miRNA捕獲探針及其修飾電極與捕獲探針互補(bǔ)鏈及其修飾碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種miRNA捕獲探針及其修飾電極，以及miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈及其修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物，并基于上述修飾電極和修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物建立了一種檢測(cè)miRNA的方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的快速、靈敏、特異和穩(wěn)定檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】m i RNA捕獲探針及其修飾電極與捕獲探針互補(bǔ)鏈及其修飾 碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物、材料和電化學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種捕獲探針及其修飾電極， 與捕獲探針互補(bǔ)鏈及其修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物，還涉及用上述修飾電極和修 飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物檢測(cè)生物活性小分子的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微小RNA (miRNA)是一類長(zhǎng)度為21?25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，能夠與靶 基因3'非翻譯區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展密 切相關(guān)，且血液、尿液中的miRNA穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好，因此可作為多種疾病尤其是腫瘤診 斷的非創(chuàng)傷性生物標(biāo)志物。
[0003] 目前用于miRNA檢測(cè)的方法主要有Northern印跡、基因芯片和實(shí)時(shí)定量 PCR(qRT-PCR)等。Northern印跡是首先被用于半定量檢測(cè)miRNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，至今仍被 視為是檢測(cè)miRNA的金標(biāo)準(zhǔn)，由于其存在要求的樣本量大、靈敏度低、操作耗時(shí)且不適用于 高通量檢測(cè)等缺點(diǎn)，通常用于miRNA檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證?；蛐酒夹g(shù)是當(dāng)前廣泛用于檢測(cè) miRNA水平的高通量技術(shù)，該技術(shù)可一次性對(duì)大量樣本進(jìn)行持續(xù)、快速、有效的檢測(cè)，但同樣 存在檢測(cè)所需樣本量較大、耗費(fèi)較高、不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果可重復(fù)性差等諸多不足，一般多 用于miRNA的初篩。qRT-PCR是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中較常用的miRNA檢測(cè)方法，系通過(guò)反應(yīng)體系 中熒光強(qiáng)度的變化對(duì)目標(biāo)miRNA片段的擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，具有敏感性高、準(zhǔn)確度高、方法 簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)引物設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)操作要求較高。因此，急需建立一種操作簡(jiǎn)便、具有較高 特異性和敏感性的檢測(cè)miRNA的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種miRNA捕獲探針及其修飾電極，與miRNA捕 獲探針互補(bǔ)鏈及其修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物，并基于上述修飾電極和修飾的碳 納米管-金磁納米粒復(fù)合物建立一種檢測(cè)miRNA的新方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的快速、靈 敏、特異和穩(wěn)定檢測(cè)。
[0005] 經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 1. miRNA捕獲探針，為單鏈DNA，從5'端至3'端依次含有與miRNA部分互補(bǔ)片段、 核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以及與輔助探針部分互補(bǔ)片段，其3'末端還修飾有巰基；所述輔助探 針為單鏈DNA，從5'端至3'端依次含有與捕獲探針部分互補(bǔ)片段以及與miRNA部分互補(bǔ) 片段；所述miRNA捕獲探針中含有的與miRNA部分互補(bǔ)片段和所述輔助探針中含有的與 miRNA部分互補(bǔ)片段不重疊。
