一種端粒酶永生化牛甲狀腺細(xì)胞系及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開一種端粒酶永生化牛甲狀腺細(xì)胞系。本發(fā)明的牛甲狀腺細(xì)胞系被命名為hTERT-BTY,并于2014年6月19日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行保藏,保藏號為C2014109。本發(fā)明的細(xì)胞系可用于分離、檢測和培養(yǎng)口蹄疫病毒。本發(fā)明的細(xì)胞系也可用作口蹄疫的牛源體外研究模型,或者用于制備口蹄疫病毒檢測試劑。
CCTCC NO:C2014109
2014.06.19
【專利說明】一種端粒酶永生化牛甲狀腺細(xì)胞系及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種牛甲狀腺細(xì)胞系及其用途和制備方法,確切講本發(fā)明涉及一種端粒酶永生化牛甲狀腺細(xì)胞系。
【背景技術(shù)】
[0002]口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是屬于小 RNA 病毒科口蹄疫病毒屬的單股正鏈RNA病毒,可感染偶蹄類動(dòng)物并導(dǎo)致以口部、鼻子和蹄部等部位出現(xiàn)水泡為特征的急性、熱性、高度傳染性疾病。FMD被OIE列為法定必報(bào)病,在我國屬于一類病,是危害畜牧業(yè)健康發(fā)展的“頭號疫病”。
[0003]目前,口蹄疫病毒分離、檢測、培養(yǎng)以及研究最為成功的實(shí)驗(yàn)?zāi)P腕w系主要是乳鼠和倉鼠腎細(xì)胞系(BHK-21),其次是豬腎細(xì)胞系IBRS-2和PK-15。這些體系對不同毒株的敏感度各不相同,而且因?yàn)榭绶N分離培養(yǎng),會(huì)引起病毒變異。有研究人員在牛源口蹄疫病毒分離檢測時(shí)發(fā)現(xiàn),病毒在原代牛甲狀腺細(xì)胞(BTY)上的滴度比在上述其他體系中滴度更高,原代牛甲狀腺細(xì)胞對口蹄疫病毒的敏感程度也比其他細(xì)胞高100-1000倍,參見:W.A.Snowdonj 1966.Growth of Foot-and-mouth Disease Virus in Monolayer Culture ofCalf Thyroid Cells.目前牛甲狀腺細(xì)胞已經(jīng)被用于口蹄疫查毒實(shí)驗(yàn)以及惡性卡他熱等病毒的分離和研究。然而,原代BTY細(xì)胞可傳至6-10代,隨著增殖或凍存會(huì)使其敏感程度降低,在診斷和科學(xué)研究過程中,每次制備原代BTY細(xì)胞要宰殺胎牛來獲取取甲狀腺組織,不僅違背“動(dòng)物福利”的初衷,而且是一項(xiàng)非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作,且批次之間往往差異較大。因此,以原代BTY細(xì)胞為基礎(chǔ),構(gòu)建一個(gè)與原代BTY細(xì)胞特性一致的細(xì)胞系則能夠?yàn)镕MDV的分離培養(yǎng)、檢測診斷以及基礎(chǔ)研究提供極大的便利。
[0004]對FMDV的致病性研究主要針對牛和豬。牛FMD通常是通過呼吸道傳播途徑傳播病毒而感染,病毒感染復(fù)制的初始部位是肺部或咽部,隨即病毒快速分散到口腔、蹄上皮部位。反芻動(dòng)物感染FMDV后,經(jīng)過嚴(yán)重感染階段有些動(dòng)物可轉(zhuǎn)歸為持續(xù)感染狀態(tài)。免疫動(dòng)物在感染病毒后,也有可能轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)性感染動(dòng)物。反芻動(dòng)物的咽喉部(包括軟顎)是FMDV持續(xù)感染部位,從FMD康復(fù)期的牛的食道-咽喉部(esophageal/pharyngeal, 0/P)刮取液中可以分離到活的FMDV。豬通常通過飼喂被FMDV污染的飼料或直接接觸FMD感染動(dòng)物或圈養(yǎng)過病畜的動(dòng)物舍等而受感染。通過空氣傳播途徑牛比豬更為易感,但豬感染后排毒量比?;蜓蚋腥竞笈懦龅牟《玖慷?。FMDV的不斷進(jìn)化造成其宿主嗜性、毒力以及抗原性等多種表型發(fā)生變異,形成大量表型各異的毒株,部分毒株出現(xiàn)與傳統(tǒng)毒株不同的致病特性,不僅對牛羊具有嚴(yán)重的致病性,而且還具有對豬有很強(qiáng)的感染和致病性。