一種重組trail蛋白及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種核酸片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明公開了前述核酸片段編碼的重組蛋白及其制備方法和用途。本發(fā)明還公開PEG修飾重組蛋白的結(jié)合物及其制備方法和用途。本發(fā)明重組蛋白的抗腫瘤效果明顯，與蛋白酶體抑制劑聯(lián)合使用更可以發(fā)揮協(xié)同增效租用，經(jīng)PEG修飾后，在保留抗腫瘤藥效果的同時，穩(wěn)定性提高，半衰期延長，應(yīng)用前景良好。
【專利說明】-種重組TRAIL蛋白及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組TRAIL蛋白及其制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNFrelatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又稱凋亡素2配體，是近幾年發(fā)現(xiàn)的可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的TNF家族成員， 其通過與不同受體的結(jié)合，發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用。TRAIL的膜受體共有四類， 包括DR4、DR5、DcRl和DcR2,其中，DR4和DR5是死亡受體（deathrec印tor)，高表達于腫 瘤細(xì)胞，其分子內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域，當(dāng)TRAIL與其結(jié)合后，會通過其死亡結(jié)構(gòu)域傳遞信號而 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；DcRl和DcR2為誘騙受體（decoyreceptor)，高表達于正常細(xì)胞，其同樣具 有結(jié)合TRAIL的能力，但分子內(nèi)不含死亡結(jié)構(gòu)域，TRAIL與其結(jié)合后不能夠向胞內(nèi)傳遞死亡 信號而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，TRAIL具有對腫瘤的選擇性殺傷作用，是一種優(yōu)良的抗腫瘤藥 物。
[0003] 目前，已有關(guān)于重組TRAIL的研究，但是它們存在不穩(wěn)定、半衰期短的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的的重組恒河猴TRAIL蛋白（mmTRAIL) 及其PEG修飾結(jié)合物。
[0005] 本發(fā)明核酸片段，其核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0006] 本發(fā)明重組載體，它包含核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示的核酸片段。優(yōu)選地，所 述的重組載體是重組PQE30質(zhì)粒。
[0007] 本發(fā)明重組菌，它包含前述重組載體。優(yōu)選地，所述的重組菌為重組大腸桿菌。
[0008] 本發(fā)明蛋白質(zhì)，它由核苷酸序列如SEQIDN0 :1所示核酸片段編碼。
[0009] 其中，其氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示。
[0010] 本發(fā)明種制備前述蛋白質(zhì)的方法，其特征在于：包含如下步驟：
[0011] i、取前述的重組菌，接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液〇D_ = 0. 1?1 ;
[0012] ii、加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)6?20h，離心，收集菌體，裂解，收集上清，分離純化，即 可。
[0013] 步驟i中，所述培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；培養(yǎng)的溫度為37°C;接種后，培養(yǎng)至菌液0D_ =0? 5〇
[0014] 步驟ii中，所述誘導(dǎo)劑為0. 05?0. 15mMIPTG以及100?300iiM的ZnS04 ;所述誘 導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為28°C。優(yōu)選地，步驟ii中，所述誘導(dǎo)劑為0.ImMIPTG以及200iiM的ZnS04。
[0015]步驟ii中，所述分離純化采用凝膠層析，其中，洗滌液是含有300mMNaCl、和40mM 咪唑的溶液，洗脫液是含有300mMNaCl和300mM咪唑的溶液。
[0016] 本發(fā)明提供了前述的蛋白質(zhì)在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
[0017] 其中，所述治療腫瘤的藥物是治療結(jié)腸癌、腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌或肺癌的藥 物。