[0007] 進(jìn)一步，所述miRNA捕獲探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述輔助探針的 核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 更進(jìn)一步，所述miRNA 捕獲探針為 5' -CCACTTCAGTTAT-CCTCAGCGTGGAAAA-(CH2)6- SH-3';所述輔助探針為 5' -CCACGCTGAGGAAATCACAGTACTGTA-3';
[0009] 2. miRNA捕獲探針修飾電極，由以下方法制得：將經(jīng)打磨、拋光、洗滌、干燥處理的 金電極表面用miRNA捕獲探針修飾后，再用己烷巰醇封閉非特異性吸附位點(diǎn)，即得miRNA捕 獲探針修飾電極。
[0010] 進(jìn)一步，所述miRNA捕獲探針修飾電極由以下方法制得：用潤(rùn)濕的麂皮打磨金電 極，然后依次用加有〇. 3μηι和0. 05μηι A1203粉末的麂皮對(duì)電極進(jìn)行拋光打磨，每次打磨后 將電極用水洗凈，再依次用乙醇和水超聲洗滌，處理后的金電極干燥備用；然后在處理后的 金電極表面滴加2 μ Μ的miRNA捕獲探針溶液，修飾過(guò)夜，用水清洗電極，再在電極表面滴加 ImM的己烷巰醇溶液，孵育40分鐘封閉非特異性吸附位點(diǎn)，用水清洗電極，即得miRNA捕獲 探針修飾電極。
[0011] 3. miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈，所述互補(bǔ)鏈與miRNA捕獲探針中核酸內(nèi)切酶剪切點(diǎn)下 游序列互補(bǔ)，其3'末端還修飾有氨基。
[0012] 進(jìn)一步，所述miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0013] 更進(jìn)一步，所述 miRNA 捕獲探針互補(bǔ)鏈為 Y -TTTTCCACGCTGA- (CH2) 6-NH2-3、
[0014] 4. miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物，由以下方法制得： 將羧基化碳納米管分散于含有TODA和NaCl的水溶液中，超聲，離心，沉淀用水洗滌，得到 roDA功能化的碳納米管；再將roDA功能化的碳納米管重新分散于金磁納米粒溶液中，孵 育，磁性分離，得到碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物；再將碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物與甲 苯胺藍(lán)和miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈反應(yīng)，使甲苯胺藍(lán)和miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾到金磁納 米粒的表面，磁性分離，即得到miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合 物。
[0015] 進(jìn)一步，所述miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物由以 下方法制得：將羧基化碳納米管分散于含有0. 2wt% TODA和0. 5M NaCl的水溶液中，超聲 30min，離心，沉淀用水洗滌，得到TODA功能化的碳納米管；再將TODA功能化的碳納米管重 新分散于0. 5mg/mL的金磁納米粒溶液中，孵育2小時(shí)，磁性分離，得到碳納米管-金磁納米 粒復(fù)合物；再將碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物與lmg/mL的甲苯胺藍(lán)溶液和2 μ Μ的miRNA 捕獲探針互補(bǔ)鏈溶液在4°C反應(yīng)12小時(shí)，磁性分離，即得到miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳 納米管-金磁納米粒復(fù)合物。
[0016] 本發(fā)明中所述金磁納米粒是指具有核殼結(jié)構(gòu)的超順磁性復(fù)合微粒，其核為納米磁 性粒子，核表面是金的殼層。
[0017] 5.利用miRNA捕獲探針修飾電極與miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金 磁納米粒復(fù)合物檢測(cè)miRNA的方法，包括以下步驟：以miRNA捕獲探針修飾電極為工作電 極、鉬電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極組建miRNA電化學(xué)生物傳感器；在miRNA捕 獲探針修飾電極表面滴加含有輔助探針、核酸內(nèi)切酶和待測(cè)miRNA的溶液，37°C孵育，用水 清洗電極表面，待干后再滴加 miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物， 37°C孵育，用水清洗電極表面，然后在PBS緩沖液中進(jìn)行差動(dòng)脈沖伏安法掃描，檢測(cè)電流峰 值，進(jìn)而對(duì)待測(cè)miRNA進(jìn)行定性和定量分析。