若要深入比較闡明病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)、感染致病性以及調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,除了動(dòng)物本體實(shí)驗(yàn),一個(gè)良好的體外研究模型是必不可少的,然而目前沒有一種能夠感染FMDV的牛源細(xì)胞系,因此構(gòu)建一株能夠感染FMDV的牛體細(xì)胞系是非常有必要的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明提供一種能夠感染FMDV的牛源細(xì)胞系,該細(xì)胞系可作為FMDV對牛的致病性研究的一個(gè)優(yōu)良模型,并可用于分離、檢測和培養(yǎng)口蹄疫病毒,或者制備口蹄疫病毒檢測試劑。
[0006]本發(fā)明的牛甲狀腺細(xì)胞系被命名為1^1^了¥,并于2014年6月19日在中國武漢的武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏,保藏號為CCTCC No:C2014109。
[0007]本發(fā)明的細(xì)胞系可用于分離、檢測和培養(yǎng)口蹄疫病毒。
[0008]本發(fā)明的細(xì)胞系也可用作口蹄疫病毒的牛源體外研究模型,或者用于制備口蹄疫病毒檢測試劑。
[0009]本發(fā)明的細(xì)胞系的構(gòu)建方法包括以下步驟:
(O分離并培養(yǎng)原代犢牛甲狀腺細(xì)胞;
(2)在原代犢牛甲狀腺細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT質(zhì)粒;
(3)抗生素篩選獲得能夠穩(wěn)定傳代的犢牛甲狀腺細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0010]在本發(fā)明的端粒酶永生化的犢牛甲狀腺細(xì)胞的構(gòu)建方法中,其步驟(I)中的原代犢牛甲狀腺細(xì)胞是從0-24h齡健康犢牛甲狀腺組織上分離培養(yǎng)的細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)取材對組織類型、分化程度、年齡等均有要求,一般胚胎組織較個(gè)體組織容易培養(yǎng),分化低的較分化高的容易培養(yǎng)。由于牛的活胚胎很難獲得,因此我們選用組織細(xì)胞分化程度較低的0-24h齡犢牛進(jìn)行甲狀腺細(xì)胞分離培養(yǎng)。
[0011]本發(fā)明的端粒酶永生化的犢牛甲狀腺細(xì)胞系的構(gòu)建方法中其步驟(2)中轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒為pCIneo-hTERT。該質(zhì)粒是將人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因連接到pCIneo載體(一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)載體,為G418抗性)上構(gòu)建而成,轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠使該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)端粒酶。細(xì)胞缺乏端粒酶導(dǎo)致分裂過程中端粒長度不斷丟失是細(xì)胞衰老的主要機(jī)制之一,而導(dǎo)入外源性端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)端粒酶的活性,這樣就可以使端粒長度保持穩(wěn)定,延長細(xì)胞生存期并增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力。激活端粒酶誘導(dǎo)細(xì)胞永生化類似于胚胎干細(xì)胞內(nèi)存在的生理途徑,最終能夠獲得與原代甲狀腺細(xì)胞生物學(xué)行為接近、性狀相對穩(wěn)定的永生化細(xì)胞系。
[0012]本發(fā)明的端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞系的構(gòu)建方法中其步驟(3 )中篩選陽性克隆是采用G418藥物進(jìn)行篩選,轉(zhuǎn)染24h后加壓篩選抗生素濃度為400Pg/mL,篩選時(shí)間為15天;挑取單克隆后篩選抗生素濃度為200Pg/mL。加壓篩選濃度是通過BTY細(xì)胞的G418殺傷曲線確定的,具體方法是未經(jīng)轉(zhuǎn)染的正常BTY細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)加入含有G418的培養(yǎng)基,使用的G418濃度分別為50、100、200、400、80(^g/mL,每隔3天換含相應(yīng)濃度G418的新鮮培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)兩周時(shí)細(xì)胞全部死亡所需的最低G418濃度為篩查陽性克隆所用的濃度。本實(shí)驗(yàn)中確定的篩選濃度為40(^g/mL,這樣就能保證在不殺死陽性細(xì)胞的情況下最大程度的殺死陰性細(xì)胞。單克隆出現(xiàn)后G418濃度減半繼續(xù)篩選,直到細(xì)胞維持穩(wěn)定的G418抗性。
