一種雜交鵝掌楸LhMKK2基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雜交鵝掌楸 LhMKK2 基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明在已建立完善的雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系﹑且已獲得部分轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，同源克隆獲得雜交鵝掌楸 LhMKK2 基因全長，命名為 LhMKK2 ，通過基因表達(dá)分析，證明了雜交鵝掌楸 LhMKK2 基因在植物中的廣泛表達(dá)，參與植株的生長發(fā)育，以及逆境脅迫響應(yīng)過程，通過對其功能分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) LhMKK2 基因增強(qiáng)植株對鹽脅迫響應(yīng)的抗性，影響植株的生長發(fā)育，可為開展雜交鵝掌楸抗逆性分子育種提供理論依據(jù)，并進(jìn)一步在植物抗逆境脅迫中有較廣泛的應(yīng)用。
【專利說明】-種雜交鵝掌楸Α/;#/ΤΛ^基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雜交鵝掌楸基因及其 表達(dá)蛋白和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 雜交鵝掌楸是南京林業(yè)大學(xué)著名林木遺傳育種學(xué)家葉培忠教授等人利用中國馬 褂木（L. Chinese (HEMSL. ) Sarg)與北美鵝掌楸（L. tulipifera Linn.)雜交試驗(yàn)獲得的 種間雜交種，具有明顯的雜種優(yōu)勢。雜交鵝掌楸因其生長速度快，抗病蟲害強(qiáng)，材質(zhì)紋理細(xì) 膩，葉形奇特，生長速度快，是集荒山造林、工業(yè)用材、園林觀賞的優(yōu)良樹種，也被用于庭院 綠化，造林和用材樹種，市場潛力大。目前雜交鵝掌楸主要通過扦插、嫁接等傳統(tǒng)無性繁殖 方法及人工雜交的有性繁殖方式進(jìn)行繁殖，但因?yàn)槭艿郊竟?jié)和雜交制種效率的影響，限制 了優(yōu)良雜種植株的繁殖，傳統(tǒng)的育苗繁殖方式，速度緩慢，優(yōu)良種苗數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)供不應(yīng)求，影 響雜交鵝掌楸的應(yīng)用及推廣。陳金慧等以雜交鵝掌楸未成熟胚為培養(yǎng)材料，在固體培養(yǎng)基 上成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，建立了體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)，并成功進(jìn)入后期工廠化生產(chǎn)，從根本上 提高了傳統(tǒng)育種方法的緩慢育苗速度和方式。通過后期研究的不斷優(yōu)化，完善了雜交鵝掌 楸胚性細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)體系，為開展高等木本植物的生長、發(fā)育、調(diào)控途徑和抗逆性等基礎(chǔ) 實(shí)驗(yàn)研究，提供了大量技術(shù)基礎(chǔ)和試驗(yàn)材料基礎(chǔ)。
[0003] 促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)級聯(lián)路徑 在真核生物中高度保守，是介導(dǎo)植物細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞響應(yīng)的重要信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，在細(xì)胞分化和發(fā)育過程中，激素，多種生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。MPK 通路通常由三種三級級聯(lián)激酶參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括促分裂原活化蛋白激酶的激酶之激酶 (mitogen-activated protein kinase kinase kinases,MAPKKK,簡稱MEKK);促分裂原活化 蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinases，MAPKK，簡稱 MEK 或 MKK) 以及促分裂原活化蛋白激酶MAPK，依次通過逐級磷酸化激活下游信號，將細(xì)胞外部多種類 型刺激信號傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而引起細(xì)胞響應(yīng)，參與介導(dǎo)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分裂、分化、 凋亡等多種過程，甚至生長素、脫落酸、乙烯和細(xì)胞分裂素的代謝，協(xié)同參與植物逆境脅迫 響應(yīng)。因此，二級級聯(lián)激酶MPKK家族參與植物的生長發(fā)育，激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及植物抗逆 性脅迫響應(yīng)過程。