[0018] 本發(fā)明還提供了前述的蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑在制備治療腫瘤的聯(lián)合用藥物 中的用途。
[0019] 其中，所述蛋白酶體抑制劑是Bortezomib。
[0020] 蛋白酶體（proteasomes)是在真核生物和古菌中普遍存在的，在一些原核生物中 也存在的一種巨型蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要作用是降解細(xì)胞不需要的或受到損傷的蛋白質(zhì)，而 蛋白酶體抑制劑即與蛋白酶體結(jié)合使其失去活性的物質(zhì)。
[0021] Bortezomib是一種蛋白酶體抑制劑。
[0022] 所述蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑的摩爾比為：蛋白質(zhì)0. 1?100份，蛋白酶體抑制劑 5?50份。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑的摩爾比為：蛋白質(zhì)0. 5?100份，蛋白 酶體抑制劑25?50份。
[0023] 本發(fā)明聯(lián)合用藥物，它包含不同規(guī)格的單位制劑，用于同時、分別或者依次給前述 的蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0024] 其中，所述蛋白酶體抑制劑是Bortezomib。
[0025] 其中，所述蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑的摩爾比為：蛋白質(zhì)0. 1?100份，蛋白酶體 抑制劑5?50份。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑的摩爾比為：蛋白質(zhì)0.5?100 份，蛋白酶體抑制劑25?50份。
[0026] 一種蛋白聚乙二醇結(jié)合物，它由聚乙二醇對前述蛋白進行單點修飾得到，其中，每 個蛋白分子上共價結(jié)合一個聚乙二醇分子，聚乙二醇分子的分子量為5000?20000Da。
[0027] 所述聚乙二醇為mPEG-丁醛。
[0028] 所述聚乙二醇分子的分子量為10000?20000Da。
[0029] -種制備前述蛋白聚乙二醇結(jié)合物的方法，其特征在于：包括如下步驟：
[0030] 1)取前述蛋白，制成濃度為1?10mg/ml的蛋白溶液，透析于包含50mMNaAc_HAc、 30% (v/v)甘油和40iiM硫酸鋅的醋酸鹽緩沖液中，所述緩沖液的pH為5.0,透析過夜后加 入2M硼氫化鈉溶液至終濃度為20mM;
[0031] 2)加入聚乙二醇，所述聚乙二醇的量為蛋白摩爾量的1?10倍，反應(yīng)6?18h，反 應(yīng)溫度為2?10°C;
[0032] 3)分離純化，即可。
[0033] 步驟（1)中，所述蛋白溶液的濃度為5. 5mg/ml。
[0034] 步驟⑵中，所述聚乙二醇為mPEG-丁醛；所述蛋白與聚乙二醇摩爾比為1:5 ;所 述反應(yīng)的時間為12h，反應(yīng)溫度為4°C。
[0035] 步驟（3)中，采用陽離子交換柱分離純化。
[0036] 本發(fā)明還提供了前述蛋白聚乙二醇結(jié)合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。其 中，所述治療腫瘤的藥物是治療結(jié)腸癌、腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌或肺癌的藥物。
[0037] 本發(fā)明重組蛋白抗腫瘤效果明顯，其與蛋白酶體抑制劑聯(lián)合使用可以發(fā)揮協(xié)同增 效的作用，治療腫瘤的效果優(yōu)良，同時，其經(jīng)PEG修飾得到單點修飾的PEG結(jié)合物，抗腫瘤活 性高，穩(wěn)定性強，體內(nèi)半衰期長，既能方便使用，降低使用成本，也提高了使用安全性，具有 極好的市場前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖ImmTRAIL基因擴增。（M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1:mmTRAILPCR產(chǎn)物）
[0039] 圖2pQE30-mmTRAIL質(zhì)粒的雙酶切鑒定。（M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :質(zhì)粒酶切產(chǎn)物）
[0040] 圖3mmTRAIL在大腸桿菌M15中的誘導(dǎo)表達及純化。
[0041] (M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :誘導(dǎo)前細(xì)菌總蛋白；2 :誘導(dǎo)后細(xì)菌總蛋白；3 :破菌上清 蛋白；4 :破菌沉淀蛋白；5 :純化后蛋白；6:Westernblot。
[0042] 圖4mmTRAIL蛋白凝膠過濾層析
[0043] 圖5mmTRAIL對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的殺傷作用比較
[0044] 圖6mmTRAIL與Bortizomib對腫瘤細(xì)胞殺傷的協(xié)同作用