[0013]在本發(fā)明的端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞系的構(gòu)建方法中,對犢牛甲狀腺細(xì)胞系特征基因促甲狀腺激素受體基因TSHR以及鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)子NIS檢測方法是通過RT-PCR進(jìn)行的,所使用的擴(kuò)增引物分別為:SEQ ID No, 1、SEQ ID No,2、SEQ ID No,3 和 SEQ ID No,4。以上引物是根據(jù)牛TSHR和NIS全基因序列設(shè)計(jì)的,分別檢測這兩個(gè)基因中的其中一段,PCR產(chǎn)物測序后與全基因序列進(jìn)行比對,比對結(jié)果同源性均為95%以上。
[0014]本發(fā)明具有以下有益效果:
(I)細(xì)胞缺乏端粒酶導(dǎo)致分裂過程中端粒長度不斷變短,這是細(xì)胞衰老的主要機(jī)制之一,外源性導(dǎo)入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)端粒酶,從而使端粒長度保持穩(wěn)定不變,延長細(xì)胞的生存期并增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。端粒酶誘導(dǎo)細(xì)胞永生化的方法是一種類似于胚胎干細(xì)胞原理的接近生理過程的途徑,使細(xì)胞發(fā)生不可預(yù)知的突變的可能性較小,這樣就為獲得理想的FMDV體外研究模型提供了有力的保障。本發(fā)明是選取人端粒酶催化亞單位hTERT轉(zhuǎn)染原代牛甲狀腺細(xì)胞激活端粒酶的方法構(gòu)建牛甲狀腺細(xì)胞系,本發(fā)明的細(xì)胞系仍然保持原代牛甲狀腺細(xì)胞的特性,能夠高水平表達(dá)牛甲狀腺特異性基因。
[0015](2)染色體核型分析顯示本發(fā)明的永生化細(xì)胞系為正常體細(xì)胞,未發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變,呈現(xiàn)錨著依賴和接觸抑制等安全性。
[0016](3) 口蹄疫病毒可在本發(fā)明的細(xì)胞上復(fù)制增殖,因此該細(xì)胞系可用于動(dòng)物組織或水泡液等樣品中的FMDV田間毒株的分離檢測。
[0017](4)研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中一株對豬和牛致病性不同的FMDV毒株在hTERT-BTY細(xì)胞系和另外一株豬源細(xì)胞系上的復(fù)制情況與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致。因此本發(fā)明的細(xì)胞系可作為FMDV的體外研究模型;也可以用來大量擴(kuò)增FMDV病毒作為疫苗或診斷的抗原。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為實(shí)施例1原代牛甲狀腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(普通光鏡100X )。
[0019]圖2為實(shí)施例1 hTERT-BTY細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(普通光鏡100X )。圖2A為第五代形態(tài);2B為第三十代形態(tài)。
[0020]圖3為實(shí)施例1第30代hTERT-BTY甲狀腺特異基因TSHR和NIS檢測PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。在圖 3 中,M:100-2000bp 的 DNA marker ;TSHR:TSHR 片段擴(kuò)增產(chǎn)物,1.951kb ;NIS:NIS片段擴(kuò)增產(chǎn)物,333bp。