[0004] 目前，通過對擬南芥基因組序列分析，已鑒定出80個(gè)姻/--^基因，10個(gè)姻基 因，20個(gè)姻娜基因，這些基因也廣泛存在于其它植物基因組中。比如，楊樹中已鑒定出21 個(gè)基因和11個(gè)基因，水稻中有15個(gè)基因和8個(gè)基因，75個(gè) 基因。另外，目前已在許多物種中分離到姻家族基因，如小麥，油菜，水稻，歐芹，煙草 等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種雜交鵝掌楸 遞--基因。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述雜交鵝掌楸基因的表達(dá)蛋白。本發(fā) 明還有一目的是提供雜交鵝掌楸ZAiTU基因在雜種鵝掌楸抗逆性分子育種中的應(yīng)用。
[0006] 技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種雜交鵝掌楸以遞--基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述的雜交鵝掌楸基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 所述的雜交鵝掌楸ZAiTU基因在雜交鵝掌楸抗逆性分子育種中的應(yīng)用。
[0009] 所述的含有雜交鵝掌楸基因的載體或宿主細(xì)胞。
[0010] MAPKK家族基因在MAPK級聯(lián)路徑中起"承上啟下"的作用，是上下游信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路的交叉點(diǎn)，擬南芥中，遞尤?基因參與茉莉酸、水楊酸等激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，以及 MEKK1-MKK2-MPK4/MPK6 ;MKK2-MPK4級聯(lián)路徑，是對低溫、鹽脅迫應(yīng)答信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的組成部 分，也參與植物的生長發(fā)育過程。本發(fā)明是在已建立成熟的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系的基 礎(chǔ)上，同源克隆促分裂原活化蛋白激酶之激酶基因全長。
[0011] 有益效應(yīng)：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明是在已建立的完善的雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎 發(fā)生體系的基礎(chǔ)上，通過對雜交鵝掌楸MAPKK家族基因的克隆與鑒定，基因的表達(dá)分析，基 因的遺傳轉(zhuǎn)化等手段，分析驗(yàn)證其功能，證明了雜交鵝掌楸基因參與植物體細(xì)胞胚 胎發(fā)生過程，過表達(dá)基因能夠提高植株對鹽脅迫響應(yīng)的抗性，影響植株的生長發(fā) 育，因此可用于提高植株的抗逆性脅迫響應(yīng)，為雜交鵝掌楸的抗逆性分子育種提供依據(jù)，有 很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是雜交鵝掌楸葉片總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖2是基因全長PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖3是目的片段雙酶切反應(yīng)的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，M :DL2000 Marker ;a，b : ZA遞X^與pMD?19-T Vector連接載體用Xba I，Sac I雙酶切反應(yīng)； 圖4是空表達(dá)載體pBI121雙酶切反應(yīng)的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中，a :空載體PBI121 質(zhì)粒用Xba I，Sac I雙酶切反應(yīng)；Ml :DL2000 Marker ;M2:從上到下條帶大小分別為： 23130bp,9416bp,6557bp,4361bp,2322bp,2027bp,564bp ； 圖5是構(gòu)建好的過表達(dá)載體圖； 圖6是基因在不同部位的實(shí)時(shí)定量結(jié)果圖；圖中，1 :雄蕊；2 :根；3 :莖；4 :葉； 5 :芽；6 :花；7 :花瓣；8 :雌蕊； 圖7是基因在不同時(shí)期的實(shí)時(shí)定量結(jié)果圖；圖中，1 :胚性愈傷組織；2 :液體懸 浮培養(yǎng)7d ;3 :過渡培養(yǎng)期；4 :球形胚；5 :魚雷胚；6 :早期子葉胚；7 :成熟子葉胚； 圖8是ΤΙ、T2代陽性植株P(guān)CR檢測結(jié)果圖；圖中，p 的重組質(zhì)粒，陽性 對照；M :DL2000 Marker ;1-12轉(zhuǎn)基因植株的PCR產(chǎn)物；a，b :野生型擬南芥擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物， 陰性對照；c :水，空白對照； 圖9是Tl代轉(zhuǎn)基因株系與野生型Ler的生長情況圖；圖中，A 轉(zhuǎn)基因 株系；B :野生型Ler ;C 轉(zhuǎn)基因株系的側(cè)枝；D :野生型Ler的側(cè)枝； 圖10是Tl代轉(zhuǎn)基因株系與野生型Col的生長情況圖；圖中，A，B，C 轉(zhuǎn) 基因株系；D :野生型Col ;E，F(xiàn)必遞^?轉(zhuǎn)基因株系的葉片； 圖11是過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代植株生長統(tǒng)計(jì)圖； 圖12是鹽脅迫下Τ2代轉(zhuǎn)基因植株和野生型Col的生長情況圖；圖中，A :野生型擬南 芥對照；B :200mmol/L NaCl下野生型擬南芥；C :轉(zhuǎn)基因植株對照；D :200mmol/L NaCl下轉(zhuǎn) 基因植株； 圖13是鹽脅迫下第七天野生型和轉(zhuǎn)基因植株生長情況圖；圖中，A :200mmol/LNaCl下 野生型擬南芥；B :200mmol/LNaCl下轉(zhuǎn)基因植株。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[0014] 實(shí)施例1 以雜交鵝掌楸植株為材料，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行PCR，瓊脂 糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，與pMD?19-T Vector (Takara D102A)載體連接，轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，測序并分析。挑取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，添加適當(dāng)酶切位點(diǎn)后與表達(dá)載體PBI121 同時(shí)雙酶切，在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，待擬南芥適齡 后，通過花器官浸泡轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，觀察Tl，T2代表型，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行抗逆性脅 迫處理，分析其功能。
[0015] (1)總RNA的提取 以雜交鵝掌楸的幼葉為材料，按照NORGEN試劑盒OVorpy? 的操作步驟進(jìn)行 RNA的提取，所使用的試劑和耗材均經(jīng)過0. 1%DEPC水處理使其無 RNA酶。雜交鵝掌楸幼葉 總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，條帶完整清晰；用紫外分光光度法測定總RNA 的吸光值，OD26tZOD28tl值為2. 05, OD26tZOD23tl為2. 01，RNA完整性較好，純度高，可用于反轉(zhuǎn) 錄。
[0016] RNA提取的具體過程如下：1、取適量雜交鵝掌楸葉片，置于研缽中，加入600 μ L Lysis Solution,將樣品研磨充分。2、將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中。3、顛倒混勻，放置2min, 使其充分裂解，12000rpm離心2min,吸取上清移至新離心管中。4、加入等體積的70%乙醇， 潤旋混勻。5、將混合液移至離心柱中（下接2mL收集管)，12000rpm離心Imin,棄濾液，放回 收集管。6、加入400 μ L Wash Solution, 12000rpm離心Imin,棄濾液，放回收集管。7、加 入適量DNAase消化樣品中所含的DNA，HOOOrpm離心lmin，將濾液吸回柱子上，25°C -30°C 靜置15min。8、加入400 μ L Wash Solution, HOOOrpm離心lmin，棄濾液。9、第三次加入 400 μ L Wash Solution，HOOOrpm離心lmin，棄濾液。10、將離心柱放回收集管，HOOOrpm離 心2min，棄收集管。11、將離心柱置于心得1.5mL離心管中，加入50μ L Elution Solution 洗脫 RNA。12、200?2, OOOrpm 離心 2min，HOOOrpm 離心 lmin，體積不足 50 μ L，再用 HOOOrpm 離心Imin (可反復(fù)洗脫)。