[0045] 圖7AnnexinV/PI檢測細(xì)胞細(xì)胞凋亡（圖中數(shù)字為陽性細(xì)胞百分率）
[0046] 圖8Caspase抑制劑對mmTRAIL和hTRAIL殺傷活性的抑制
[0047] 圖9mmTRAIL瘤內(nèi)注射抗腫瘤效果
[0048] 圖10靜脈注射和腹腔注射mmTRAIL的抗腫瘤效果比較
[0049] 圖11不同劑量mmTRAIL抗腫瘤效果比較
[0050] 圖12SDS-PAGE⑷和HPLC⑶分析不同PEG修飾mmTRAIL的分子量
[0051] 圖13PEG修飾對mmTRAIL活性和穩(wěn)定性的影響
[0052] 圖14PEG修飾對mmTRAIL藥代動力學(xué)的影響
[0053] 圖15不同PEG修飾mmTRAIL抗腫瘤效果比較
[0054] 圖16mmTRAIL-10K抗腫瘤作用的劑量依賴性

【具體實施方式】
[0055] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0056] 實施例ImmTRAIL蛋白編碼基因的克隆
[0057] 1)恒河猴RNA的提取
[0058] 抽取健康恒河猴靜脈血，加入裝有適量密度梯度分離液的離心管中，室溫400g離 心30min。將外周血單個核細(xì)胞收集于新離心管中，再加入0. 83%NH4C1，室溫靜置5min，去 除殘留的紅細(xì)胞。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（50mM，pH7. 4)洗滌兩次，懸浮于含有100U/ml青霉 素，100mg/ml鏈霉素，10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，使其細(xì)胞密度為106個/毫升。向細(xì)胞 中加入5iig/ml的ConA刺激培養(yǎng)2天。收集細(xì)胞，向107個細(xì)胞中加入1?2ml的RNAiso Plus裂解液。待細(xì)胞充分裂解后，12,000g4°C離心5min，棄沉淀。上清中加入RNAisoPlus 液1/5體積的氯仿，劇烈振蕩15秒。待溶液充分乳化后，室溫靜置5分鐘，12, 000g4°C離 心15分鐘。上清中再加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，12,000g4°C離心 l〇min，收集沉淀并用lml75%乙醇洗滌。12, 000g4°C離心5min收集沉淀，室溫干燥2?5 分鐘，再加入適量RNase-free水溶解，S卩獲得總RNA。
[0059] 2)RT-PCR擴增
[0060] 以總RNA為模板，用Promega公司提供的PrimeScriptIllstStrandcDNA SynthesisKit合成cDNA。用VectorNTISuite6 軟件根據(jù)Genbank提供的mmTRAIL基因 序列（XM_001084768)設(shè)計引物。為方便將基因克隆入表達載體pQE30,引物中添加相應(yīng)酶 切位點。
[0061] 上游引物序列為：
[0062]

【權(quán)利要求】
1. 一種核酸片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -種重組載體，其特征在于：它包含權(quán)利要求1所述的核酸片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于：所述的重組載體是重組pQE30質(zhì)粒。
4. 一種重組菌，其特征在于：它包含權(quán)利要求2或者3所述的重組載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于：所述的重組菌為重組大腸桿菌。
6. -種蛋白質(zhì)，其特征在于：它由權(quán)利要求1所述的核酸片段編碼。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
8. -種制備權(quán)利要求6或者7所述蛋白質(zhì)的方法，其特征在于：包含如下步驟： i、 取權(quán)利要求4或者5所述的重組菌，接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)至菌液0D_ = 0. 1?1 ; ii、 加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)6?20h，離心，收集菌體，裂解，收集上清，分離純化，即可。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：步驟i中，所述培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；培養(yǎng) 的溫度為37°C ;接種后，培養(yǎng)至菌液0D_ = 0. 5。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：步驟ii中，所述誘導(dǎo)劑為0. 05?0. 15mM IPTG以及100?300 ii M的ZnS04 ;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為28°C。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于：所述誘導(dǎo)劑為〇. ImMIPTG以及200 y M 的 ZnS04。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：步驟ii中，所述分離純化采用凝膠層析， 其中，洗滌液是含有300mM NaCl、和40mM咪唑的溶液，洗脫液是含有300mM NaCl和300mM 咪唑的溶液。