[0021]圖4為實(shí)施例1第30代hTERT-BTY細(xì)胞的染色體分析(GTG-Band染色)。其中:圖4A1為原代BTY細(xì)胞染色體核型(對照);圖4A2為原代BTY細(xì)胞GTG-Band染色;圖4B1為第30代hTERT-BTY細(xì)胞的染色體核型;圖4B2為第30代hTERT-BTY細(xì)胞GTG-Band染色。
[0022]圖5為實(shí)施例2 FMDV/0/mya98毒株感染hTERT-BTY細(xì)胞形成CPE情況(普通光鏡100X )。其中:圖5A:正常對照細(xì)胞;圖5B:感染FMDV/0/mya98毒株細(xì)胞。
[0023]圖6為實(shí)施例2 A、B、C三株不同的FMDV毒株在hTERT-BTY細(xì)胞上的復(fù)制情況。
[0024]圖7為實(shí)施例2流式細(xì)胞儀檢測FMDV/0/mya98毒株誘導(dǎo)hTERT-BTY細(xì)胞發(fā)生凋亡情況。其中:圖7A:正常對照細(xì)胞凋亡情況;圖7B:感染FMDV/0/mya98毒株細(xì)胞凋亡情況。其中橫坐標(biāo)為FITC熒光強(qiáng)度,縱坐標(biāo)為PI熒光強(qiáng)度。Ql為機(jī)械誤差;Q2為晚期凋亡細(xì)胞;Q3為正常細(xì)胞;Q4為早期凋亡細(xì)胞。
[0025]圖8為實(shí)施例2流式細(xì)胞儀檢測三株不同的FMDV毒株誘導(dǎo)hTERT-BTY細(xì)胞發(fā)生凋亡情況。其中:圖8A:0.015 MOI劑量的A、B、C三株毒株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況;圖8B:0.025MOI劑量的A、B、C三株毒株誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合具體實(shí)施例對上述方案做進(jìn)一步說明。
[0027]實(shí)施例1犢牛甲狀腺原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)以及端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞系的構(gòu)建及生物學(xué)特性檢測
一原代培養(yǎng)
中國荷斯坦奶牛,雄性,I日齡,放血處死后取甲狀腺連同喉頭和一段氣管一起取出,低溫下送入實(shí)驗(yàn)室;將組織清洗后放入75%的酒精中消毒10分鐘,剪去外膜及筋腱組織,用加有雙抗的PBS清洗兩次,稱凈重,一般為10-15g,剪成小米粒大小,越小越好;按凈重每克組織加6?8ml 0.25%的胰酶溶液,上下翻轉(zhuǎn)使液體與組織充分接觸;37°C震蕩消化4(T60min,棄去第一次的消化液,收集以后每次的消化液,每次消化完畢,再加胰酶溶液繼續(xù)消化剩余組織,如此重復(fù)2- 3次,至上清液清亮;收集的細(xì)胞分裝至25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,向瓶內(nèi)加入DMEM-F12完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,0.01IU/mL促甲狀腺激素,5Pg/mL牛胰島素,5Pg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白,2mmol/L L-谷氨酰胺,100U/mL青霉素G、100Pg/mL鏈霉素和0.25Pg/mL兩性霉素B) 37°C 5%的二氧化碳溫箱培養(yǎng)。
[0028]該原代犢牛甲狀腺細(xì)胞主要呈梭型,見圖1。
[0029]二細(xì)胞系建立方法
具體步驟為:待原代甲狀腺細(xì)胞生長至80%融合,即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒按照說明書進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)染,每瓶細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT質(zhì)粒8μ8,轉(zhuǎn)染6h后換完全培養(yǎng)基(無抗生素)進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h后按照1:10的比例傳代培養(yǎng),完全培養(yǎng)基中加入40(^g/mL G418抗生素進(jìn)行加壓篩選,篩選過程中每3天更換含G418的新鮮培養(yǎng)基,并移除死亡的細(xì)胞及細(xì)胞碎片。篩選15天后,挑取單克隆用含20(^g/mL G418抗生素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞正常生長時(shí)換取不含篩選抗生素的正常完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、傳代。