[0017] (2)cDNA 的獲得 以所提RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,所使用的是Invitrogen公司的Superscript? III First-Strand Synthesis Kit。實(shí)驗(yàn)中的RNA使用量為1 μ g，具體步驟如下： 1、配置反應(yīng)液（1〇4 1^):14 1^1?隱（彡5 4 8)，14 1^?1^11161'(0118〇(11')，14 1^1〇1111 dNTP mix，DEPC-Treated Water up to 10 μ L。短暫低速離心，65°C，5min 后，立即置于冰 上]_~2min。
[0018] 2、向上一步的PCR管中按以下順序加入相應(yīng)試劑：2μ L 10XRT Buffer，4y L 25mM MgCl2,2yL 0.1M DTT，lyL RNase OUT (40U/yL)，lyL Superscript III RT。輕 柔混勻后，置于PCR儀上，反應(yīng)程序?yàn)?0°C 50min，85°C 5min。
[0019] 3、低速離心后，每管中加入1 μ L的RNase H，37 °C消化20min后，收集得 cDNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020] (3)同源克隆獲得目的基因 利用01ig〇7. 0設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR，從而獲得目的基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)化測序，最后進(jìn)行比對 分析。設(shè)計(jì)的引物序列如下： LhMKK2-F :5' -ATTTCGGACTTACAGTGCCACAAC-3' ； LhMKK2-R :5' -ACACTGCTCTTCCTCCATGTAACC-3'。
[0021] (I)PCR 擴(kuò)增體系： 依據(jù)說明書按下列組分配制PCR反應(yīng)液，50 μ L反應(yīng)體系：5 μ L 10XPCR Buffer，5 μ L 2mMdNTPs, 3 μ L 25mMMgS04,1. 5 μ L Forward Primer, I. 5 μ L Reverse Primer, IuL cDNA, I μ L KOD-Plus polymerase,32 μ L ddH20。
[0022] (2)PCR 反應(yīng)條件：94 °C，2min ;98 °C，10sec，55-60 °C，30sec，68 °C，lmin，36 cycles;4°C，F(xiàn)orever。
[0023] 雜交鵝掌楸基因全長PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖 2所示。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，獲得預(yù)期目的片段，使用AXYGEN公司 的DNA凝膠回收試劑盒，對目的片段進(jìn)行回收純化，步驟如下：1)在紫外燈下切下含有目的 DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計(jì)算凝膠重量(提前記錄I. 5mL離心 管重量)，該重量作為一個(gè)凝膠體積(如IOOmg=IOO μ L體積)。2)加入3個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75°C加熱(低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠于40°C加熱)，間斷混合(每2-3min)，直 至凝膠塊完全烙化(約6_8min)。3)加0.5個(gè)Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻； 當(dāng)分離的DNA片段小于400bp時(shí)，加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇。4)吸取3中的混合液，轉(zhuǎn) 移到DNA制備管(置于2mL離心管）中，12000Xg離心lmin。棄濾液。5)將制備管置回離 心管，加0.5 mL Buffer Wl，12000Xg離心30s，棄濾液。6)將制備管置回離心管，加0.7 mL Buffer W2，12000Xg離心30s，棄濾液。7)將制備管置于2mL離心管中，12000Xg離 心I min。8)將制備管置于潔凈的1.5mL離心管中，在DNA制備膜正中央加25-30 μ L水或 Eluent buffer，室溫靜置 lmin，12000 X g 離心 Imin 洗脫 DNA。
[0024] 目的片段加尾。KOD-PLUS高保真酶為平末端酶，所得PCR產(chǎn)物為平末端，需要先添 加 poly A尾才能進(jìn)行TA克隆，步驟如下：20 μ L體系：IOyL DNA，2 μ L 10XPCR Buffer， 0.4yL 10mMdNTPs，1.6yL 25mMMgCl2,0.2yL rTaq polymerase，5.8yL ddH20。反應(yīng)程 序：72°C，30min ;4°C, Forever。