[0018] 進(jìn)一步，利用miRNA捕獲探針修飾電極與miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米 管-金磁納米粒復(fù)合物檢測(cè)miRNA的方法，包括以下步驟：在miRNA捕獲探針修飾電極表面 滴加含有1 μ Μ輔助探針、5U Nt. BbvCI內(nèi)切酶和待測(cè)miRNA的1 XNEB緩沖液，37°C孵育1 小時(shí)，用水清洗電極表面，待干后再滴加 miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米 粒復(fù)合物，37°C孵育1. 5小時(shí)，用水清洗電極表面，然后在0. 1Μ、ρΗ7. 4的PBS緩沖液中進(jìn)行 差動(dòng)脈沖伏安法掃描，電位掃描范圍為-〇. 6V?0V，脈沖寬度為0. 05s，檢測(cè)電流峰值，進(jìn)而 對(duì)待測(cè)miRNA進(jìn)行定性和定量分析。
[0019] 上述miRNA檢測(cè)方法的原理如下：PDDA功能化后的碳納米管可以吸附大量的金磁 納米粒，電活性物質(zhì)甲苯胺藍(lán)和miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈可修飾到金磁納米粒的表面，得到 碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物。當(dāng)溶液中存在目標(biāo)miRNA時(shí)，其首先與電極上修飾的miRNA 捕獲探針以及溶液中加入的輔助探針雜交，形成"Y"型結(jié)構(gòu)，進(jìn)而被核酸內(nèi)切酶識(shí)別并剪 切，在金電極上形成大量的miRNA捕獲探針片段，該miRNA捕獲探針片段與碳納米管-金 磁納米粒復(fù)合物上修飾的miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈雜交，從而將碳納米管-金磁納米粒復(fù)合 物結(jié)合至電極表面，由于碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物上攜帶了大量的電活性物質(zhì)甲苯胺 藍(lán)，從而可以通過(guò)檢測(cè)甲苯胺藍(lán)的電流信號(hào)達(dá)到快速檢測(cè)目標(biāo)miRNA的目的。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種miRNA捕獲探針及其修飾電極，與 miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈及其修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物，并基于上述修飾電極和 修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物建立了一種檢測(cè)miRNA的新方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA 的快速、靈敏、特異和穩(wěn)定檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行 說(shuō)明：
[0022] 圖1為金電極修飾過(guò)程的電化學(xué)表征，其中A為鐵氰化鉀的CV表征曲線；B為碳 納米管-金磁納米粒復(fù)合物修飾前后的DPV表征曲線。
[0023] 圖2為金電極與碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物孵育時(shí)間的優(yōu)化。
[0024] 圖3為miRNA電化學(xué)傳感器檢測(cè)不同濃度miRNA的DPV表征曲線（A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線 ⑶。
[0025] 圖4為miRNA電化學(xué)生物傳感器的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0026] 圖5為miRNA電化學(xué)生物傳感器的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照試劑制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0028] 主要儀器和試劑：CHI760D型電化學(xué)工作站購(gòu)自上海辰華儀器有限公司； KQ-5200B型超聲器清洗器購(gòu)自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；金電極、飽和甘汞電極、 鉬電極和0.3μπι、0.05μπι A1203粉末購(gòu)自天津艾達(dá)恒昊科技發(fā)展有限公司。金磁納米粒 (直徑50nm，為核殼結(jié)構(gòu)的超順磁性復(fù)合微粒，其核為納米磁性粒子，核表面是金的殼層） 購(gòu)自陜西省西安市金磁納米生物技術(shù)有限公司；羧基化碳納米管（CNTs)購(gòu)自廣東省深圳 市納米技術(shù)有限公司；自主設(shè)計(jì)的miRNA捕獲探針（CP)、輔助探針（AP)、miRNA捕獲探針互 補(bǔ)鏈以及目標(biāo)miRNA等單鏈核酸由上海生物生工有限公司合成；Nt. BbvCI內(nèi)切酶及緩沖液 購(gòu)自美國(guó)New England BioLabs公司；甲苯胺藍(lán)（Tb)、己燒巰醇（96%, HT)和聚二烯丙基 二甲基氯化銨（PDDA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。
