區(qū)分華支睪吸蟲囊蚴和東方次睪吸蟲囊蚴的pcr-rflp方法
【專利摘要】區(qū)分華支睪吸蟲囊蚴和東方次睪吸蟲囊蚴的PCR-RFLP方法，涉及一種利用PCR-RFLP的技術鑒別華支睪吸蟲囊蚴和東方次睪吸蟲囊蚴的分子方法，該方法使用相同引物進行PCR擴增，華支睪吸蟲囊蚴和東方次睪吸蟲囊蚴均可以擴增出長度約為1200bp的核糖體轉(zhuǎn)錄區(qū)間隔子序列（ITS）。該PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶 Xho I進行酶切，電泳圖出現(xiàn)兩條條帶的為華支睪吸蟲囊蚴，有一條條帶的為東方次睪吸蟲囊蚴。因此可根據(jù)PCR產(chǎn)物酶切后有無條帶的變化實現(xiàn)準確快速鑒別。本發(fā)明鑒別方法簡單，效率和準確率較高；本方法鑒別快速僅需1個工作日即可；同時成本較低。
【專利說明】區(qū)分華支睪吸蟲囊蚴和東方次睪吸蟲囊蚴的PCR-RFLP方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用PCR-RFLP的技術鑒別華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的分子方法，特別是涉及一種區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法。

【背景技術】
[0002]華支睪吸蟲病是一種非常重要的人獸共患寄生蟲病，呈水系流域分布。華支睪吸蟲在發(fā)育過程中需要兩個中間宿主，第一中間宿主為淡水螺，第二中間宿主是淡水魚蝦，國內(nèi)已證實的淡水魚宿主約有140種，以鯉科魚類為主。華支睪吸蟲成蟲寄生于犬貓和人的肝膽管引起華支睪吸蟲病。華支睪吸蟲病主要引起膽管炎、膽囊炎、膽管肝炎和肝硬化等，甚至可并發(fā)人的膽管上皮癌，極少數(shù)患者可致侏儒癥，是當前我國最嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病之一，嚴重影響人體健康。根據(jù)調(diào)查，全國約有1249萬人感染華支睪吸蟲，該病是2006-2015年全國重點防治寄生蟲病規(guī)劃中的病種之一；而東方次睪吸蟲和華支睪吸蟲的生活史相似，但東方次睪吸蟲主要感染禽類，僅實驗條件下有感染人的報道。人類主要通過生食或半生食含有這兩種吸蟲囊蝴的淡水魚感染吸蟲，東方次睪吸蟲的流行區(qū)域往往與華支睪吸蟲的流行區(qū)域重疊，因此建立一種快速簡便的鑒別這兩種囊蝴的方法在公共衛(wèi)生方面具有重要意義。
[0003]目前鑒別華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲囊蝴的方法主要有顯微鏡觀察和動物感染實驗等傳統(tǒng)方法。顯微鏡觀察需要操作人員具有豐富的形態(tài)學鑒別經(jīng)驗，而且在實際操作中可容易引起誤判。而動物感染實驗則有周期長、操作麻煩等缺點，不適合基層或現(xiàn)場快速檢測。因此急需一種操作簡單可以快速完成的鑒別方法。DNA多態(tài)性已成為人們用于研究動物群體遺傳學的最有效的工具，不僅能夠準確地反映DNA水平的變化，全面、精確地分析種群的遺傳變異，而且還可以進行種群親緣關系分析和計算種群間的遺傳距離等。核糖體轉(zhuǎn)錄區(qū)間隔子序列(ITS)既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的保守性，在種間的變異率比在種內(nèi)的低，具有種的特異性，種內(nèi)高度保守，在不同種間又有不同程度的變異，是鑒別種間遺傳變異的理想分子標記。而且位于ITS兩側的編碼區(qū)便于設計通用引物。因此，本研究擬應用核糖體序列分析來源于不同宿主和地域的華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲囊蝴的多態(tài)性，并依據(jù)核糖體序列多態(tài)性分析的結果建立適用于鑒別華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲的PCR-RFLP方法。
[0004]目前國內(nèi)外尚無有關利用PCR-RFLP方法區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法，該方法利用通01限制性內(nèi)切酶進行兩種吸蟲囊蝴的核糖體酶切鑒別，可準確區(qū)分兩種形態(tài)相似的吸蟲囊蝴，鑒別方法簡單，效率和準確率較高。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法，所述方法包括以下步驟:
(1)提取華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴核糖體基因組DNA；
(2)用上游引物Pl和下游引物P2同時對華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴進行PCR擴增，得到相應的ITS序列片段；上游引物Pl和下游引物P2的序列分別為:
上游引物 Pl:5，-GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA -3，；
下游引物 P2:5’ -TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3’ ；
(3)取PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)通οI酶切后進行RFLP分析，可被酶切的為華支睪吸蟲囊蝴，不可被酶切的為東方次睪吸蟲囊蝴。
[0007]所述的區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法，所述步驟(2)兩種囊蝴PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收為1200bp。