[0030]hTERT-BTY細(xì)胞系第5代和第30代形態(tài)如圖2所示。
[0031]三hTERT-BTY細(xì)胞系生物學(xué)特性檢測(以下生物學(xué)特性檢測實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第30代端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞。)
(一)細(xì)胞形態(tài):第30代的hTERT-BTY細(xì)胞系的細(xì)胞呈梭型,與原代犢牛甲狀腺細(xì)胞形態(tài)相同。
[0032](二)hTERT-BTY細(xì)胞系特異性基因鑒定。
[0033]收集新鮮培養(yǎng)的端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞,用Trizol裂解細(xì)胞,氯仿和異丙醇提取總RNA。用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)Genebank中牛TSHR (Gene ID281553)和NIS (Gene ID 505310)全基因序列設(shè)計(jì)RT-PCR引物(NIS上游引物:5’CCTCCAGGGCCGTGCTCATCAAC3’ ;NIS 下游引物:5’ GCCCCTCCCCTCCCCCATAACA 3’ ;TSHR 上游引物:5’ ATGGAGGGGCAGGGGATACG 3’ ;TSHR 下游引物:5’ ATGCGCTGCTTCTAAGAGGAGTGC3’),PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 3min ;PCR 循環(huán):94°C 30s, 59.8°C 30s, 72°C 80s,共 35個(gè)循環(huán),最后72°C延伸1min ;產(chǎn)物長度分別為TSHR 1.951kb ;NIS 333bp。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測序。凝膠電泳結(jié)果(圖3)表面該細(xì)胞系中TSHR和NIS表達(dá)為陽性。說明該細(xì)胞系在第30代時(shí)仍具有牛甲狀腺細(xì)胞的典型特征,未分化成其他細(xì)胞。
[0034](三)染色體鑒定。
[0035]將培養(yǎng)的犢牛甲狀腺原代細(xì)胞和hTERT-BTY細(xì)胞系置于4°C 12h后,加入終濃度為0.^gML的秋水仙素,37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h。采集分裂中期的細(xì)胞,用固定液進(jìn)行固定,然后將細(xì)胞懸液滴于遇冷的載玻片上,用Giemas染色液染色,于顯微鏡下計(jì)數(shù)染色體數(shù)。結(jié)果見圖4??梢姷?0代端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞染色體數(shù)目和原代細(xì)胞染色體數(shù)目一致,均為2n=60,該細(xì)胞系染色體數(shù)目未發(fā)生畸變。并對原代甲狀腺細(xì)胞和端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞系染色體進(jìn)行GTG-Band染色,對比觀察是否有染色體結(jié)構(gòu)畸變。結(jié)果如圖5所示,和原代甲狀腺核型圖比較未發(fā)現(xiàn)第30代hTERT-BTY細(xì)胞出現(xiàn)明顯染色體結(jié)構(gòu)畸變。說明該永生化細(xì)胞系未發(fā)生癌變,仍保持正常牛體細(xì)胞特性。第40代hTERT-BTY保藏于CCTCC。
[0036]實(shí)施例2 口蹄疫病毒(FMDV)在hTERT-BTY細(xì)胞系上的生物學(xué)特性研究。
[0037]一、口蹄疫病毒FMDV/0/mya98毒株感染hTERT-BTY細(xì)胞系并形成CPE情況。
[0038]細(xì)胞接種于96孔板中,生長至80°/Γ90%融合,用無血清MEM培養(yǎng)基稀釋病毒至0.05Μ0Ι接種到細(xì)胞中,24h后鏡下觀察拍照。如圖5所示,24h后大量細(xì)胞變圓脫落,出現(xiàn)明顯的CPE。說明該口蹄疫毒株可以感染端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞系并使細(xì)胞發(fā)生病變。