[0029] miRNA捕獲探針、輔助探針、miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈以及目標(biāo)miRNA的序列如下：
[0030] miRNA 捕獲探針：5，-CCACTTCAGTTATCCTCAGCGTGGAAAA- (CH2) 6-SH-3 ' （SEQ ID No. 1)；
[0031] 輔助探針：5，-CCACGCTGAGGAAATCACAGTACTGTA-3，（SEQ ID No. 2);
[0032] miRNA 捕獲探針互補(bǔ)鏈：5' -TTTTCCACGCTGA-^HA-NHfS' (SEQ ID No. 3);
[0033] 目標(biāo) miRNA :5，-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3，（SEQ ID No. 4)。
[0034] 實(shí)施例1、miRNA捕獲探針修飾電極的制備
[0035] 用潤(rùn)濕的麂皮打磨金電極，然后依次用加有0.3 μ m和0.05 μ m A1203粉末的麂皮 對(duì)電極進(jìn)行拋光打磨，每次打磨后將電極用超純水洗凈，再依次于乙醇和超純水中超聲洗 滌5min，處理后的金電極干燥備用；在處理后的金電極表面滴加20 μ L2 μ Μ的捕獲探針溶 液，室溫修飾過(guò)夜，用超純水清洗電極，再在電極表面滴加20 μ LlmM的己烷巰醇溶液，室溫 孵育40分鐘封閉非特異性吸附位點(diǎn)，用超純水清洗電極，即得到miRNA捕獲探針修飾電極， 4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0036] 實(shí)施例2、miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物的制備
[0037] 將2mg羧基化碳納米管分散于4mL含有0· 2wt % TODA和0· 5M NaCl的水溶液中， 超聲30min得到均一的黑色溶液，高速離心，沉淀用水洗滌3次，得到TODA功能化的碳納米 管。將H)DA功能化的碳納米管重新分散于2mL0. 5mg/mL的金磁納米粒溶液中，孵育2h，磁 性分離，得到碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物。將碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物與4mLlmg/mL 的甲苯胺藍(lán)溶液和200 μ L2 μ Μ的miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈溶液在4°C反應(yīng)12h，磁性分離，即 得到miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物。
[0038] 實(shí)施例3、miRNA電化學(xué)生物傳感器的組建及用其檢測(cè)miRNA的方法
[0039] 以miRNA捕獲探針修飾電極為工作電極、鉬電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比 電極，組建miRNA電化學(xué)生物傳感器。
[0040] 在miRNA捕獲探針修飾電極表面滴加10 μ L含有1 μ Μ輔助探針、5U Nt. BbvCI內(nèi) 切酶和目標(biāo)miRNA的1XNEB緩沖液，37°C孵育lh，用超純水清洗電極表面，待干后再滴加 10 μ L碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物，37°C孵育1. 5h，用超純水清洗電極表面，然后在0. 1M、 pH7. 4的PBS緩沖液中進(jìn)行差動(dòng)脈沖伏安法（DPV)掃描，電位掃描范圍為-0. 6V?0V，脈沖 寬度為〇. 〇5s，采樣寬度為0. 0167s，檢測(cè)電流峰值。同時(shí)與未經(jīng)碳納米管-金磁納米粒復(fù) 合物修飾的電極進(jìn)行對(duì)照。
[0041] 本發(fā)明研究了金電極修飾過(guò)程中的峰電流變化，用循環(huán)伏安法測(cè)定的CV曲線表 征（圖1)。圖1A為鐵氰化鉀的CV表征曲線，電位掃描范圍為-0. 2V?0. 6V，電位掃描速 率為50mv/s，其中a為裸金電極的CV曲線；b為miRNA捕獲探針修飾后的CV曲線，可見(jiàn) miRNA捕獲探針修飾在一定程度上阻礙了金電極表面的電子傳輸，因此峰電流值減小；c為 己烷巰醇封閉后的CV曲線，可見(jiàn)己烷巰醇在封閉非特異性吸附位點(diǎn)的同時(shí)也阻礙了電子 的傳輸，因此峰電流值進(jìn)一步減??；d為miRNA捕獲探針修飾電極與輔助探針、核酸內(nèi)切酶 和目標(biāo)miRNA共同孵育后的CV曲線，峰電流值有所增強(qiáng)，說(shuō)明核酸內(nèi)切酶成功識(shí)別了目標(biāo) miRNA與miRNA捕獲探針和輔助探針雜交形成的"Y"型結(jié)構(gòu)并對(duì)miRNA捕獲探針進(jìn)行了剪 切，從而使電極表面的位阻減小，電流增大。圖1B為碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物修飾前 后的DPV表征曲線，其中d與圖1A中的d相對(duì)應(yīng)，為碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物修飾前 的DPV曲線，由于含有電活性物質(zhì)甲苯胺藍(lán)的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物沒(méi)有修飾到電 極表面，因此DPV曲線無(wú)明顯的峰值，e是碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物修飾后的DPV曲線， 可以看出有明顯的DPV響應(yīng)。