[0008]所述的區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法，所述步驟(3)中的RFLP分析具體為OXoI酶切位點位于華支睪吸蟲囊蝴核糖體序列的470位，華支睪吸蟲囊蝴可被通ο I酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測片段為兩段，大小為470bp和653bp ;東方次睪吸蟲囊蝴的核糖體序列中沒有ZAo I酶切位點，東方次睪吸蟲囊蝴經(jīng)ZAo I酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小不變。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點與效果是:
1.本發(fā)明利用通01限制性內(nèi)切酶進行兩種吸蟲囊蝴的核糖體酶切鑒別，可準確區(qū)分兩種形態(tài)相似的吸蟲囊蝴。
[0010]2.本發(fā)明通過對不同地區(qū)、不同寄主的華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴酶切分析，表明同種之間不同個體可保持很高的穩(wěn)定性。
[0011]3.本發(fā)明鑒別方法簡單，效率和準確率較高；本方法鑒別快速僅需I個工作日即可；同時成本較低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1兩種吸蟲囊蝴分別進行ITS基因PCR反應得到約1200bp電泳圖；
圖2兩種吸蟲囊蝴經(jīng)通ο I內(nèi)切酶酶切分析結果圖。

【具體實施方式】
[0013]下面結合附圖所示實施例，對本發(fā)明作進一步詳述。
[0014]本發(fā)明利用吸蟲囊蝴(華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴)核糖體區(qū)域基因序列的位點差異區(qū)別華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法。該方法能有效區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴，為區(qū)分兩種囊蝴提供技術保證。根據(jù)華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴核糖體序列的基因特征，設計出一組引物能同時對華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴進行陽性擴增，根據(jù)華支睪吸蟲囊蝴擴增PCR產(chǎn)物中有特異性的ZAoI酶切位點，而東方次睪吸蟲囊蝴擴增PCR產(chǎn)物中沒有ZAoI酶切位點來建立一種對華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴進行快速檢測得PCR-RLFP方法。
[0015]區(qū)別華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法，包括步驟:
I提取華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴核糖體基因組DNA ； 2用引物Pl和P2同時對華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴進行PCR擴增，得到相應的核糖體基因片段；
3取PCR產(chǎn)物經(jīng)通ο I酶切后進行RFLP分析。
[0016]其中，PCR需滿足如下要求:
(1)該PCR產(chǎn)物需選擇華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴核糖體序列中保守區(qū)域進行設計，便能以一個PCR反應對華支睪吸蟲囊蝴DNA和東方次睪吸蟲囊蝴DNA進行陽性擴增；
(2)該PCR產(chǎn)物需選擇華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴核糖體基因組中保守區(qū)域進行設計時必須跨過華支睪吸蟲囊蝴基因中的470位的ZAoI酶切位點，以便對膠回收產(chǎn)物能夠進行限制性片段長度多態(tài)性分析。
[0017]根據(jù)以上要求，步驟(2)的擴增引物Pl和我P2的序列為:
上游引物 Pl:5，-GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA -3，；
下游引物 P2:5’ -TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3’ ；
其中，步驟2的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收小大約為1200bp。
[0018]其中，步驟3的ZAoI酶切位點位于華支睪吸蟲囊蝴核糖體基因組序列的470位，東方次睪吸蟲囊蝴核糖體基因組序列中沒有通Ol酶切位點，東方次睪吸蟲囊蝴經(jīng)ZAoI酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小不變。
[0019]實施例1:
圖1兩種吸蟲囊蝴分別進行ITS基因PCR反應得到約1200bp電泳圖；
其中:左1、2、3為肇東東方次睪吸蟲囊蝴(麥穗)，左4、5、6為肇東東方次睪吸蟲囊蝴(柳根)；右1、2、3為肇東華支睪吸蟲囊蝴(麥穗)，右4、5、6為肇東華支睪吸蟲囊蝴(柳根)。
[0020]圖2兩種吸蟲囊蝴經(jīng)通OI內(nèi)切酶酶切分析結果圖；
其中:左1、2、3為肇東東方次睪吸蟲囊蝴(麥穗)，左4、5、6為肇東東方次睪吸蟲囊蝴(柳根)；右1、2、3為肇東華支睪吸蟲囊蝴(麥穗)，右4、5、6為肇東華支睪吸蟲囊蝴(柳根)。
[0021]樣本來源:華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴均采自于黑龍江省肇東、齊齊哈爾等地淡水魚體內(nèi)。均由黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院寄生蟲實驗室分離鑒別和保存。
