[0070] 菌株和質(zhì)粒：ST14028-3b 和突變株 ST14028-3b Λ AgfA 來自 SALMONELLA GENETIC STOCK CENTRE(SGSC,www. ucalgary. ca/ ?kesander/) 〇 PHSG415 為溫度敏感低拷貝質(zhì)粒。 大腸桿菌DH5a本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0071] 工具酶和主要試劑：內(nèi)切酶EcoRI和Hindlll、高保真DNA聚合酶、購自大連寶生 物工程公司，T4連接酶購自NEB公司，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量純化試劑盒購自全式 金公司。
[0072] PCR :利用兩步重疊 PCR 的方法（Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen JK, Pease LR:Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Genel989;77:61_68·)，根據(jù)編碼細(xì)聚合菌毛基因 agfA 和外源基因10E8的序列設(shè)計(jì)引物各四條，其中包括兩個(gè)外部引物agfAfor (含有EcoRI酶 切位點(diǎn)）和agfArev (含有HindllI酶切位點(diǎn)）以及兩個(gè)內(nèi)部引物10E8for和10E8rev (含有 外源基因 10E8)。先分別以 agfAfor 和 10E8rev，10E8for 和 agfArev 為引物，以 ST14028-3b 基因組為模板第一輪擴(kuò)增得到兩個(gè)目的片段A和B，然后以A和B為模板，agfAfor和 agfArev為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增得到含有外源基因10E8的嵌合agfA片段agfA: : 10E8 (圖 1，2)。引物序列見表1。
[0073] 表 1
[0074] 引物 序列（5'-3'） agfAfor GCAGAATTCAGCAGTTGTAGTGCAGAAAC-AGTCGCATAT 10E8rev ACCGGATTTTATATACCACAGCCAGTTTGTTATGTCAAACCAAT TGGATCCATTATCCOCACCCTCGCCTACATCG 】0E8for iGGATCCiAATTGGTTTGACATAACAAACTGGCTGTGGTATATAAA ATCC-GGTGACCAGTGGAACGCTAAAAACTC-CGAT agfArev AGACGCAAGCTTCGTTTAATGTGACCTGAGGGATCACC_
[0075] 1)模板的制備：從_80°C冰箱中取出菌株ST14028-3b立即放入-20°C，取3ml LB 液體培養(yǎng)基于l〇ml的試管中，取接菌環(huán)在酒精燈上滅菌，從_20°C取出菌株挑取接種到LB 培養(yǎng)基中，放入水浴搖床培養(yǎng)，37°C，150rpm，過夜培養(yǎng)。取3ml的活化菌液6500rpm離心 10min，加入100ul的高壓過的去離子水，放入水浴鍋（90°C )煮沸30min，變性，12000rpm離 心10min，取上清做模板，之后存于-20°C備用。
[0076] 2)第一輪PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)
[0077] 反應(yīng)體系：
[0078]

【權(quán)利要求】
1. 以沙門氏菌菌毛為載體的Hiv-l 10E8表位疫苗，其特征在于：以沙門氏菌 (S. typhimurium)的細(xì)聚合菌毛作為疫苗的活載體，使艾滋病病毒的抗原表位10E8表達(dá)在 沙門氏菌（S. typhimurium)的細(xì)聚合菌毛上，其中所述的艾滋病病毒的抗原表位10E8的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 按照權(quán)利要求1所述的表位疫苗，其特征在于：所述的沙門氏菌（S. typhimurium) 為aroA營養(yǎng)缺陷型沙門氏菌。
3. 按照權(quán)利要求1所述的表位疫苗，其特征在于：所述的沙門氏菌為減毒沙門氏菌菌 株 ST14028-3b。
4. 按照權(quán)利要求6所述的表位疫苗，其特征在于：將艾滋病病毒的抗原表位10E8的序 列置換到沙門氏菌（S. typhimurium)細(xì)聚合性菌毛的染色體agfA基因之中。
5. -種構(gòu)建權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述表位疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 提取沙門氏菌的基因組DNA ; 2) 通過兩步重疊 PCR法擴(kuò)增得到嵌合有HIV-1 10E8抗原表位的沙門氏菌的聚合性菌 毛agfA的目的基因片段agfA: : 10E8 ; 3) 將目的基因片段agfA: : 10E8與溫度敏感型質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接，得到重組質(zhì)粒，重組 質(zhì)粒經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)入沙門氏菌（S. typhimurium)中； 4) 進(jìn)行同源重組，使目的基因片段agfA: :10E8置換至沙門氏菌（S. typhimurium)的染 色體中，即得。