[0025] 將目的基因片段與克隆載體pMD?19-T Vector (Takara D102A)，進(jìn)行連接反應(yīng)。 連接體系如下，在已滅菌烘干的PCR管中，依次加入下列溶液：4yL PCR純化產(chǎn)物（10ng)， 5μ L Solution Ι，1μ L pMD?19-T Vector。用移液器輕輕吸打混勻，低速離心，16°C連接過 夜。
[0026] 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109菌株中。具體步驟如下：實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備LB固體培養(yǎng) 基(添加 Amp+IPTG+X_gal)(每個(gè)培養(yǎng)基平板涂布 50mg/mL IPTG 和 20mg/mL X-gal 各 40uL， 室溫靜置備用）；（I)從-80°c超低溫冰箱取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化，IOOuL的感受態(tài) 細(xì)胞添加5uL的連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min ; (2) 42°C熱激90sec，立即置于冰上靜置 2min ;(3)加入800uLLB液體培養(yǎng)基(不添加 Amp抗生素)，37°C，180rpm震蕩培養(yǎng)l-2h ;4) 4000rpm離心3min，洗掉800uL上清，將剩余菌液吸打重懸；（5)取適量重懸液均勻涂布在 LB固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)12-16h。
[0027] 檢測重組質(zhì)粒，將得到的陽性克隆進(jìn)行測序分析。結(jié)果分析，基因編碼區(qū) 長度為1190bp，包含完整的開放閱讀框（0RF)，序列如SEQ ID NO. 1所示，所編碼的蛋白序 列如SEQ ID NO. 2所示，包括369個(gè)氨基酸。將測序所獲得的序列在NCBI中BLAST工具分 析，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，序列與擬南芥、毛白楊、番茄等的MAPKK家族基因同源性達(dá)到90%以上。
[0028] 實(shí)施例2 (1)基因功能分析 首先構(gòu)建雜交鵝掌楸35S 過表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株，通過花序浸泡 法轉(zhuǎn)化兩種野生型擬南芥哥倫比亞Col (Columbia)和蘭茨伯格Ler (Landsberg),獲得過 表達(dá)基因的陽性轉(zhuǎn)基因植株，并對T2代陽性植株進(jìn)行脅迫處理，研究分析雜交鵝掌 楸ZAiTU的功能。
[0029] (2)載體的構(gòu)建 本發(fā)明所用大腸桿菌菌株為E. coli JM109 (寶生物工程(大連）有限公司購入）;表達(dá) 載體為 pBI121 (Biovector Co. ,LTD 公司購入）。
[0030] 具體過程如下： 1.通過PCR在基因片段上下游分別添加 Xba I和Sac I雙酶切位點(diǎn)，PCR體系 及反應(yīng)條件同全長擴(kuò)增，所用引物如下： LhMKK2+Xba I-F :5' -TCTAGAATTTCGGACTTACAGTGCCACAAC-3' ； LhMKK2+ Sac I-R:5'-GAGCTCACACTGCTCTTCCTCCATGTAACC-3'。
[0031] 2.重組質(zhì)粒經(jīng)測序正確后與載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。使用Xba I和Sac I限制 性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得到含有黏性末端的并覆蓋整個(gè)ORF的基因片段。用同 樣的酶切反應(yīng)處理空的PBI121表達(dá)載體。
[0032] 雙酶切反應(yīng)體系（20 μ L) :lug 回收產(chǎn)物，2 μ L IOXM buffer，1 μ L Xba I，1 μ L Sac LddH2O up to 20uL〇
[0033] 輕輕吸打混勻，37°C水浴，雙酶切反應(yīng)4h，加入IOX終止緩沖液終止酶切反應(yīng)。
[0034] 將雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離檢測，雙酶切結(jié)果如圖3,圖4所示， 根據(jù)條帶大小判斷出基因和pBI121表達(dá)載體已經(jīng)被正確切開。
[0035] 將目的基因片段，空表達(dá)載體PBI121的雙酶切產(chǎn)物，使用AxyPr印DNA Gel Extraction Kit (AXYGEN)凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，溶于20 μ L的TE緩沖液中。