13. 權(quán)利要求6或者7所述蛋白質(zhì)在制備治療腫瘤的藥物中的用途。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于：所述治療腫瘤的藥物是治療結(jié)腸癌、腦 星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌或肺癌的藥物。
15. 權(quán)利要求6或者7所述的蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑在制備治療腫瘤的聯(lián)合用藥物 中的用途。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于：所述蛋白酶體抑制劑是Bortezomib。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于：所述蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑的摩爾 比為：蛋白質(zhì)0. 1?100份，蛋白酶體抑制劑5?50份。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于：所述蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑的摩爾 比為：蛋白質(zhì)0. 5?100份，蛋白酶體抑制劑25?50份。
19. 一種聯(lián)合用藥物，其特征在于：它包含不同規(guī)格的單位制劑，用于同時、分別或者 依次給權(quán)利要求6或者7所述的蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述蛋白酶體抑制劑是 Bortezomib。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑 的摩爾比為：蛋白質(zhì)0. 1?100份，蛋白酶體抑制劑5?50份。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述蛋白質(zhì)與蛋白酶體抑制劑 的摩爾比為：蛋白質(zhì)0.5?100份，蛋白酶體抑制劑25?50份。
23. -種蛋白聚乙二醇結(jié)合物，其特征在于：它由聚乙二醇對權(quán)利要求6或7所述蛋白 進行單點修飾得到，其中，每個蛋白分子上共價結(jié)合一個聚乙二醇分子，聚乙二醇分子的分 子量為5000?20000Da。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述結(jié)合物，其特征在于：所述聚乙二醇為mPEG- 丁醛。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述結(jié)合物，其特征在于：所述聚乙二醇分子的分子量為 10000 ?20000Da。
26. -種制備權(quán)利要求23?25任意一項所述蛋白聚乙二醇結(jié)合物的方法，其特征在 于：包括如下步驟： 1) 取權(quán)利要求6或7所述蛋白，制成濃度為1?10mg/ml的蛋白溶液，透析于包含50mM NaAc-HAc和40 ii M硫酸鋅的醋酸鹽緩沖液中，所述緩沖液的pH為5. 0,透析過夜后加入2M 硼氫化鈉溶液至終濃度為20mM ; 2) 加入聚乙二醇,所述聚乙二醇的量為蛋白摩爾量的1?10倍，反應(yīng)6?18h,反應(yīng)溫 度為2?10°C ; 3) 分離純化，即可。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述蛋白溶液的濃度為 5. 5mg/ml 〇
28. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述聚乙二醇為mPEG-丁 醛；所述蛋白與聚乙二醇摩爾比為1:5;所述反應(yīng)的時間為12h，反應(yīng)溫度為4°C。
29. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于：步驟（3)中，采用陽離子交換柱分離純 化。
30. 權(quán)利要求23?25任意一項所述蛋白聚乙二醇結(jié)合物在制備治療腫瘤的藥物中的 用途。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的用途，其特征在于：所述治療腫瘤的藥物是治療結(jié)腸癌、腦 星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肝癌或肺癌的藥物。
【文檔編號】C12N1/21GK104342444SQ201410350752
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月23日
【發(fā)明者】盧曉風(fēng), 楊浩, 賈殿隆, 萬琳, 程驚秋 申請人:四川大學(xué)華西醫(yī)院