6. 按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟1)中兩步重疊 PCR法擴(kuò)增所用的引物 包括兩個(gè)外部引物agfAfor和agfArev以及兩個(gè)內(nèi)部引物10E8for和10E8rev，其核苷酸序 列分別如下所示： agfAfor ： GCAGAATTCAGCAGTTGTAGTGCAGAAACAGTCGCATAT 10E8rev ：ACCGGATTTTATATACCACAGCCAGTTTGTTATGTCAAACCAATTGGATCCATTATCCGCACCCT GGCCTACATCG 10E8for ：GGATCCAATTGGTTTGACATAACAAACTGGCTGTGGTATATAAAATCCGGTGACCAGTGGAACGC TAAAAACTCCGAT agfArev ：AGACGCAAGCTTCGTTTAATGTGACCTGAGGGATCACC 擴(kuò)增步驟包括：先分別以agfAfor和10E8rev，10E8for和agfArev為引物，以沙門氏 菌的基因組為模板第一輪擴(kuò)增得到兩個(gè)目的片段A和B，然后以A和B為模板，agfAfor和 agfArev為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增得到嵌合有HIV-1 10E8抗原表位的沙門氏菌的聚合性菌 毛agfA的目的基因片段agfA: : 10E8。
7. 按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述的沙門氏菌為減毒沙門氏菌菌株 ST14028-3b〇
8. 按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：步驟（3)中所述的溫度敏感性質(zhì)粒是 PHSG415。
9. 按照權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于步驟（4)包括以下步驟： 1) 取含有重組質(zhì)粒的單克隆菌落接種于5ml含AmplOOug/ml TB培養(yǎng)基，42°C，200rpm， 12h ； 2) 從步驟1)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨芐100ug/ml TB培養(yǎng)基中，42°C水 浴，200rpm，12h ; 3) 從步驟2)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨芐lOOug/ml TB培養(yǎng)基中，42°C水 浴，200rpm，12h ; 4) 從步驟3)得到的菌液中取5ul菌液于5ml含氨芐100ug/ml TB培養(yǎng)基中，42°C水 浴，200rpm，12h ; 5) 從步驟4)得到的菌液中取菌液三道劃線于氨芐板，42°C溫箱，過夜培養(yǎng)； 6) 氨芐板上挑取4-8個(gè)陽性菌落，接種于新鮮的5mlTB培養(yǎng)基中，28°C 200rpm，12h ; 7) 從步驟6)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培養(yǎng)基中，28°C水浴，200rpm，12h ; 8) 從步驟7)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培養(yǎng)基中，28°C水浴，200rpm，12h ; 9) 從步驟8)得到的菌液中取5ul菌液于5ml的TB培養(yǎng)基中，28°C水浴，200rpm，12h ; 10) 步驟8)得到的菌液用生理鹽水稀釋6-8倍，取10_6,10_7,10_8菌液各lOOul均勻涂 于板LB板，28 °C溫箱，過夜培養(yǎng)； 11) 挑選單克隆，分別劃線于LB平板和含氨芐LB平板，28°C溫箱，過夜培養(yǎng)； 12) 篩選氨芐青霉素敏感的菌落； 13) 從氨芐青霉素敏感的菌落中利用PCR方法篩選同時(shí)含HIV-1 10E8抗原表位的重組 沙門氏菌株。
10.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的表位疫苗在制備預(yù)防或治療HIV感染藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/42GK104087545SQ201410305185
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】劉樹林, 李慶海, 金剛, 王福祥, 岳超 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)