[0039]二、口蹄疫病毒FMDV毒株在hTERT-BTY細(xì)胞系上的復(fù)制情況。
[0040]將細(xì)胞按照1.5X 15個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到24孔板中,過夜培養(yǎng)至細(xì)胞80%?90%融合,將病毒按照200 X 14 copies/孔接種到細(xì)胞中,作用Ih后PBS清洗3?5次,然后在孵育0、6、12、24、36h收獲病毒,每個(gè)樣品取200 μ L提取RNA,用real-time PCR測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒RNA拷貝數(shù)并繪制曲線。結(jié)果如圖6所示,三株不同的FMDV/0/mya98毒株均可在hTERT-BTY細(xì)胞系上高水平復(fù)制。
[0041]三、hTERT-BTY細(xì)胞系在FMDV基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。
[0042](一)口蹄疫病毒FMDV/0/mya98毒株誘導(dǎo)hTERT-BTY細(xì)胞系發(fā)生凋亡的情況。
[0043]細(xì)胞接種于96孔板中,生長至80°/Γ90%融合,用無血清MEM培養(yǎng)基稀釋病毒至0.05 MOI接種到細(xì)胞中,24h后用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞,預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。用含BSA的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至I X 16個(gè)細(xì)胞/mL,在細(xì)胞懸液中加入5μ? AnnexinV-FITC,混勻后4°C避光孵育15min。加入ΙΟμ? PI混勻后4°C避光孵育5min,流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。結(jié)果如圖7所示,病毒感染24h后,細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡總和達(dá)到了89.6%。
[0044](二)三株不同的FMDV毒株誘導(dǎo)hTERT-BTY細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。
[0045]實(shí)驗(yàn)方法同(一),檢測0.015M0I以及0.025M0I兩個(gè)劑量的A、B、C三株不同的FMDV毒株誘導(dǎo)hTERT-BTY細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果如圖8所示,病毒感染24h后,三個(gè)毒株誘導(dǎo)hTERT-BTY細(xì)胞發(fā)生凋亡的程度具有一定的差異,并且兩個(gè)不同劑量趨勢一致。
[0046]綜上所述,實(shí)施例1成功構(gòu)建了端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞系,并對該細(xì)胞系生物學(xué)特性做了檢測。結(jié)果表明該細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代至50代以上,第三十代仍能高水平表達(dá)牛甲狀腺特異基因TSHR和NIS,說明該細(xì)胞系仍保持甲狀腺細(xì)胞的特性。而且與原代牛甲狀腺細(xì)胞相比,該細(xì)胞系第三十代細(xì)胞染色體無數(shù)目以及結(jié)構(gòu)畸變,仍為正常牛體細(xì)胞。
[0047]實(shí)施例二中對該細(xì)胞系的應(yīng)用進(jìn)行了系列研究,選取不同的FMDV毒株接種到該細(xì)胞系上,發(fā)現(xiàn)低劑量(0.05M0I)的FMDV即能感染該細(xì)胞系并形成明顯的CPE,隨著感染時(shí)間的增加,病毒RNA拷貝數(shù)呈增長趨勢。這一系列結(jié)果表明FMDV能夠感染該細(xì)胞并在此細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁殖,因此該細(xì)胞系可以用來分離動(dòng)物組織或水泡液等樣品中的FMDV田間毒株,也可以用來大量培養(yǎng)FMDV作為疫苗或診斷的抗原。