[0022]引物設計與合成:
根據(jù)華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的核糖體的ITS序列設計引物Pl和P2，其中引物Pl和P2序列為:上游引物:5，-GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA _3’，下游引物5’-TATGCT TAA ATT CAG CGG GT -3，。
[0023]PCR 擴增:
以常規(guī)方法提取華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴核糖體基因組DNA。用所設計的引物Pl和P2進行PCR擴增，擴增片段大小約為1200bp。擴增體系為25uL，其中1XExTaq buffer 2.5μ?, dNTP Mixture (2.5mmol each) 2μ?，上、下游引物(25mM)各 0.5μ?，模板 DNA ?μ?,Εχ Taq (5U/^L) 0.2μ?，加水至 25μ?。94°C預變性 5min，94°C變性 lmin，55°C退火Imin，72°C延伸1.5min,共35個循環(huán),72°C延伸10min,4°C保存。
[0024]RFLP 分析:
PCR反應結束后，將華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴PCR產(chǎn)物分別經(jīng)膠回收試劑盒純化后進行通O I酶切。酶切體系為20uL，其中通O I ?μ?，PCR產(chǎn)物15μ?，Buffer Tango2PL，補充去離子水至終提及20uL。混勻后，經(jīng)37°C水浴3小時，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，對檢測樣品進行分析華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴類型。Xho I酶切位點位于華支睪吸蟲囊蝴核糖體基因組序列的470位，華支睪吸蟲囊蝴可被ZA0 I酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測片段為2段，大小為470bp和653bp ;而東方次睪吸蟲囊蝴核糖體基因組序列中沒有通ο I酶切位點，東方次睪吸蟲囊蝴經(jīng)Xho I酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小不變。
[0025]準確性分析:
為了驗證結果的準確性，選取了華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴多個不同地點的宿主進行重復試驗，驗證結果都一致。
[0026]臨床應用:
PCR-RFLP方法結果準確、操作簡便，同時對實驗設備要求也較低，只需單個囊蝴提取基因組DNA，當天就可以出結果，實現(xiàn)對華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴快速準確的鑒另O。本發(fā)明利用PCR-RFLP方法可以快速、準確地區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴。
【權利要求】
1.區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)提取華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴核糖體基因組DNA； (2)用上游引物P1和下游引物P2同時對華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴進行PCR擴增，得到相應的ITS序列片段；上游引物P1和下游引物P2的序列分別為: 上游引物 P1:5，-GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA -3，； 下游引物 P2:5’ -TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT -3’ ； (3)取PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)通οI酶切后進行RFLP分析，可被酶切的為華支睪吸蟲囊蝴，不可被酶切的為東方次睪吸蟲囊蝴。
2.根據(jù)權利要求1所述的區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述步驟(2)兩種囊蝴PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收為1200bp。
3.根據(jù)權利要求1所述的區(qū)分華支睪吸蟲囊蝴和東方次睪吸蟲囊蝴的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述步驟(3)中的RFLP分析具體為ΟΧοΙ酶切位點位于華支睪吸蟲囊蝴核糖體序列的470位，華支睪吸蟲囊蝴可被通0 I酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測片段為兩段，大小為470bp和653bp ;東方次睪吸蟲囊蝴的核糖體序列中沒有ZAo I酶切位點，東方次睪吸蟲囊蝴經(jīng)通0 I酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小不變。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372084SQ201410607291
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權日:2014年11月3日
【發(fā)明者】仇建華, 陳媛媛, 高俊峰, 張瑩, 于劍, 邵志輝, 李超, 叢艷昭, 齊楷, 陳瑛琦, 王春仁 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學