[0042] 本發(fā)明在研究過(guò)程中對(duì)影響miRNA電化學(xué)生物傳感器電流響應(yīng)的主要參數(shù)（金電 極與碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物的孵育時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)化。以500fM目標(biāo)miRNA為檢測(cè) 對(duì)象，金電極與碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物的孵育時(shí)間由30min逐漸增加到llOmin，結(jié) 果如圖2所示，傳感器的峰電流逐漸升高并于90min左右達(dá)到最大值，之后繼續(xù)增加孵育時(shí) 間，峰電流基本保持不變，說(shuō)明90min時(shí)金電極表面結(jié)合的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物已 達(dá)到飽和，因此金電極與碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物的孵育時(shí)間優(yōu)選為90min。
[0043] 在優(yōu)化條件下，本發(fā)明對(duì)miRNA電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)性能進(jìn)行了考察。使 用miRNA電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)不同濃度的miRNA，結(jié)果如圖3所示，可見(jiàn)隨著miRNA濃 度的不斷增加，其峰電流也隨之增大（圖3A);當(dāng)miRNA濃度在5. 0X10_16?2. 0X10_9M 范圍內(nèi)時(shí)，其濃度的對(duì)數(shù)值與峰電流呈良好的線性關(guān)系（圖3B)，線性回歸方程為：1 = 8. 9441gC+144. 5,相關(guān)系數(shù)R為0. 9945。上述結(jié)果表明本發(fā)明的miRNA電化學(xué)生物傳感器 具有較寬的線性范圍。
[0044] 本發(fā)明對(duì)miRNA電化學(xué)生物傳感器的特異性進(jìn)行了考察。使用miRNA電化學(xué)生物 傳感器分別檢測(cè)空白（blank)，5pM AFP，5pM PDGF，5pM Hb，5pM CEA，由 5pM AFP、5pM PDGF、 5pM Hb、5pM CEA四種干擾物與50fM目標(biāo)miRNA組成的混合物（mixture)，以及50fM目標(biāo) miRNA (target)，結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)即使干擾物的濃度為目標(biāo)miRNA的100倍，也不會(huì)對(duì) 檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生明顯的干擾，說(shuō)明本發(fā)明的miRNA電化學(xué)生物傳感器具有良好的選擇性。
[0045] 本發(fā)明對(duì)miRNA電化學(xué)生物傳感器的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。使用miRNA電化學(xué)生物 傳感器在含有5pM目標(biāo)miRNA的PBS緩沖液中連續(xù)CV掃描30圈，結(jié)果如圖5所示，峰電流 變化為（34. 6-34. 1)/34. 6 = 1. 4%，說(shuō)明本發(fā)明的miRNA電化學(xué)生物傳感器具有良好的穩(wěn) 定性。
[0046] 最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1. miRNA捕獲探針，其特征在于，為單鏈DNA，從5'端至3'端依次含有與miRNA部分互 補(bǔ)片段、核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以及與輔助探針部分互補(bǔ)片段，其3'末端還修飾有巰基；所 述輔助探針為單鏈DNA，從5'端至3'端依次含有與捕獲探針部分互補(bǔ)片段以及與miRNA部 分互補(bǔ)片段；所述miRNA捕獲探針中含有的與miRNA部分互補(bǔ)片段和所述輔助探針中含有 的與miRNA部分互補(bǔ)片段不重疊。
2. 如權(quán)利要求1所述miRNA捕獲探針，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 示；所述輔助探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述miRNA捕獲探針修飾電極，其特征在于，由以下方法制得：將經(jīng) 打磨、拋光、洗滌、干燥處理的金電極表面用miRNA捕獲探針修飾后，再用己烷巰醇封閉非 特異性吸附位點(diǎn)，即得miRNA捕獲探針修飾電極。