實(shí)施例二中還對該細(xì)胞系在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用作了初步的探索,以FMDV毒株誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的研究為例,發(fā)現(xiàn)FMDV毒株能夠誘導(dǎo)該細(xì)胞系發(fā)生凋亡,并且同樣劑量的不同毒株誘導(dǎo)凋亡的程度具有一定的差異。這一結(jié)果表明不同的毒株由于其致病性、復(fù)制能力等特性不同,其誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的能力也就有所差異。因此,可借助hTERT-BTY細(xì)胞作為細(xì)胞模型,研究不同毒株的凋亡機(jī)制。同樣方式,該細(xì)胞還有望作為牛源細(xì)胞模型進(jìn)行FMDV的免疫機(jī)制、病毒復(fù)制調(diào)控、持續(xù)感染以及嗜性差異等研究。
【權(quán)利要求】
1.一種牛甲狀腺細(xì)胞系,該細(xì)胞系命名為hTERT-BTY,CCTCC保藏號為C2014109。
2.如權(quán)利要求1所述細(xì)胞系的用途,其特征在于分離、檢測和培養(yǎng)口蹄疫病毒中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述細(xì)胞系的用途,其特征在于用作口蹄疫病毒的牛源體外研究模型。
4.如權(quán)利要求1所述細(xì)胞系的用途,其特征在于制備口蹄疫病毒檢測試劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利I所述的細(xì)胞系的構(gòu)建方法,其特征在于所述方法包括以下步驟: (O分離并培養(yǎng)原代犢牛甲狀腺細(xì)胞; (2)在原代犢牛甲狀腺細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT質(zhì)粒; (3)抗生素篩選獲得能夠穩(wěn)定傳代的犢牛甲狀腺細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的端粒酶永生化的犢牛甲狀腺細(xì)胞的構(gòu)建方法,其特征在于所述步驟(I)中的原代犢牛甲狀腺細(xì)胞是從0-24h齡健康犢牛甲狀腺組織上分離培養(yǎng)的細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的端粒酶永生化的犢牛甲狀腺細(xì)胞系的構(gòu)建方法,其特征在于所述步驟(2)中轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒為pCIneo-hTERT。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞系的構(gòu)建方法,其特征在于所述步驟(3)中篩選陽性克隆是采用G418藥物進(jìn)行篩選,轉(zhuǎn)染24h后加壓篩選抗生素濃度為400Pg/mL,篩選時(shí)間為15天;挑取單克隆后篩選抗生素濃度為200Pg/mL。
9.權(quán)利要求5至8所表述的端粒酶永生化犢牛甲狀腺細(xì)胞系的構(gòu)建方法的犢牛甲狀腺細(xì)胞系特征基因促甲狀腺激素受體基因TSHR以及鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)子NIS檢測方法,其特征在于對所述檢測方法是通過RT-PCR進(jìn)行的,其使用的擴(kuò)增引物分別為: SEQ ID No USEQ ID No 2、SEQ ID No 3 和 SEQ ID No 4,其中: SEQ ID No I (NIS 上游引物):5’ CCTCCAGGGCCGTGCTCATCAAC3’ ; SEQ ID No 2 (NIS 下游引物):5’ GCCCCTCCCCTCCCCCATAACA 3’ ; SEQ ID No 3 (TSHR 上游引物):5’ ATGGAGGGGCAGGGGATACG 3’ ; SEQ ID No 4 (TSHR 下游引物):5’ ATGCGCTGCTTCTAAGAGGAGTGC 3’。
【文檔編號】C12N7/00GK104293736SQ201410421962
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】鄭海學(xué), 毛箬青, 田宏, 楊帆, 曹偉軍, 朱紫祥, 李丹, 連凱琪, 靳野, 郭建宏, 何繼軍, 劉湘濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所