[0036] 3.檢測所回收的酶切產(chǎn)物濃度和純度，按連接體系加入各試劑（目的片段分子數(shù)： 載體分子數(shù)=3?5:1)，16°C水浴連接過夜。20uL連接反應(yīng)體系如下：2yL T4 DNA Iigase buffer (10X)，lyL pBI121，4yL 目的片段，IyL T4 DNA ligase，12yL ddH20。
[0037] 4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109超級感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng) 基中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D_值為0. 55-0. 6 ;使用全長引物進(jìn)行菌液PCR，以篩選陽性克隆， 之后用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (AXYGEN)提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。同時(shí)將陽性 克隆進(jìn)行測序，檢測載體構(gòu)建過程中是否發(fā)生堿基突變或者缺失現(xiàn)象。構(gòu)建過表達(dá)載體如 圖5所示，包含啟動子，目的基因，終止子的長度及位置。
[0038] (2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 選用材料分別為雜交鵝掌楸不同部位材料，及雜交鵝掌楸基因型體胚發(fā)育不 同時(shí)期材料，包含完整的體細(xì)胞胚胎發(fā)育各時(shí)期材料，對^^遞--基因進(jìn)行RT-PCR，分析其 在不同組織部為和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異情況。具體過程如下： 實(shí)時(shí)定量PCR采用 ABI 公司的 Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，在 ABI 7500 Real time PCR Systems (Applied Biosystems)上完成，每個(gè)樣品反應(yīng)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)采用 7500 System SDS software (Applied Biosystems)提取分析。
[0039] I) RT-PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)RT-PCR的要求，設(shè)計(jì)了 基因的引物，經(jīng)過溶解曲線的分析，最終選擇雜交 鵝掌楸中的18S rRNA作為內(nèi)參，引物如下： 18SrRNA-F :5' -ATTTCTGCCCTATCAACTTTCG-3' ； 18SrRNA-R:5' -TTGTTATTTATTGTCACTACCTCCC-3' ； LhMKK2-F (qPCR) :5, -GCTTTCCTTATTCACCGCCTG-3,； LhMKK2-R (qPCR) :5' -TGTGCTGCCTTTCTATCCTTCG-3'。
[0040] 2) RT-PCR 反應(yīng)體系（20μ L) :10μ L 2 X Power SYBR Green PCR Master Mix， I μ L Forward Primer,I μ L Reverse Primer,I μ L cDNA,7 μ L ddH20〇
[0041] 3) qRT-PCR 反應(yīng)條件：95°C，IOmin ;95°C，15sec，6(TC，lmin，40 Cycles。
[0042] 4)試驗(yàn)材料 雜交鵝掌楸不同部位材料。分別為雜交鵝掌楸實(shí)生苗的雄蕊，根，莖，葉，芽，花苞，花 瓣，雌蕊。雜交鵝掌楸不同發(fā)育時(shí)期材料。以雜交鵝掌楸2X5--^基因型為原始材料，誘導(dǎo) 獲得的體細(xì)胞胚胎發(fā)育不同時(shí)期的同步化材料。包括：胚性愈傷組織，液體懸浮細(xì)胞，液體 懸浮系調(diào)整期細(xì)胞，球形胚，魚雷胚，早期子葉胚，成熟子葉胚七個(gè)時(shí)期。
[0043] 5)試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因在雜交鵝掌楸不同部位根，莖，葉，芽，花， 花瓣，雄蕊，雌蕊中均有表達(dá)，無組織特異性(如圖6所示）基因在雜交鵝掌楸體細(xì) 胞胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量有較大差異，在胚性愈傷組織中的表達(dá)量最高，在球形胚和 魚雷胚時(shí)期均不表達(dá)，在成熟子葉胚中的表達(dá)量均較低(如圖7所示)。