4. 如權(quán)利要求3所述miRNA捕獲探針修飾電極，其特征在于，由以下方法制得：用潤(rùn) 濕的麂皮打磨金電極，然后依次用加有〇. 3 μ m和0. 05 μ m A1203粉末的麂皮對(duì)電極進(jìn)行拋 光打磨，每次打磨后將電極用水洗凈，再依次用乙醇和水超聲洗滌，處理后的金電極干燥備 用；然后在處理后的金電極表面滴加2 μ Μ的miRNA捕獲探針溶液，修飾過(guò)夜，用水清洗電 極，再在電極表面滴加 ImM的己烷巰醇溶液，孵育40分鐘封閉非特異性吸附位點(diǎn)，用水清洗 電極，即得miRNA捕獲探針修飾電極。
5. 權(quán)利要求1或2所述miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈，其特征在于，所述互補(bǔ)鏈與miRNA捕獲 探針中核酸內(nèi)切酶剪切點(diǎn)下游序列互補(bǔ)，其3'末端還修飾有氨基。
6. 如權(quán)利要求5所述miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
7. 權(quán)利要求5或6所述miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物， 其特征在于，由以下方法制得：將羧基化碳納米管分散于含有TODA和NaCl的水溶液中，超 聲，離心，沉淀用水洗漆，得到TODA功能化的碳納米管；再將TODA功能化的碳納米管重新分 散于金磁納米粒溶液中，孵育，磁性分離，得到碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物；再將碳納米 管-金磁納米粒復(fù)合物與甲苯胺藍(lán)和miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈反應(yīng)，使甲苯胺藍(lán)和miRNA捕 獲探針互補(bǔ)鏈修飾到金磁納米粒的表面，磁性分離，即得到miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的 碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物。
8. 如權(quán)利要求7所述miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物，其 特征在于，由以下方法制得：將羧基化碳納米管分散于含有0. 2wt% TODA和0. 5M NaCl的 水溶液中，超聲30min，離心，沉淀用水洗滌，得到TODA功能化的碳納米管；再將TODA功能 化的碳納米管重新分散于0. 5mg/mL的金磁納米粒溶液中，孵育2小時(shí)，磁性分離，得到碳納 米管-金磁納米粒復(fù)合物；再將碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物與lmg/mL的甲苯胺藍(lán)溶液和 2 μ Μ的miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈溶液在4°C反應(yīng)12小時(shí)，磁性分離，即得到miRNA捕獲探針 互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物。
9. 利用權(quán)利要求3或4所述miRNA捕獲探針修飾電極與權(quán)利要求7或8所述miRNA捕獲 探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物檢測(cè)miRNA的方法，其特征在于，以miRNA 捕獲探針修飾電極為工作電極、鉬電極為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極組建miRNA電 化學(xué)生物傳感器；在miRNA捕獲探針修飾電極表面滴加含有輔助探針、核酸內(nèi)切酶和待測(cè) miRNA的溶液，37°C孵育，用水清洗電極表面，待干后再滴加 miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的 碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物，37°C孵育，用水清洗電極表面，然后在PBS緩沖液中進(jìn)行差 動(dòng)脈沖伏安法掃描，檢測(cè)電流峰值，進(jìn)而對(duì)待測(cè)miRNA進(jìn)行定性和定量分析。
10.如權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，在miRNA捕獲探針修飾電極表面滴加含有 1 μ Μ輔助探針、5U Nt. BbvCI內(nèi)切酶和待測(cè)miRNA的1XNEB緩沖液，37°C孵育1小時(shí)，用水 清洗電極表面，待干后再滴加 miRNA捕獲探針互補(bǔ)鏈修飾的碳納米管-金磁納米粒復(fù)合物， 37°C孵育1. 5小時(shí)，用水清洗電極表面，然后在0. 1M、pH7. 4的PBS緩沖液中進(jìn)行差動(dòng)脈沖 伏安法掃描，電位掃描范圍為-〇. 6V?0V，脈沖寬度為0. 05s，檢測(cè)電流峰值，進(jìn)而對(duì)待測(cè) miRNA進(jìn)行定性和定量分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104152449SQ201410406476
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】項(xiàng)貴明, 蒲曉允, 張立群, 蔣棟能, 劉飛, 劉暢, 劉琳琳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院