[0044] (3)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 1.本發(fā)明使用的農(nóng)桿菌菌株為GV3101 (Biovector Co.，LTD公司購入)，采用液氮凍 融法將構(gòu)建好的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。具體過程如下：1)冰浴融化農(nóng)桿菌感受 態(tài)細(xì)胞，每管加入l_5uL (IOOng)回收純化的重組質(zhì)粒,輕輕吸打混勻，置于冰上,靜置冰浴 30min。2)液氮速凍lmin，37°C熱擊l_5min，迅速置于冰上l-2min。3)加入800ul無抗生 素的LB液體培養(yǎng)基，28°C，lOOrpm，慢速振蕩培養(yǎng)2-4h。4)4000rpm離心3min，吸去部分上 清。5)留取適量菌液，輕輕混勻，涂布于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB固體培養(yǎng)基 上。6)28°C倒置培養(yǎng)30-48h，至長出單菌落。7)菌液PCR檢測陽性克隆，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0045] 2.待種植的擬南芥生長至開花，維持其健康狀態(tài)。將PCR檢測過的陽性克隆，搖 菌至OD 6c?為0. 6-0. 8時(shí)，采用花序浸泡法將目的基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中。具體過程如下： 1)將菌液5000 rpm，5 min離心，收集菌體，用含有5%蔗糖的1/2MS溶液懸??；2)在浸泡 前，加入濃度為〇. 05%的SilwetL-77,晃出泡沫；3)將擬南芥的地上部分在農(nóng)桿菌懸浮溶液 中浸泡15~30 sec，期間輕輕晃動；4)將浸泡過的擬南芥平放至托盤上，用保鮮膜覆蓋保濕， 錫箔紙密封避光24h ;5)取下保鮮膜，正常條件下培養(yǎng)至種子成熟，成熟后停止?jié)菜?br> [0046] (5)轉(zhuǎn)基因植株表型觀察 1.收獲干燥的種子，將Tl代種子用添加 50mg/L卡納霉素的1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，發(fā) 現(xiàn)陽性植株仍然正常生長，其它無卡納霉素抗性的植株已經(jīng)死亡。
[0047] 2.將篩選出的可能的轉(zhuǎn)基因陽性植株移栽至營養(yǎng)土中，正常培養(yǎng)。選取轉(zhuǎn)基因陽 性植株，取適量幼嫩葉片，提取DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測，確定其為陽性植株。T2代陽性 植株檢測方法與之相同。檢測結(jié)果如圖8所示，顯示陰性對照無條帶，轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR目的 條帶與陽性對照一致，確定為陽性植株。
[0048] 3.過表達(dá)基因的Tl代轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)野生型Ler背景下 的轉(zhuǎn)基因植株，與野生型Ler對照比較，出現(xiàn)植株生長緩慢，莢果短小，敗育的表型特征。轉(zhuǎn) 野生型Col背景下的轉(zhuǎn)基因植株，與野生型Col對照比較，出現(xiàn)植株生長緩慢，葉片卷曲的 表型特征。結(jié)果如圖9,10所不。
[0049] 4.過表達(dá)基因的T2代轉(zhuǎn)基因植株的統(tǒng)計(jì)分析。分別統(tǒng)計(jì)主枝數(shù)目，側(cè)枝 數(shù)目，葉片數(shù)目等，計(jì)算平均值，轉(zhuǎn)基因植株前期因抗生素影響比野生型擬南芥生長慢，等 移栽至營養(yǎng)土里生長一周后，開始快速長大，觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的主枝，蓮座葉分枝數(shù)和 莖生葉分枝數(shù)均多于野生型，葉片數(shù)目也多于野生型擬南芥。如表1，圖11所示。
[0050] 表1.轉(zhuǎn)基因植株生長兩周的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種雜交鵝掌楸^^遞--基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸基因在雜交鵝掌楸抗逆性分子育種中的應(yīng)用。
4. 含有權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸基因的載體或宿主細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/84GK104293808SQ201410587281
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】施季森, 趙芳芳, 陳金慧, 王鵬凱, 郝兆東, 閆珊, 施帥男, 孟巖, 陸葉 申請人:南京林業(yè)大學(xué)